本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速簡(jiǎn)易的基因多態(tài)性檢測(cè)方法及試劑盒和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多態(tài)性是指在一個(gè)生物群體中，同時(shí)和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型(genotype)或等位基因(allele)，亦稱遺傳多態(tài)性(genetic polymorphism)或基因多態(tài)性。人類遺傳基因多態(tài)性在闡明人體對(duì)疾病、毒物的易感性與耐受性、疾病臨床表現(xiàn)的多樣性以及對(duì)藥物治療的反應(yīng)性上都起著重要的作用。疾病基因多態(tài)性的研究不但可以揭示同一種疾病不同臨床表型的實(shí)質(zhì)，也是個(gè)體化治療的基礎(chǔ)。

目前用于檢測(cè)基因多態(tài)性的方法很多，主要有選擇性擴(kuò)增方法與選擇性檢測(cè)方法兩類，其中選擇性檢測(cè)方法主要以TaqManTM探針為代表，Taqman探針是一種經(jīng)典的定量PCR技術(shù)，現(xiàn)階段得到廣泛應(yīng)用，在PCR反應(yīng)體系中加入一對(duì)引物和一個(gè)特異性熒光探針，探針只與兩條引物之間特異性模板結(jié)合，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程。探針的5’端連接報(bào)告熒光，3’端連接淬滅熒光，隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則在PCR用引物延伸時(shí)，TaqDNA聚合酶5’到3’的外切酶活性會(huì)將探針序列上5’端的報(bào)告熒光切下，淬滅熒光不再能對(duì)報(bào)告熒光進(jìn)行抑制，使得報(bào)告熒光發(fā)光。針對(duì)突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)兩個(gè)不同熒光標(biāo)記突變探針、野生探針，根據(jù)突變探針、野生探針熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行SNP位點(diǎn)基因型判讀。該方法的缺點(diǎn)在于：首先該方法不存在選擇性擴(kuò)增機(jī)制，不同基因型結(jié)果差異不明顯，每次做qPCR檢測(cè)必須設(shè)置三個(gè)基因型對(duì)照，很難在單個(gè)樣品檢測(cè)的情況下進(jìn)行準(zhǔn)確精確基因分型。此外，由于突變型所占比例十分稀少，易導(dǎo)致信號(hào)淹沒(méi)在與待檢測(cè)目的序列突變型變異體相似的野生型變異體所產(chǎn)生的信號(hào)中，其選擇性沒(méi)有選擇性擴(kuò)增法的選擇性高。

因此，等位基因選擇性擴(kuò)增允許我們選擇性的擴(kuò)增并檢測(cè)目的核酸序列的基因多態(tài)性。在一個(gè)成功的選擇性擴(kuò)增系統(tǒng)中，只有目的核酸序列中的突變型變異體被擴(kuò)增，而目的核酸序列的野生型變異體不被擴(kuò)增、或者目的核酸序列的野生型變異體的擴(kuò)增效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于目的核酸序列中突變型變異體的擴(kuò)增效率。為了達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的，多種方法被開發(fā)出來(lái)，如下述的PCR夾子方法、RFLP-PCR方法、數(shù)字PCR方法、低變性溫度下共擴(kuò)增PCR方法、等位基因特異性PCR法(ARMS-PCR法)等。

1、PCR夾子方法(PCR clamping method)通過(guò)抑制目的核酸序列的野生型變異體的擴(kuò)增來(lái)達(dá)到選擇性擴(kuò)增待檢測(cè)目的片段的目的。使用肽核酸(PNA)或使用鎖核酸(LNA)的方法分別在文獻(xiàn)[Henrik et al.,Nucleic Acid Research 21:5332-5336(1993)]和[Luo et al.,Nucleic Acid Research Vol.34,No 2 e12(2006)]中公開。但是，與目的核酸序列的野生型變異體與突變型變異體通常只有一個(gè)堿基與待檢測(cè)目的片段不同，這種方法并不能完美的抑制住這些非目的片段的擴(kuò)增。

2、RFLP分析法：基于基因突變導(dǎo)致的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的改變，如位點(diǎn)丟失或產(chǎn)生新位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增某一特定片段，再利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，電泳觀察片段的大小，但絕大多數(shù)變異位點(diǎn)并不涉及酶切位點(diǎn)的改變，因此此方法不具備通用性，同樣由于操作步驟多而難以進(jìn)行高通量平行分析。

3、數(shù)字PCR(digital PCR)通過(guò)稀釋模板和增加PCR反應(yīng)的數(shù)目來(lái)檢測(cè)少量目的核酸序列突變型變異體[Vogelstein B,Kinzler KW.Digital PCR.ProcNatlAcad SciUSA1999；96:9236-41]。理論上，當(dāng)核酸模板稀釋到每個(gè)PCR反應(yīng)中僅有一個(gè)或沒(méi)有核酸模板時(shí)，這個(gè)PCR反應(yīng)中要么沒(méi)有擴(kuò)增，要么擴(kuò)增野生型模板或擴(kuò)增突變型模板。結(jié)合相應(yīng)的檢測(cè)方法即可以達(dá)到檢測(cè)少量突變型變異體的目的。理論上，該方法通過(guò)增加PCR反應(yīng)的數(shù)量選擇性是無(wú)限的。但是在實(shí)際操作中，選擇性不僅受限于Taq DNA聚合酶的保真性限制，也受限于同時(shí)能進(jìn)行的PCR數(shù)目。雖然有報(bào)道基于數(shù)字PCR的方法具有高選擇性，如[Bielas JH,Loeb LA.Quantification of random genomic mutations.Nat Methods 2005；2:285-90]所公開的內(nèi)容。但該法通常需要專門的儀器并借助芯片技術(shù)，過(guò)程非常繁瑣復(fù)雜，成本較高。

4、低變性溫度下共擴(kuò)增PCR(Coamplification at lower denaturation temperature PCR，Cold-PCR)是一種通過(guò)調(diào)節(jié)PCR反應(yīng)的熱循環(huán)條件來(lái)富集目的擴(kuò)增片段的方法。在低變形溫度下(Tc)，目的核酸序列的突變型變異體或者突變型變異體與野生型變異體形成的異源二聚體相較于野生型變異體更容易變性而被進(jìn)一步擴(kuò)增并富集。該方法能提供一定的選擇性，但是這種選擇性仍然是不夠的，如[Li J,Wang L,Mamon H,Kulke MH,Berbeco R,Makrigiorgos GM.Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing.Nat Med 2008；14:579–84]所公開的內(nèi)容。

