本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種高信噪比多探針PCR Taqman探針及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

熒光定量PCR是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程的定量實(shí)驗(yàn)技術(shù)。多探針熒光定量PCR是在同一PCR反應(yīng)體系含有針對(duì)多個(gè)特異的靶序列的多對(duì)探針進(jìn)行PCR反應(yīng)和熒光檢測(cè)。

目前熒光定量PCR采用最多的探針為Taqman探針，該探針為一寡核苷酸，探針的5'端修飾一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)，3'端修飾一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；剛開始時(shí)，探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'端→3'端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

但是由于Taqman探針的長(zhǎng)度一般在18～45nt之間，因此淬滅基團(tuán)無法完全的吸收?qǐng)?bào)告基團(tuán)的熒光，所以在熒光定量PCR的過程中存在一定的背景噪音。而在多重?zé)晒舛縋CR過程中，一個(gè)通道中探針個(gè)數(shù)會(huì)增加到10個(gè)甚至更多，這樣會(huì)導(dǎo)致背景噪音的疊加，從而降低了熒光信號(hào)的信噪比，導(dǎo)致多重?zé)晒舛縋CR在同一熒光通道探針較多的情況時(shí)出現(xiàn)靈敏度降低等檢測(cè)困難的現(xiàn)象。

中國(guó)發(fā)明專利CN200710122376.X公開了一種熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針及其應(yīng)用。該發(fā)明的探針一改傳統(tǒng)Taqman探針中把熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分別放在探針兩端的設(shè)計(jì)方法，把熒光淬滅基團(tuán)設(shè)計(jì)在探針的中部，同時(shí)在熒光淬滅基團(tuán)兩端各修飾一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)，該發(fā)明的探針一分子探針被水解時(shí)可以釋放兩分子熒光，可以增強(qiáng)熒光信號(hào)強(qiáng)度，提高檢測(cè)的靈敏度，但是其成本也加倍，并且背景噪音沒有減弱，甚至?xí)鼜?qiáng)，因此開發(fā)一種高信噪比的多重?zé)晒舛縋CR Taqman探針對(duì)于提高多重?zé)晒舛縋CR的靈敏度是十分必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種多探針PCR Taqman探針，其能夠有效降低Taqman探針PCR尤其是多Taqman探針PCR的背景噪音，提高檢測(cè)的靈敏度。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種熒光定量PCR Taqman探針，其為標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的一段寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列至少包括一堿基T，所述淬滅基團(tuán)標(biāo)記在所述堿基T上，以確保淬滅基團(tuán)標(biāo)記的穩(wěn)定性，保證淬滅效果，所述熒光基團(tuán)標(biāo)記在淬滅基團(tuán)的上游堿基上，并且與所述淬滅基團(tuán)距離8～25nt(nt為單鏈核苷酸)，使淬滅基團(tuán)可最大程度上吸收熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光，降低熒光定量PCR背景，但熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的標(biāo)記的距離也不能過近，當(dāng)熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間的距離小于8nt時(shí)，探針上熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)標(biāo)記的位置越近，熒光基團(tuán)被水解釋放后發(fā)射的熒光信號(hào)強(qiáng)度越低，影響結(jié)果檢測(cè)的靈敏度。

優(yōu)選的是，其中，所述寡核苷酸序列的長(zhǎng)度為18～45nt(nt為單鏈核苷酸)，既保證探針與模板結(jié)合效率，又保證淬滅基團(tuán)的淬滅效果。

優(yōu)選的是，其中，所述熒光基團(tuán)選自標(biāo)記穩(wěn)定且其發(fā)射熒光較易被淬滅的FAM(6-羧基熒光素)、ROX(5-羧基-X-羅丹明)、JOE(2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基熒光素)、CY3(3H-吲哚菁)、CY5(5H-吲哚菁)、TAMRA(6-羧基四甲基羅丹明)、VIC、NED中的任意一種。

優(yōu)選的是，其中，所述淬滅基團(tuán)為本身不會(huì)發(fā)射熒光的BHQ或QSY，在多探針PCR檢測(cè)中，若淬滅基團(tuán)本身也可發(fā)生熒光，易產(chǎn)生熒光交叉干擾，增加背景干擾。

