植物調(diào)控元件及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào)：11672598閱讀：475來源：國知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2012年5月11日和發(fā)明名稱為“植物調(diào)控元件及其應(yīng)用”的201280031326.x號(hào)發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

相關(guān)申請(qǐng)的引用

本申請(qǐng)要求2011年5月13日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/485,876的權(quán)益，其以整體通過引用方式結(jié)合到本文。

序列表的引入

包含在名為″mons304wo.txt″的文件中的序列表在此通過電子遞交方式提交并通過引用方式結(jié)合到本文，所述序列表為463千字節(jié)(根據(jù)microsoft測(cè)量)并且創(chuàng)建于2012年5月9日。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物分子生物和植物遺傳工程以及可用于調(diào)節(jié)植物中基因表達(dá)的dna分子的領(lǐng)域。

背景

調(diào)控元件是通過調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控基因活性的遺傳元件。這種元件包括啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和3′非翻譯區(qū)，并用于植物分子生物和植物遺傳工程的領(lǐng)域。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供來源于甜瓜(cucumismelo，通常稱作香瓜的植物品種)的用于植物的新型基因調(diào)控元件如啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列和內(nèi)含子。本發(fā)明還提供包含所述調(diào)控元件的dna構(gòu)建體、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物和種子?？商峁┧鲂蛄锌刹僮鞯剡B接可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子相對(duì)于本文提供的調(diào)控序列可以是異源的。本發(fā)明還提供制備和使用所述調(diào)控元件、包含所述調(diào)控元件的dna構(gòu)建體和包含可操作地連接可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物和種子的方法。

因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供dna分子，如轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組、或啟動(dòng)子、或前導(dǎo)序列、或內(nèi)含子，其包含選自下組的多核苷酸序列：a)與seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)具有至少85％序列一致性的序列；b)包含seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)的序列；和c)顯示出基因調(diào)控活性的seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)的片段，其中所述dna分子可操作地連接異源可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。在具體實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組、或啟動(dòng)子、或前導(dǎo)序列、或內(nèi)含子至少90％、至少95％、至少98％或至少99％與seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)一致。在特定的實(shí)施方式中，所述異源可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子包含農(nóng)學(xué)目的的基因、能夠在植物中提供除草劑抗性的基因或能夠在植物中提供植物抗害蟲性的基因。

本發(fā)明還提供含有dna分子如轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組、或啟動(dòng)子、或前導(dǎo)序列、或內(nèi)含子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述dna分子包含選自下組的多核苷酸序列：a)與seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)具有至少85％序列一致性的序列；b)包含seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)的序列；和c)顯示出基因調(diào)控活性的seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)的片段，其中所述dna分子可操作地連接異源的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。此外，所述轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組、或啟動(dòng)子、或前導(dǎo)序列、或內(nèi)含子調(diào)控基因的表達(dá)。所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞可以是單子葉植物或雙子葉植物細(xì)胞。

本發(fā)明進(jìn)一步提供含有dna分子如轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組、或啟動(dòng)子、或前導(dǎo)序列、或內(nèi)含子的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物部分，所述dna分子包含選自下組的多核苷酸序列：a)與seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)具有至少85％序列一致性的序列；b)包含seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)的序列；和c)顯示出基因調(diào)控活性的seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)的片段，其中所述dna分子可操作地連接異源的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。在具體實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)基因植物可以是含有所述轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組、或啟動(dòng)子、或前導(dǎo)序列、或內(nèi)含子的任一代的后代植物。

還進(jìn)一步提供含有dna分子如轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組、或啟動(dòng)子、或前導(dǎo)序列、或內(nèi)含子的轉(zhuǎn)基因種子，所述dna分子包含選自下組的多核苷酸序列：a)與seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)具有至少85％序列一致性的序列；b)包含seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)的序列；和c)顯示出基因調(diào)控活性的seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)的片段，其中所述dna分子可操作地連接異源的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。

在另一方面，本發(fā)明提供用含有dna分子如轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組、或啟動(dòng)子、或前導(dǎo)序列、或內(nèi)含子的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物部分或轉(zhuǎn)基因種子生產(chǎn)商品的方法，所述dna分子包含選自下組的多核苷酸序列：a)與seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)具有至少85％序列一致性的序列；b)包含seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)的序列；和c)顯示出基因調(diào)控活性的seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)的片段，其中所述dna分子可操作地連接異源的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述商品是蛋白質(zhì)濃縮物、蛋白質(zhì)分離物、谷物、淀粉、種子、粗粉、面粉、生物質(zhì)或種子油。

在另一方面，本發(fā)明提供包含dna分子如轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組、或啟動(dòng)子、或前導(dǎo)序列、或內(nèi)含子的商品，所述dna分子包含選自下組的多核苷酸序列：a)與seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)具有至少85％序列一致性的序列；b)包含seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)的序列；和c)顯示出基因調(diào)控活性的seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)的片段，其中所述dna分子可操作地連接異源的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。