5、ARMS-PCR法：ARMS-PCR(amplification refractory mutation system)又叫等位基因特異PCR，Taqman聚合酶缺少3’→5’外切酶活性，在一定條件下PCR產(chǎn)物3’末端的錯(cuò)配導(dǎo)致產(chǎn)物的急劇減少，針對(duì)不同的已知突變，分別設(shè)計(jì)突變引物、野生引物，2個(gè)引物主要是3’末端堿基不同。該方法的主要限制因素是：a)若突變的位點(diǎn)為弱錯(cuò)配堿基序列，ARMS引物不能有效區(qū)分目標(biāo)核酸序列的野生型變異體和突變型變異體，從而使該方法的選擇性受到影響，也會(huì)因此產(chǎn)生假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。b)ARMS-PCR只含有選擇性擴(kuò)增機(jī)制而不具備選擇性檢測(cè)，無(wú)法進(jìn)行基因型特異性檢測(cè)，因此當(dāng)選擇性擴(kuò)增出現(xiàn)錯(cuò)誤時(shí)會(huì)導(dǎo)致完全錯(cuò)誤的結(jié)論，即出現(xiàn)假陰性及假陽(yáng)性結(jié)果。c)ARMS-PCR引物設(shè)計(jì)必須涵蓋多態(tài)性位點(diǎn)區(qū)域，當(dāng)這些區(qū)域有特殊序列或結(jié)構(gòu)時(shí)，擴(kuò)增(效率、特異性、選擇性)會(huì)被影響。

以上所述方法都需對(duì)樣本進(jìn)行繁瑣的DNA提取、整個(gè)檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)。而在臨床上，一些急性疾病如急性冠脈綜合癥、冠脈支架術(shù)和冠心病的患者在發(fā)病時(shí)需要快速服藥，以免危及生命，由于不同個(gè)體對(duì)藥物的代謝能力不同，需要在給藥前進(jìn)行藥物代謝相關(guān)基因的檢測(cè)，這就需要在盡量短的時(shí)間內(nèi)得到測(cè)試結(jié)果。雖然現(xiàn)有的核酸提取方案很多，但是基因多態(tài)性的檢測(cè)對(duì)于核酸樣本的要求比較嚴(yán)格，核酸提取方案需要較為嚴(yán)格地適配采用的方法，否則會(huì)影響最終檢測(cè)結(jié)果，因此有必要建立一種快速、簡(jiǎn)易和準(zhǔn)確的基因多態(tài)性檢測(cè)方法，為醫(yī)院及其它醫(yī)療機(jī)構(gòu)提供一種操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度高、通量高、可靠性強(qiáng)和成本低的檢測(cè)方案，節(jié)省操作時(shí)間，快速獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果并用于指導(dǎo)臨床用藥。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種快速簡(jiǎn)易的基因多態(tài)性檢測(cè)方法，省去繁瑣又費(fèi)時(shí)的DNA提取步驟，將樣品與樣品處理液混合處理后，直接對(duì)所述的樣品和樣品處理液的混合液進(jìn)行選擇性擴(kuò)增及選擇性檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)快速、可靠的基因多態(tài)性檢測(cè)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種快速簡(jiǎn)易的基因多態(tài)性檢測(cè)方法，該方法包括：

(1)將待測(cè)樣品與樣品處理液處理獲得含有核酸的溶液；

(2)選擇性擴(kuò)增所述含有核酸的溶液中的目標(biāo)核酸序列；

同時(shí)對(duì)目標(biāo)核酸序列進(jìn)行基因型特異性選擇性檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷待測(cè)樣品基因型；

所述樣品處理液包括處理緩沖液、金屬離子絡(luò)合劑。

針對(duì)現(xiàn)有用于基因多態(tài)性檢測(cè)的方法普遍需要進(jìn)行繁瑣的DNA提取過(guò)程的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種快速簡(jiǎn)易的基因多態(tài)性檢測(cè)方法，其中的樣品處理液可快速實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品的簡(jiǎn)易處理，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取，省去了繁瑣費(fèi)時(shí)的DNA提取步驟，在不長(zhǎng)于7min即可完成樣品的快速處理，并直接對(duì)處理后的樣品進(jìn)行選擇性擴(kuò)增及基因型特異性選擇性檢測(cè)，并且滿足檢測(cè)對(duì)樣品核酸的要求，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，本發(fā)明在此基礎(chǔ)上提供了一種適配該核酸樣品處理液的目標(biāo)核酸序列選擇性擴(kuò)增引物，用于基因多態(tài)性的檢測(cè)，樣品處理到獲取最終檢測(cè)數(shù)據(jù)整個(gè)過(guò)程在1h內(nèi)完成。

作為優(yōu)選，所述處理緩沖液與擴(kuò)增檢測(cè)體系兼容，包括但不限于磷酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖液、碳酸鹽緩沖液、醋酸緩沖液、巴比妥酸緩沖液和Tris-HCl緩沖液；在本發(fā)明具體實(shí)施過(guò)程中可采用Tris-HCl緩沖液，所述Tris-HCl緩沖液濃度為10～100mM，pH7.0～10.0；更具體地，所述Tris-HCl的濃度為30mM，pH8.2。

作為優(yōu)選，所述金屬離子絡(luò)合劑包括但不限于氨基羧酸鹽類絡(luò)合劑、羥基羧酸鹽類絡(luò)合劑、有機(jī)膦酸鹽類絡(luò)合劑和聚丙烯酸類絡(luò)合劑。其中，所述氨基羧酸鹽類絡(luò)合劑可選擇為EDTA。在本發(fā)明的具體實(shí)施過(guò)程中，所述EDTA濃度為1～20mM，pH7.5～8.5；更具體地，所述EDTA濃度為3mM，pH8.2。

作為優(yōu)選，所述樣品處理液還包括DNA釋放促進(jìn)劑，所述DNA釋放促進(jìn)劑包括但不限于去垢劑(陰離子、陽(yáng)離子、兼性去垢劑)、蛋白酶K、胍鹽或Chelex。在本發(fā)明的具體實(shí)施過(guò)程中可采用蛋白酶K，所述蛋白酶K濃度為0.01～20mg/ml；更具體地，所述蛋白酶K濃度為2mg/ml。