優(yōu)選的是，其中，所述寡核苷酸序列的3’端使用磷酸基團(tuán)、氨基或封閉堿基予以封閉，防止探針在PCR擴(kuò)增過程中被延伸。

優(yōu)選的是，其中，當(dāng)所述寡核苷酸序列的5’端為堿基G時(shí)，所述熒光基團(tuán)標(biāo)記于5’端以外的位置，因?yàn)?’端的堿基G有淬滅效果，且即使探針被水解成單個(gè)堿基，與熒光基團(tuán)相連的G堿基仍可淬滅基團(tuán)的熒光信號(hào)，干擾對(duì)結(jié)果的判斷。

優(yōu)選的是，其中，在多探針熒光定量PCR反應(yīng)體系中所述Taqman探針加入的濃度為0.0001～10μmol/L。

優(yōu)選的是，其中，多探針熒光定量PCR反應(yīng)體系的多個(gè)探針中至少有一個(gè)所述Taqman探針，以保證背景噪音的降低，提高檢測(cè)靈敏度。

本發(fā)明熒光定量PCR Taqman探針可廣泛應(yīng)用于各種使用探針的領(lǐng)域，尤其適用于一個(gè)通道存在多個(gè)探針的核酸PCR檢測(cè)領(lǐng)域，尤其適用于廣譜人乳頭瘤病毒(HPV)核酸的一管檢測(cè)。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

1.本發(fā)明通過改變并縮短熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的標(biāo)記位置，并將淬滅基團(tuán)標(biāo)記在探針寡核苷酸序列的堿基T上，可明顯增強(qiáng)淬滅基團(tuán)對(duì)熒光基團(tuán)的抑制效率，降低背景噪音。

2.當(dāng)本發(fā)明應(yīng)用于多探針PCR時(shí)，可顯著降低背景疊加噪音，擴(kuò)大熒光信號(hào)區(qū)間，提高信噪比和檢測(cè)的靈敏度，從而提高了數(shù)據(jù)的重復(fù)性，可進(jìn)一步促進(jìn)多探針PCR技術(shù)的發(fā)展，提高檢測(cè)效率，降低反應(yīng)成本。

本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中在FAM通道下分別使用不同濃度的普通探針和特殊探針進(jìn)行多探針PCR檢測(cè)的背景噪音對(duì)比圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中分別使用特殊探針與普通探針進(jìn)行多探針PCR檢測(cè)的熒光信號(hào)區(qū)間的對(duì)比圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中在FAM通道下分別使用普通探針組和特殊探針組進(jìn)行多探針PCR檢測(cè)的背景疊加噪音對(duì)比圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中分別采用特殊探針組和普通探針組對(duì)9個(gè)HPV亞型同時(shí)檢測(cè)的對(duì)比圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中在ROX通道下分別使用普通探針組和特殊探針組進(jìn)行多探針PCR檢測(cè)的背景疊加噪音對(duì)比圖

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語并不配出一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。

為了更好了區(qū)分本發(fā)明的高信噪比多探針PCR Taqman探針與普通Taqman探針，我們將使用了本發(fā)明的高信噪比多探針PCR Taqman探針命名為“特殊探針”組，未使用的命名為“普通探針”組。

實(shí)施例1特殊探針與普通探針PCR檢測(cè)的背景噪音對(duì)比

針對(duì)同一HPV45型加入同等梯度濃度普通探針和特殊探針，探尋同等濃度下普通探針和特殊探針的背景信號(hào)強(qiáng)度和背景信號(hào)強(qiáng)度隨濃度變化趨勢(shì)，其中，

普通探針：FAM-5'-caagaaagacttcgcagacgtagggaacac-3'-BHQ；

特殊探針：5'-caagaaaga(FAM)cttcgcagacgt(BHQ)agggaacac-3'；

本實(shí)施例1特殊探針中，淬滅基團(tuán)BHQ標(biāo)記在堿基T上，熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記在淬滅基團(tuán)上游的堿基A上，并且距離淬滅基團(tuán)BHQ 12nt。

參照?qǐng)D1，在同等濃度下特殊探針的背景噪音明顯低于普通探針，隨著探針濃度增加普通探針的背景噪音快速上升且很快達(dá)到平臺(tái)期，而使用特殊探針組和特殊對(duì)比探針組的背景噪音隨探針濃度增加變化趨勢(shì)緩慢，且距離平臺(tái)期仍有較大間距。