作為優(yōu)選，步驟(1)為：將待測(cè)樣品用樣品處理液浸泡或混合，然后經(jīng)56℃保溫5min，98℃保溫2min，獲得含有核酸的溶液。本發(fā)明所述待測(cè)樣本適用于人或動(dòng)物的生理/病理體液(分泌物、滲出液等)；人或動(dòng)物的細(xì)胞懸液(血液、淋巴液、滑膜液、精液、唾液等)；植物的生理/病理體液或者細(xì)胞懸液；細(xì)菌、真菌、質(zhì)粒、病毒、寄生蟲等的提取液或者懸液；人或動(dòng)物機(jī)體組織(肝臟、腎臟)提取液或者組織勻漿；其他任何可以提供遺傳物質(zhì)的物質(zhì)。在本發(fā)明具體實(shí)施過(guò)程中，所述待測(cè)樣本為血液樣本或刮取口腔內(nèi)粘膜細(xì)胞的唾液試子樣本。

作為優(yōu)選，所述選擇性擴(kuò)增采用選擇性擴(kuò)增引物，所述選擇性擴(kuò)增引物能有效區(qū)分目標(biāo)核酸序列變異體與非目標(biāo)核酸序列變異體。更進(jìn)一步地，所述選擇性擴(kuò)增引物包括突變型擴(kuò)增引物、野生型擴(kuò)增引物，所述突變型擴(kuò)增引物和野生型擴(kuò)增引物均包含以共價(jià)相連或直接相連的引物區(qū)序列和變異體識(shí)別區(qū)序列，所述引物區(qū)序列在3’端，變異體識(shí)別區(qū)序列在5’端，所述變異體識(shí)別區(qū)序列連接有核酸雙鏈穩(wěn)定因子或含有不能被核酸酶水解的修飾因子，所述引物區(qū)序列能夠從目標(biāo)核酸基因多態(tài)性位點(diǎn)前開始擴(kuò)增，擴(kuò)增的位置一般為基因多態(tài)性位點(diǎn)前5-15bp，所述變異體識(shí)別區(qū)序列長(zhǎng)度為10-20bp，突變型擴(kuò)增引物變異體識(shí)別區(qū)序列包含目標(biāo)核酸基因多態(tài)性位點(diǎn)處的正常堿基，野生型擴(kuò)增引物變異體識(shí)別區(qū)序列包含目標(biāo)核酸基因多態(tài)性位點(diǎn)處的突變堿基，兩種變異體識(shí)別區(qū)序列均與所述引物區(qū)序列擴(kuò)增延伸產(chǎn)生的序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

以突變性擴(kuò)增引物為例，當(dāng)野生型核酸(在圖2中為非待檢測(cè)變異體)作為模板時(shí)，突變性擴(kuò)增引物變異體識(shí)別區(qū)與引物區(qū)延伸產(chǎn)生的序列，形成一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1)；當(dāng)突變型核酸(在圖2中為待檢測(cè)變異體)作為模板時(shí)，變異體識(shí)別區(qū)與引物區(qū)延伸產(chǎn)生的序列無(wú)法形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。上述發(fā)夾結(jié)構(gòu)的存在有效抑制了進(jìn)一步的擴(kuò)增，突變型核酸擴(kuò)增過(guò)程中由于無(wú)法形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，因此可以得到有效擴(kuò)增從而實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增(見(jiàn)圖2)。在本發(fā)明中，即使野生型核酸在PCR一輪反應(yīng)中得到了擴(kuò)增，但是擴(kuò)增產(chǎn)物在下一輪反應(yīng)中仍然容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而無(wú)法高效擴(kuò)增，從而高效的抑制了野生型核酸的擴(kuò)增效率，實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增，不會(huì)出現(xiàn)現(xiàn)有特異性擴(kuò)增方法中使用3’末端錯(cuò)配的引物一旦錯(cuò)誤的延伸就相當(dāng)于人為的引入突變型的變異體的現(xiàn)象。

同樣地原理，以野生型擴(kuò)增引物為例，當(dāng)突變型核酸作為模板時(shí)，野生型擴(kuò)增引物變異體識(shí)別區(qū)與引物區(qū)延伸產(chǎn)生的序列，形成一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)，無(wú)法高效擴(kuò)增；當(dāng)野生型核酸作為模板時(shí)，變異體識(shí)別區(qū)與引物區(qū)延伸產(chǎn)生的序列無(wú)法形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，可以高效擴(kuò)增。

由于SNP位點(diǎn)的突變位置、突變堿基在本領(lǐng)域已被廣泛報(bào)道，本發(fā)明所述的突變型擴(kuò)增引物、野生型擴(kuò)增引物，可根據(jù)需要檢測(cè)已被報(bào)道的目標(biāo)基因的突變型序列以及野生型序列進(jìn)行常規(guī)設(shè)計(jì)。在本發(fā)明具體實(shí)施例中，本發(fā)明就某些目標(biāo)核酸給出了本發(fā)明的較優(yōu)引物序列。

作為優(yōu)選，所述修飾因子包括堿基類似物、核酸骨架、脫氧核糖類似物、肽核酸或硫代磷酸酯；所述核酸雙鏈穩(wěn)定因子包括鎖核酸、肽核酸或DNA小溝結(jié)合物/類似物中的一種或一種以上的組合。在本發(fā)明具體實(shí)施過(guò)程中，所述核酸雙鏈穩(wěn)定因子可選自DNA小溝結(jié)合物，如MGB等。

作為優(yōu)選，所述基因型特異性選擇性檢測(cè)使用Taqman熒光檢測(cè)探針檢測(cè)，包含突變型檢測(cè)探針和野生型檢測(cè)探針，該探針對(duì)于不同基因型有差異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)差異性檢測(cè)。突變型檢測(cè)探針和野生型檢測(cè)探針可根據(jù)已被報(bào)道的目標(biāo)基因的突變型序列以及野生型序列進(jìn)行常規(guī)設(shè)計(jì)。在本發(fā)明具體實(shí)施例中，本發(fā)明就某些目標(biāo)核酸給出了本發(fā)明的較優(yōu)探針序列。

作為優(yōu)選，本發(fā)明步驟(2)為：

采用熒光定量PCR選擇性擴(kuò)增所述含有核酸的溶液中的目標(biāo)核酸序列；

同時(shí)對(duì)目標(biāo)核酸序列進(jìn)行基因型特異性選擇性檢測(cè)，根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果的Ct值判斷待測(cè)樣品基因型，即Ct值＜36±0.5為高效擴(kuò)增，Ct值＞38±0.5為非高效擴(kuò)增，Ct的具體數(shù)值會(huì)因基因多態(tài)性檢測(cè)位點(diǎn)、反應(yīng)體系、樣品來(lái)源、機(jī)器種類等差異而有差異。

在本發(fā)明步驟(2)中，突變型擴(kuò)增引物和野生型擴(kuò)增引物分別與公共擴(kuò)增引物組成一對(duì)擴(kuò)增引物，同時(shí)各自附加對(duì)應(yīng)探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用突變型擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR的一組，當(dāng)Ct值＜36±0.5時(shí)，表明能夠高效擴(kuò)增，即為突變型；同時(shí)，采用野生型擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR的一組，當(dāng)Ct值＞38±0.5時(shí)，表明不能高效擴(kuò)增，即待測(cè)樣本基因型為突變型；

采用野生型擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR的一組，當(dāng)Ct值＜36±0.5時(shí)，表明能夠高效擴(kuò)增，即為野生型；同時(shí)，采用突變型擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR的一組，當(dāng)Ct值＞38±0.5時(shí)，表明不能高效擴(kuò)增，即待測(cè)樣本基因型為野生型；

采用野生型擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR的一組，當(dāng)Ct值＜36±0.5時(shí)，表明能夠高效擴(kuò)增，即為野生型；同時(shí)，采用突變型擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR的一組，當(dāng)Ct值＜36±0.5時(shí)，表明能夠高效擴(kuò)增，即待測(cè)樣本基因型為雜合性(即同時(shí)存在野生型序列和突變型序列)；

在本發(fā)明的試驗(yàn)中，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，不同的樣品處理液處理后的待測(cè)樣品在采用本發(fā)明上述方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，出現(xiàn)了不同檢測(cè)結(jié)果，完全采用本發(fā)明檢測(cè)方法不僅能夠?qū)悠坊蛐头中?，而且結(jié)果準(zhǔn)確，更換了其他核酸樣品處理液無(wú)法對(duì)樣品基因型分型。同樣地，同是本發(fā)明樣品處理液處理的樣本，采用不同的檢測(cè)方法檢測(cè)，本發(fā)明檢測(cè)方法更加準(zhǔn)確。兩方面結(jié)果表明，基因多態(tài)性的檢測(cè)對(duì)于核酸樣本的要求比較嚴(yán)格，待測(cè)樣品的處理方案需要較為嚴(yán)格地適配采用對(duì)應(yīng)方法，否則會(huì)影響最終檢測(cè)結(jié)果。

根據(jù)本發(fā)明所述方法的有益效果，本發(fā)明基于所述方法提供了一種檢測(cè)基因多態(tài)性的試劑盒，包括樣品處理液，目標(biāo)核酸選擇性擴(kuò)增引物和目標(biāo)核酸選擇性檢測(cè)探針。其中，所述樣品處理液包括處理緩沖液、金屬離子絡(luò)合劑，所述目標(biāo)核酸選擇性擴(kuò)增引物包括突變型擴(kuò)增引物、野生型擴(kuò)增引物，所述目標(biāo)核酸選擇性檢測(cè)探針包括突變型檢測(cè)探針和野生型檢測(cè)探針。

作為優(yōu)選，所述處理緩沖液為10～100mM，pH7.0～10.0的Tris-HCl，所述金屬離子絡(luò)合劑為1～20mM，pH7.5～8.5的EDTA。在本發(fā)明具體實(shí)施方式中，所述處理緩沖液為30mM，pH8.2的Tris-HCl，所述金屬離子絡(luò)合劑為3mM，pH8.2的EDTA。

作為優(yōu)選，所述樣品處理液還包含濃度為0.01～20mg/ml的蛋白酶K。此外，整個(gè)試劑盒還包括PCR緩沖液、MgCl2、去垢劑、DNA聚合酶和dNTP。其中，為了防止非特異性PCR擴(kuò)增和污染，本發(fā)明用dUTP替代dTTP，同時(shí)加入U(xiǎn)NG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)。因此，所述dNTP優(yōu)選為dATP、dCTP、dGTP和dUTP，同時(shí)還包括UNG酶。

作為優(yōu)選，所述突變型擴(kuò)增引物以及野生型擴(kuò)增引物可采用檢測(cè)方法中所述限定。

基于本發(fā)明所述方法和試劑盒的特點(diǎn)和在基因多態(tài)性檢測(cè)上的優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明提出了所述試劑盒在基因多態(tài)性檢測(cè)上的應(yīng)用，包括單堿基多態(tài)性、堿基插入或缺失、微衛(wèi)星分析等。

本發(fā)明具有下述積極效果：

1、檢測(cè)速度快：本發(fā)明提供的方法將樣品與樣品處理液混合處理后，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取，省去了繁瑣又費(fèi)時(shí)的DNA提取步驟，在不長(zhǎng)于7min即可完成樣品的快速處理，并直接對(duì)所述樣品和樣品處理液的混合液進(jìn)行選擇性擴(kuò)增及基因型特異性選擇性檢測(cè)，從樣本處理到獲取最終檢測(cè)數(shù)據(jù)整個(gè)過(guò)程在1h內(nèi)完成(當(dāng)采用ABI7500Fast定量PCR儀器時(shí))。

2、能準(zhǔn)確檢測(cè)基因多態(tài)性：采用特異性選擇性擴(kuò)增引物選擇性擴(kuò)增目的核酸序列變異體，而非目的核酸序列變異體無(wú)法擴(kuò)增，在擴(kuò)增的同時(shí)通過(guò)特異性選擇性探針檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)，從而確保了基因分型的準(zhǔn)確性。

由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種快速高效的基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，將待測(cè)樣本與核酸樣品處理液混合處理后，無(wú)需進(jìn)行DNA提取步驟，在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本的簡(jiǎn)易處理，并進(jìn)一步通過(guò)選擇性擴(kuò)增引物與選擇性檢測(cè)探針實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸序列野生型變異體與突變型變異體的有效區(qū)分，從樣本處理到獲取最終檢測(cè)結(jié)果整個(gè)過(guò)程在1h內(nèi)完成，并且保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