在本實(shí)施例中，若采用淬滅基團(tuán)QSY代替淬滅基團(tuán)BHQ標(biāo)記在堿基T上，熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記在淬滅基團(tuán)上游的堿基A上，并且距離淬滅基團(tuán)BHQ12nt，其效果圖與圖1基本一致，使用特殊探針組的背景噪音隨探針濃度增加變化趨勢(shì)緩慢，且距離平臺(tái)期仍有較大間距。

在本實(shí)施例中，淬滅基團(tuán)BHQ標(biāo)記在堿基T上，采用熒光基團(tuán)VIC或NED代替熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記在淬滅基團(tuán)上游的堿基A上，并且距離淬滅基團(tuán)BHQ 12nt，其效果圖與圖1基本一致，使用特殊探針組的背景噪音隨探針濃度增加變化趨勢(shì)緩慢，且距離平臺(tái)期仍有較大間距。

實(shí)施例2特殊探針與普通探針PCR檢測(cè)信號(hào)區(qū)間對(duì)比

針對(duì)于同一HPV亞型加入同等濃度的特殊探針和普通探針，分別進(jìn)行同等循環(huán)數(shù)的熒光定量PCR，對(duì)比PCR開始時(shí)的信號(hào)到PCR結(jié)束時(shí)的信號(hào)區(qū)間，其中針對(duì)同一HPV58型(亞型1)分別加入：

普通探針：FAM-5'-tttcaattcgatttcatgcac-3'-BHQ；

特殊探針：5'-tt(FAM)tcaattcgat(BHQ)ttcatgcac-3'；

針對(duì)同一HPV33型(亞型2)分別加入：

普通探針：TAMRA-5'-actatacacaacattgaactacagtgcgtggaatgc-3'-BHQ；

特殊探針1：5'-actatacacaacattg(TAMRA)aactacagtgcgtggaat(BHQ)gc-3'；

本實(shí)施例2的兩特殊探針中，淬滅基團(tuán)BHQ均標(biāo)記在堿基T上，針對(duì)HPV58型特殊探針中的熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記在淬滅基團(tuán)上游的堿基T上，且距離淬滅基團(tuán)BHQ 10nt，針對(duì)HPV33型特殊探針1中的熒光基團(tuán)TAMRA標(biāo)記在淬滅基團(tuán)上游的堿基G上，并且距離淬滅基團(tuán)BHQ 18nt。

參照?qǐng)D2，可以看到兩組實(shí)驗(yàn)中，特殊探針熒光信號(hào)區(qū)間都明顯大于普通探針，因此采用本發(fā)明特殊探針進(jìn)行熒光定量時(shí)可以有更寬的區(qū)間進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，從而提高了信號(hào)的靈敏度。

在本實(shí)施例中，淬滅基團(tuán)BHQ均標(biāo)記在堿基T上，針對(duì)HPV58型特殊探針中采用熒光集團(tuán)JOE代替熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記在淬滅基團(tuán)上游的堿基T上，且距離淬滅基團(tuán)BHQ 10nt，可以達(dá)到幾乎一致的優(yōu)異效果，特殊探針熒光信號(hào)區(qū)間都明顯大于普通探針。

針對(duì)HPV33型特殊探針1中采用熒光集團(tuán)CY3代替熒光基團(tuán)TAMRA標(biāo)記在淬滅基團(tuán)上游的堿基G上，并且距離淬滅基團(tuán)BHQ 18nt，可以達(dá)到幾乎一致的效果，特殊探針熒光信號(hào)區(qū)間都明顯大于普通探針。

實(shí)施例3特殊探針在多探針PCR中的效果

在FAM通道中同時(shí)檢測(cè)HPV31、33、39、45、51、52、56、58、66共9個(gè)HPV亞型，分別使用特殊探針組和普通探針組進(jìn)行檢測(cè)，其中特殊探針組中的HPV31、33、45和52四個(gè)亞型采用本發(fā)明特殊探針而其余使用普通探針進(jìn)行檢測(cè)，其中，HPV31、33、45和52分別對(duì)應(yīng)的特殊探針為：