附圖說(shuō)明

圖1為發(fā)夾結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為利用本發(fā)明特異性擴(kuò)增引物實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增的技術(shù)原理示意圖；

圖3為兩組血液樣本分別經(jīng)兩種方法處理后內(nèi)參的擴(kuò)增結(jié)果

圖4使用本發(fā)明所述的分型方法對(duì)經(jīng)兩種方法處理后的一組血液樣本的基因SLCO1B1第5外顯子521T>C(Val174Ala)的檢測(cè)結(jié)果；

圖5使用本發(fā)明所述的分型方法對(duì)經(jīng)兩種方法處理后的一組血液樣本的基因SLCO1B1第5外顯子521T>C(Val174Ala)的檢測(cè)結(jié)果；

圖6為三組血液樣本經(jīng)本發(fā)明所述方法處理后內(nèi)參的擴(kuò)增結(jié)果；

圖7為使用本發(fā)明所述方法對(duì)一組血液樣本的基因APOE的rs429358(c.388T>C，Cys130Arg)野生型樣本的檢測(cè)結(jié)果；

圖8為使用本發(fā)明所述方法對(duì)一組血液樣本的基因APOE的rs429358(c.388T>C，Cys130Arg)雜合型樣本的檢測(cè)結(jié)果；

圖9為使用本發(fā)明所述方法對(duì)一組血液樣本的基因APOE的rs429358(c.388T>C，Cys130Arg)突變型樣本的檢測(cè)結(jié)果；

圖10為兩組血液樣本經(jīng)本發(fā)明所述方法處理后內(nèi)參的擴(kuò)增結(jié)果；

圖11為使用本發(fā)明所述處理方法對(duì)兩組血液樣本快速處理后，分別用本發(fā)明所述分型方法與ARMS方法對(duì)CYP2C19*3突變型樣本的檢測(cè)結(jié)果；

圖12為使用本發(fā)明所述處理方法對(duì)兩組血液樣本快速處理后，分別用本發(fā)明所述分型方法與ARMS方法對(duì)CYP2C19*3野生型樣本的檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了一種快速簡(jiǎn)易的基因多態(tài)性檢測(cè)方法及試劑盒和應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述試劑盒和檢測(cè)方法已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

在本發(fā)明中，除非特別定義，本專利所有的科學(xué)或技術(shù)專業(yè)詞匯均與本領(lǐng)域大部分一般人員的普通理解一致。以下的文獻(xiàn)中本領(lǐng)域中大部分專業(yè)名詞的一般定義：[Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)]；[The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)]；[The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991)]；[Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)]除非另外定義，本專利中所使用的專業(yè)名詞與上述文獻(xiàn)中對(duì)該專業(yè)名詞描述一致。

名詞“核酸”包括脫氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，DNA-RNA雜交體，寡聚核苷酸，適配體(aptamers)，肽核酸(PNAs)，PNA-DNA雜交體，PNA-RNA雜交體等等。包括一切線性形式(單鏈或雙鏈)或分支狀形式的共價(jià)相連的核苷酸。一個(gè)典型的核酸通常是單鏈或者雙鏈的，并包含磷酸二脂鍵。

名詞“目標(biāo)核酸序列”指的是待擴(kuò)增的一段核酸序列，該序列作為核酸擴(kuò)增的模板。

名詞“核酸序列變異體”、“核酸變異體”指的是一段特定的核酸序列，不同變異體之間存在差別，這種差別可以是單個(gè)或多個(gè)堿基的不同，也可以是插入、缺失、易位或者以上所有類型的組合。

名詞“野生型變異體”指的是自然存在的“正?！钡幕蛐蛄?，它在大多數(shù)群體中同一基因序列出現(xiàn)頻率最高的序列。

名詞“突變型變異體”指的是相比于“野生型變異體”不同的核酸序列。這種不同可以是單個(gè)或多個(gè)堿基的不同，也可以是插入或缺失或者以上所有類型的組合，例如，腫瘤細(xì)胞中突變的核酸序列。在一些實(shí)施例中，相較于野生型變異體，突變型變異體所占比例很少。

名詞“擴(kuò)增”指的是目的核酸片段在核酸聚合酶的作用下數(shù)目變多的過(guò)程，包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)，核酸序列基礎(chǔ)擴(kuò)增(NASBA)，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)，鏈置換擴(kuò)增(SDA)，解旋酶依賴擴(kuò)增(HDA)等。

在本發(fā)明實(shí)施例中，擴(kuò)增指的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。模板變性解鏈，寡聚核苷酸引物與模板退火雜交，伴隨著核苷酸加入的延伸，如此反復(fù)循環(huán)一定輪數(shù)，實(shí)現(xiàn)目的核苷酸片段的增多。

名詞“突變”指細(xì)胞中的遺傳基因發(fā)生的改變。它包括單個(gè)堿基改變所引起的點(diǎn)突變，或多個(gè)堿基的缺失、重復(fù)和插入。

在本發(fā)明實(shí)施例中，核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)是熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。在熒光定量PCR反應(yīng)中，衡量擴(kuò)增的參數(shù)是Ct值，較早的Ct值反應(yīng)的是信號(hào)更快的達(dá)到閾值。擴(kuò)增樣品中不同核酸變異體之間的Ct差值，往往反映了擴(kuò)增體系對(duì)不同核酸變異體擴(kuò)增效率的差異，進(jìn)一步反應(yīng)了擴(kuò)增體系的選擇性。

對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)在本領(lǐng)域中也有很多方法。這些方法包括使用熒光標(biāo)記的探針，或者各種與核酸結(jié)合的染料。這些檢測(cè)可以是特異性的檢測(cè)核酸變異體中一種或者多種，也可以是非選擇性的檢測(cè)所有核酸信號(hào)。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)可以發(fā)生在擴(kuò)增反應(yīng)完成之后，比如通過(guò)凝膠電泳的方法，或者對(duì)核酸進(jìn)行染色的方法。另外，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)也可以發(fā)生在擴(kuò)增反應(yīng)的過(guò)程之中。

以下就本發(fā)明所提供的一種快速簡(jiǎn)易的基因多態(tài)性檢測(cè)方法及試劑盒和應(yīng)用做進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1：使用本發(fā)明所述的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)血液樣本的快速處理

在這個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)使用本發(fā)明所述的方法對(duì)5組血液進(jìn)行40倍稀釋后經(jīng)快速處理。其中處理液為20mM Tris-HCl pH8.0，2mM EDTA，2mg/ml蛋白酶K，將2ul血液與78ul該處理液混合，并充分混勻后經(jīng)56℃保溫5min，98℃保溫2min，粗制樣本即處理完成。

實(shí)施例2：使用本發(fā)明所述的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)唾液試子樣本的快速處理

在這個(gè)實(shí)施例中，使用專用唾液試子刮取口腔內(nèi)粘膜細(xì)胞，用剪刀剪取部分試子或者將整個(gè)試子進(jìn)行浸泡，其中處理液為20mM Tris-HCl pH8.0，2mM EDTA，2mg/ml蛋白酶K，所需體積浸泡以處理液全部覆蓋試子為宜，并充分混勻后經(jīng)56℃保溫5min，98℃保溫2min，粗制樣本即處理完成。

實(shí)施例3：使用專利201110295395.9發(fā)明所述的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本的快速處理

在這個(gè)實(shí)施例中，使用水配置含10wt％chelex-100作為裂解液，將2ul血液與18ul裂解液混合均勻后，在56℃下，裂解30分鐘，100℃煮沸8分鐘即可獲得所述DNA樣本。

實(shí)施例4：使用本發(fā)明所述的方法及201110295395.9發(fā)明所述的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)血液樣本的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B1(OATP1B1，又稱OATP-C、OATP2或LST1)編碼基因SLCO1B1第5外顯子521T>C(Val174Ala)的選擇性擴(kuò)增與檢測(cè)并對(duì)比樣本處理方法。

在這個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)使用本發(fā)明所述的實(shí)施例1中的方法及實(shí)施例3中201110295395.9發(fā)明所述的方法對(duì)兩組血液進(jìn)行處理，然后結(jié)合本發(fā)明所述分型方法對(duì)基因SLCO1B1第5外顯子521T>C(Val174Ala)進(jìn)行選擇性擴(kuò)增與檢測(cè)。突變型與野生型分兩個(gè)獨(dú)立管進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)內(nèi)參基因作為質(zhì)控，被檢測(cè)基因與內(nèi)參基因同時(shí)進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。

OATP1B1野生型序列(SEQ ID NO:1所示)為：

5’-TCCCCTATTCCACGAAGCATATTACCCATGAACA(多態(tài)性位點(diǎn))CATATATCCACATGTATGACCCAGATTCCTTTAAACAACCTATGTAGATAAGAGAGTGTTTCATTTTAAACATTAA-3’

OATP1B1突變型序列(SEQ ID NO:2所示)為：

5’-TCCCCTATTCCACGAAGCATATTACCCATGAACG(多態(tài)性位點(diǎn))CATATATCCACATGTATGACCCAGATTCCTTTAAACAACCTATGTAGATAAGAGAGTGTTTCATTTTAAACATTAA-3’

OATP1B1野生型上游擴(kuò)增引物序列(SEQ ID NO:3所示)為：5’-TGCGTTCAT(變異體識(shí)別區(qū)，下劃線堿基為多態(tài)性位點(diǎn))TCCCCTATTCCACGAAGCATATTAC(引物區(qū))-3’(5’端MGB修飾，Spacer C3連接引物區(qū)序列和變異體識(shí)別區(qū)序列)

OATP1B1突變型上游擴(kuò)增引物序列(SEQ ID NO:4所示)為：5’-TGTGTTCAT(變異體識(shí)別區(qū)，下劃線堿基為多態(tài)性位點(diǎn))TCCCCTATTCCACGAAGCATATTAC(引物區(qū))-3’(5’端MGB修飾，Spacer C3連接引物區(qū)序列和變異體識(shí)別區(qū)序列)

OATP1B1公共下游引物(SEQ ID NO:5所示)為：5’-AGGAATCTGGGTCATACATGT-3’

OATP1B1野生型檢測(cè)探針序列(SEQ ID NO:6所示)為：5’-TATATGTGTTCATGGGTA-3’(5’FAM，3’MGB)

OATP1B1突變型檢測(cè)探針序列(SEQ ID NO:7所示)為：5’-ATATATGCGTTCATGGGT-3’(5’FAM，3’MGB)

內(nèi)參序列(SEQ ID NO:8所示)為：

5’-CGGACTGAAGGAGCTGCCCATGAGAAATTTACAGGGTGAGAGGCTGGGATGCCAAGGCTGGGGGTTCATAAATGCAGACAGCAGTTCCGATGGC-3’

內(nèi)參序列正向引物序列(SEQ ID NO:9所示)為：5’-CGGACTGAAGGAGCTGCC-3’

內(nèi)參序列反向引物序列(SEQ ID NO:10所示)為：5’-GCCATCGGAACTGCTGTCTG-3’

內(nèi)參序列檢測(cè)探針序列(SEQ ID NO:11所示)為：5’-CCCCAGCCTTGGCATCCCA-3’(5’端Cy5，3’端BHQ2)

PCR反應(yīng)體系為25μl，每個(gè)反應(yīng)體系中含有2％甘油，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，正向引物、反向引物各200nM，檢測(cè)探針200nM，1個(gè)單位的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶及0.2mg/ml的BSA。其中1個(gè)單位是指在72℃30分鐘摻入10nmoldNTPs所需要的酶量。

使用ABI 7500Fast熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)和后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。PCR熱循環(huán)條件為95℃，2min；40循環(huán)(95℃，3s；60℃，25s，單循環(huán))。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3-5，OATP1B1基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果通過(guò)在465nM-510nM的熒光變化來(lái)體現(xiàn)的，內(nèi)參基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果通過(guò)在618nM-660nM的熒光變化來(lái)體現(xiàn)的。

圖3中可見(jiàn)血液經(jīng)兩種方法處理后兩組血液間擴(kuò)增有顯著差異(左右圖各為一組樣本)，本發(fā)明所述方法的擴(kuò)增效果及所獲得的模板量顯著優(yōu)于對(duì)比方法，可獲得更充足的模板量及更小的PCR擴(kuò)增抑制性。