HPV31特殊探針：5'-catagtatt(FAM)ttgtgcaaacctacagacgccatgt(BHQ)-3'；

HPV33特殊探針：5'-actatacacaacattgaacta(FAM)cagtgcgt(BHQ)ggaatgc-3'；

HPV45特殊探針：5'-caagaa(FAM)agacttcgcagacgt(BHQ)agggaaacac-3'；

HPV52特殊探針：5'-aacacag(FAM)tgtagctaacgcacggccat(BHQ)gt-3'。

本實(shí)施例3的四個(gè)特殊探針的淬滅基團(tuán)BHQ均標(biāo)記在堿基T上，分別針對(duì)HPV31、HPV33、HPV45和HPV52型的特殊探針中，熒光基團(tuán)FAM分別標(biāo)記在淬滅基團(tuán)上游的堿基T、A、A和G上，并且分別距離淬滅基團(tuán)BHQ25、8、15和20nt。

參照?qǐng)D3，在特殊探針組中，其中9個(gè)亞型中的4個(gè)使用特殊探針后，檢測(cè)圖譜中整體的背景信號(hào)有明顯的降低，因此證明特殊探針可有效降低多探針PCR過程中的背景疊加噪音。

參照?qǐng)D4特殊探針組和普通探針組對(duì)9種亞型同時(shí)檢測(cè)的結(jié)果，可以看出特殊探針組的靈敏度明顯高于普通探針組，且數(shù)據(jù)之間的差異性更小。

實(shí)施例4特殊探針使用不同熒光標(biāo)記在多探針PCR中的效果

在ROX通道中同時(shí)檢測(cè)HPV31、33、45、52、56、66共6個(gè)HPV亞型，分別使用特殊探針組和普通探針組進(jìn)行檢測(cè)，其中特殊探針組中的HPV31、33、45和52四個(gè)亞型采用本發(fā)明特殊探針而其余使用普通探針進(jìn)行檢測(cè)，其中，HPV31、33、45和52分別對(duì)應(yīng)的特殊探針為：

HPV31特殊探針：5'-catagtatt(ROX)ttgtgcaaacctacagacgccatgt(BHQ)-3'；

HPV33特殊探針：5'-actatacacaacattgaacta(ROX)cagtgcgt(BHQ)ggaatgc-3'；

HPV45特殊探針：5'-caagaa(ROX)agacttcgcagacgt(BHQ)agggaaacac-3'；

HPV52特殊探針：5'-aacacag(ROX)tgtagctaacgcacggccat(BHQ)gt-3'。

本實(shí)施例4的四個(gè)特殊探針的淬滅基團(tuán)BHQ均標(biāo)記在堿基T上，分別針對(duì)HPV31、HPV33、HPV45和HPV52型的特殊探針中，熒光基團(tuán)ROX分別標(biāo)記在淬滅基團(tuán)上游的堿基T、A、A和G上，并且分別距離淬滅基團(tuán)BHQ25、8、15和20nt。

參照?qǐng)D5，在特殊探針組中，其中6個(gè)亞型中的4個(gè)使用特殊探針后，檢測(cè)ROX通道圖譜中整體的背景信號(hào)有明顯的降低，與FAM通道結(jié)果一致，因此證明特殊探針可有效降低多探針熒光定量PCR過程中的在不同熒光通道背景疊加噪音。

這里說明的設(shè)備數(shù)量和處理規(guī)模是用來簡(jiǎn)化本發(fā)明的說明。對(duì)本發(fā)明的一種高信噪比多探針PCR Taqman探針的應(yīng)用、修改和變化對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。

如上所述，本發(fā)明通過改變并縮短熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的標(biāo)記位置，并將淬滅基團(tuán)標(biāo)記在探針寡核苷酸序列的堿基T上，可顯著增強(qiáng)淬滅基團(tuán)對(duì)熒光基團(tuán)的抑制效率，降低背景噪音；同時(shí)降低成本。

當(dāng)本發(fā)明應(yīng)用于多探針PCR時(shí)，可明顯降低背景疊加噪音，擴(kuò)大信號(hào)區(qū)間，提高信噪比和檢測(cè)的靈敏度，從而提高了數(shù)據(jù)的重復(fù)性，可進(jìn)一步促進(jìn)多探針PCR的應(yīng)用，提高檢測(cè)效率，降低反應(yīng)成本。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用。它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域。對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改。因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。