圖4中可見(jiàn)該組血液樣本為野生純合型樣本，本發(fā)明方法僅野生型檢測(cè)孔存在擴(kuò)增，突變型檢測(cè)孔無(wú)擴(kuò)增，而對(duì)比方法野生孔與突變孔均基本擴(kuò)增失敗，無(wú)法有效分型。

圖5中可見(jiàn)該組血液樣本同樣為野生純合型樣本，本發(fā)明方法僅野生型檢測(cè)孔存在擴(kuò)增，突變型檢測(cè)孔無(wú)擴(kuò)增，而對(duì)比方法野生孔與突變孔均基本擴(kuò)增失敗，無(wú)法有效分型。

實(shí)施例5：使用本發(fā)明所述的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)載脂蛋白E(Apolipoprotein E，APOE)編碼基因APOE的rs429358(c.388T>C，Cys130Arg)的選擇性擴(kuò)增與檢測(cè)

在這個(gè)實(shí)施例中，分別選擇三組血液樣本，經(jīng)實(shí)施例1所描述的方法進(jìn)行快速處理并結(jié)合本發(fā)明所述分型方法用于對(duì)基因APOE的rs429358(c.388T>C，Cys130Arg)的選擇性擴(kuò)增與檢測(cè)。突變型與野生型分兩個(gè)獨(dú)立管進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)內(nèi)參基因作為質(zhì)控，被檢測(cè)基因與內(nèi)參基因同時(shí)進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。

野生型序列(SEQ ID NO:12所示)為：

5’-GCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGT(多態(tài)性位點(diǎn))GCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGC-3’

突變型序列(SEQ ID NO:13所示)為：

5’-GCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGC(多態(tài)性位點(diǎn))GCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGC-3’

野生型上游擴(kuò)增引物序列(SEQ ID NO:14所示)為：5’-CGCGCACGTC(變異體識(shí)別區(qū)，下劃線堿基為多態(tài)性位點(diǎn))TGGGCGCGGACATGG(引物區(qū))-3’(5’端MGB修飾，Spacer C3連接引物區(qū)序列和變異體識(shí)別區(qū)序列)

突變型上游擴(kuò)增引物序列(SEQ ID NO:15所示)為：5’-CGCACACGTC(變異體識(shí)別區(qū)，下劃線堿基為多態(tài)性位點(diǎn))TGGGCGCGGACATGG(引物區(qū))-3’(5’端MGB修飾，Spacer C3連接引物區(qū)序列和變異體識(shí)別區(qū)序列)

公共下游引物(SEQ ID NO:16所示)為：5’-CGCCGCGGTACTGCACCAGG-3’

野生型檢測(cè)探針序列(SEQ ID NO:17所示)為：5’-CGCACACGTCCTC-3’(5’FAM，3’MGB)

突變型檢測(cè)探針序列(SEQ ID NO:18所示)為：5’-CGCGCACGTCC-3’(5’FAM，3’MGB)

內(nèi)參各種序列同實(shí)施例4。

PCR反應(yīng)體系為25μl，每個(gè)反應(yīng)體系中含有2％甘油，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，正向引物、反向引物各200nM，檢測(cè)探針200nM和1個(gè)單位的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶。其中1個(gè)單位是指在72℃30分鐘摻入10nmoldNTPs所需要的酶量。

使用ABI 7500Fast熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)和后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。PCR熱循環(huán)條件為95℃，2min；40循環(huán)(95℃，3s；60℃，25s，單循環(huán))。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7、圖8和圖9，APOE基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果通過(guò)在465nM-510nM的熒光變化來(lái)體現(xiàn)的，內(nèi)參基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果通過(guò)在618nM-660nM的熒光變化來(lái)體現(xiàn)的。圖6中可見(jiàn)血液經(jīng)本發(fā)明方法處理后三組血液內(nèi)參均高效擴(kuò)增，獲得足夠PCR反應(yīng)所需模板量。

圖7中可見(jiàn)該組血液樣本為野生純合型樣本，僅野生型檢測(cè)孔存在擴(kuò)增，突變型檢測(cè)孔無(wú)擴(kuò)增。

圖8中可見(jiàn)該組血液樣本為雜合型樣本，野生型檢測(cè)孔與突變型檢測(cè)孔均存在擴(kuò)增。

圖9中可見(jiàn)該組血液樣本為突變純合型樣本，僅突變型檢測(cè)孔存在擴(kuò)增，野生型檢測(cè)孔無(wú)擴(kuò)增。

實(shí)施例6：使用本發(fā)明所述的方法與ARMS方法對(duì)Cytochrome P4502C19細(xì)胞色素P450同工酶2C19對(duì)應(yīng)位點(diǎn)CYP2C19*3的檢測(cè)對(duì)比

在這個(gè)實(shí)施例中，分別選擇兩組血液樣本，經(jīng)實(shí)施例1所描述的方法進(jìn)行快速處理并結(jié)合本發(fā)明所述分型方法及對(duì)比的ARMS方法用于對(duì)基因CYP2C19*3的檢測(cè)。突變型與野生型分兩個(gè)獨(dú)立管進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)內(nèi)參基因作為質(zhì)控，被檢測(cè)基因與內(nèi)參基因同時(shí)進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。

CYP2C19*3野生型序列(SEQ ID NO:19所示)為：

5’-AACTTGATGGAAAAATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGG(多態(tài)性位點(diǎn))ATCCAGGTAAGGCCAAGTTTTTTGCTTCCTGAGAAACCACTTACAG-3’

CYP2C19*3突變型序列(SEQ ID NO:20所示)為：

5’-AACTTGATGGAAAAATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGA(多態(tài)性位點(diǎn))ATCCAGGTAAGGCCAAGTTTTTTGCTTCCTGAGAAACCACTTACAG-3’

CYP2C19*3野生型上游擴(kuò)增引物序列(SEQ ID NO:21所示)為：

5’-CCCTGAATCCA(變異體識(shí)別區(qū)，下劃線堿基為多態(tài)性位點(diǎn))AGGAAGCAAAAAACTTGGCCTT(引物區(qū))-3’(5’端MGB修飾，Spacer C3連接引物區(qū)和變異體識(shí)別區(qū))

CYP2C19*3突變型上游擴(kuò)增引物序列(SEQ ID NO:22所示)為：

5’-CCCTGGATCCA(變異體識(shí)別區(qū)，下劃線堿基為多態(tài)性位點(diǎn))AGGAAGCAAAAAACTTGGCCTT(引物區(qū))-3’(5’端MGB修飾，Spacer C3連接引物區(qū)序列和變異體識(shí)別區(qū)序列)

CYP2C19*3公共下游引物(SEQ ID NO:23所示)為：

5’-GAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCA-3’

CYP2C19*3野生型檢測(cè)探針序列(SEQ ID NO:24所示)為：5’-CCCTGGATCCAGGT-3’(5’FAM，3’MGB)

CYP2C19*3突變型檢測(cè)探針序列(SEQ ID NO:25所示)為：5’-CCCTGAATCCAGGTA-3’(5’FAM，3’MGB)

野生型正向ARMS引物序列(SEQ ID NO:26所示)為:

5’-AAAAACTTGGCCTTACCTGGATC-3’

突變型正向ARMS引物序列(SEQ ID NO:27所示)為:

5’-AAAAAACTTGGCCTTACCTGGATT-3’

公共ARMS下游引物(SEQ ID NO:28所示)為：5’-TCCCTGCAATGTGATCTGCTC-3’

公共ARMS檢測(cè)探針序列(SEQ ID NO:29所示)為：5’-CAATCCTGATGTTTTC-3’(5’FAM，3’MGB)

內(nèi)參各種序列同實(shí)施例4。

PCR反應(yīng)體系為25μl，每個(gè)反應(yīng)體系中含有2％甘油，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，正向引物、反向引物各200nM，檢測(cè)探針200nM和1個(gè)單位的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶。其中1個(gè)單位是指在72℃30分鐘摻入10nmoldNTPs所需要的酶量。

使用ABI 7500Fast熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)和后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。PCR熱循環(huán)條件為95℃，2min；40循環(huán)(95℃，3s；60℃，25s，單循環(huán))。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖10、圖11、圖12，CYP2C19*3基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果通過(guò)在465nM-510nM的熒光變化來(lái)體現(xiàn)的，內(nèi)參基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果通過(guò)在618nM-660nM的熒光變化來(lái)體現(xiàn)的。

圖10中可見(jiàn)血液經(jīng)本發(fā)明方法處理后兩組血液內(nèi)參均高效擴(kuò)增(左右圖各為一組樣本)，獲得足夠PCR反應(yīng)所需模板量。

圖11中可見(jiàn)使用本發(fā)明所提供檢測(cè)方法確定該組血液樣本為雜合型樣本，本發(fā)明方法野生型檢測(cè)孔與突變型檢測(cè)孔均存在擴(kuò)增，而對(duì)比的ARMS方法野生孔基本擴(kuò)增失敗，同時(shí)突變孔擴(kuò)增明顯，無(wú)法有效分型甚至錯(cuò)誤判定為突變純合型。

圖12中可見(jiàn)使用本發(fā)明所提供檢測(cè)方法確定該組血液樣本為野生純合型樣本，本發(fā)明方法僅野生型檢測(cè)孔存在擴(kuò)增，突變型檢測(cè)孔無(wú)擴(kuò)增，而對(duì)比的ARMS方法野生孔基本擴(kuò)增失敗，同時(shí)突變孔完全無(wú)擴(kuò)增，無(wú)法有效分型。

綜合圖11，圖12中可見(jiàn)ARMS引物探針組合區(qū)分效果顯著差于該發(fā)明所采用的引物探針組合的分型效果。

此外所有實(shí)施例中涉及分型的樣本的實(shí)際分型均經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測(cè)序法確認(rèn)，與本發(fā)明所得結(jié)論一致。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 蘇州新海生物科技股份有限公司

<120> 一種快速簡(jiǎn)易的基因多態(tài)性檢測(cè)方法及試劑盒和應(yīng)用

<130> MP1621944

<160> 29

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcccctattc cacgaagcat attacccatg aacacatata tccacatgta tgacccagat 60

tcctttaaac aacctatgta gataagagag tgtttcattt taaacattaa 110

<210> 2

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcccctattc cacgaagcat attacccatg aacgcatata tccacatgta tgacccagat 60

tcctttaaac aacctatgta gataagagag tgtttcattt taaacattaa 110

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgcgttcatt cccctattcc acgaagcata ttac 34

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgtgttcatt cccctattcc acgaagcata ttac 34

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aggaatctgg gtcatacatg t 21

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tatatgtgtt catgggta 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atatatgcgt tcatgggt 18

<210> 8

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cggactgaag gagctgccca tgagaaattt acagggtgag aggctgggat gccaaggctg 60

ggggttcata aatgcagaca gcagttccga tggc 94

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cggactgaag gagctgcc 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gccatcggaa ctgctgtctg 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccccagcctt ggcatccca 19

<210> 12

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcaggcccgg ctgggcgcgg acatggagga cgtgtgcggc cgcctggtgc agtaccgcgg 60

cgaggtgcag gccatgctcg gccagagcac cgaggagctg cgggtgcgcc tcgc 114

<210> 13

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcaggcccgg ctgggcgcgg acatggagga cgtgcgcggc cgcctggtgc agtaccgcgg 60

cgaggtgcag gccatgctcg gccagagcac cgaggagctg cgggtgcgcc tcgc 114

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgcgcacgtc tgggcgcgga catgg 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cgcacacgtc tgggcgcgga catgg 25

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cgccgcggta ctgcaccagg 20

<210> 17

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cgcacacgtc ctc 13

<210> 18

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cgcgcacgtc c 11

<210> 19

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

aacttgatgg aaaaattgaa tgaaaacatc aggattgtaa gcaccccctg gatccaggta 60

aggccaagtt ttttgcttcc tgagaaacca cttacag 97

<210> 20

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aacttgatgg aaaaattgaa tgaaaacatc aggattgtaa gcaccccctg aatccaggta 60

aggccaagtt ttttgcttcc tgagaaacca cttacag 97

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ccctgaatcc aaggaagcaa aaaacttggc ctt 33

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ccctggatcc aaggaagcaa aaaacttggc ctt 33

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gaatgaaaac atcaggattg taagca 26

<210> 24

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ccctggatcc aggt 14

<210> 25

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ccctgaatcc aggta 15

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aaaaacttgg ccttacctgg atc 23

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

aaaaaacttg gccttacctg gatt 24

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tccctgcaat gtgatctgct c 21

<210> 29

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

caatcctgat gttttc 16