在另一方面，本發(fā)明提供在轉(zhuǎn)基因植物中使用dna分子如轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組、或啟動(dòng)子、或前導(dǎo)序列、或內(nèi)含子表達(dá)可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的方法，所述dna分子具有與seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)至少85％一致、或含有seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)或由seqidno：1-199、211和212中任一個(gè)的片段組成的dna序列；和栽培所述轉(zhuǎn)基因植物。

序列簡(jiǎn)要說明

seqidno：1、5、7、9、11、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、159、162、167、168、172、175、176、177、178、181、182、183、184、185、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、211和212是由下述任一元件組成的甜瓜屬轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組或exp序列：可操作地連接前導(dǎo)序列元件的啟動(dòng)子元件；或可操作地連接前導(dǎo)序列元件和內(nèi)含子元件的啟動(dòng)子元件；或可操作地連接前導(dǎo)序列元件、可操作的連接內(nèi)含子元件、可操作的連接前導(dǎo)序列元件的啟動(dòng)子元件。

seqidno：2、6、8、10、12、163和169是啟動(dòng)子元件。

seqidno：3、164、166和170是前導(dǎo)序列。

seqidno：4、165和171是內(nèi)含子序列。

seqidno：157、160、173、179和186是其中啟動(dòng)子可操作地連接前導(dǎo)序列元件的序列。

seqidno：158、161、174、180和187是其中內(nèi)含子可操作地連接前導(dǎo)序列元件的序列。

附圖簡(jiǎn)要說明

圖1a-1f描繪對(duì)應(yīng)于從甜瓜分離的啟動(dòng)子元件的啟動(dòng)子變體片段的對(duì)比。特別是，圖1a-1f顯示在轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組exp-cucme.ubq1∶1∶1(seqidno：1)中發(fā)現(xiàn)的2068bp啟動(dòng)子序列p-cucme.ubq1-1∶1∶15(seqidno：2)與經(jīng)由所述啟動(dòng)子5′缺失衍生的啟動(dòng)子序列p-cucme.ubq1-1∶1∶15的對(duì)比。缺失，例如p-cucme.ubq1-1∶1∶15的5′端，產(chǎn)生下述啟動(dòng)子：在exp-cucme.ubq1∶1∶2(seqidno：5)中發(fā)現(xiàn)的1459bp的啟動(dòng)子p-cucme.ubq1-1∶1∶16(seqidno：6)；包含在exp-cucme.ubq1∶1∶3(seqidno：7)中的964bp序列p-cucme.ubq1-1∶1∶17(seqidno：8)；包含在exp-cucme.ubq1∶1∶4(seqidno：9)中的479bp序列p-cucme.ubq1-1∶1∶18(seqidno：10)；和包含在exp-cucme.ubq1∶1∶5(seqidno：11)中的173bp序列p-cucme.ubq1-1∶1∶19(seqidno：12)。

發(fā)明詳述

本文公開的發(fā)明提供從甜瓜中獲得的具有有利的基因調(diào)控活性的多核苷酸分子。描述了這些多核苷酸分子的設(shè)計(jì)、構(gòu)造和用途。在seqidno：1-199、211和212之中，提供這些多核苷酸分子的核苷酸序列。例如，這些多核苷酸分子能夠影響植物組織中可操作地連接可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的表達(dá)，因此在轉(zhuǎn)基因植物中選擇性地調(diào)控基因表達(dá)或編碼基因產(chǎn)物的活性。本發(fā)明還提供改性、制備和使用所述多核苷酸分子的方法。本發(fā)明還提供含有所述啟動(dòng)子和/或其它公開的核苷酸序列的組合物、轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物和種子，以及制備和使用其的方法。

提供了以下定義和方法以更好地限定本發(fā)明和在本發(fā)明的實(shí)施中指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員。除非另有說明，否則根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)用法來理解這些術(shù)語。

dna分子

如本文所使用，術(shù)語″dna″或″dna分子″是指基因組或合成來源的雙鏈dna分子，即脫氧核苷酸堿基的聚合物或多核苷酸分子，從5′(上游)端至3′(下游)端讀取。如本文所使用的，術(shù)語″dna序列″是指dna分子的核苷酸序列。

如本文所使用的，術(shù)語″分離的dna分子″是指與通常以其自然或天然狀態(tài)與其有關(guān)的其它分子至少部分分離的dna分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，術(shù)語″分離的″是指與通常以其自然或天然狀態(tài)與dna分子側(cè)面相接的一些核酸至少部分分離的dna分子。因此，融合至通常與它們不相關(guān)的調(diào)控或編碼序列的dna分子(例如作為重組技術(shù)的結(jié)果)，在本文中被認(rèn)為是分離的。當(dāng)被整合入宿主細(xì)胞的染色體中或者與其它dna分子存在于核酸溶液中時(shí)，這種分子被認(rèn)為是分離的，因?yàn)樗鼈儾惶幵谄涮烊粻顟B(tài)中。

許多本領(lǐng)域已知的任何方法用于分離和操作本發(fā)明中公開的dna分子或其片段。例如，pcr(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)可用于擴(kuò)增特定的起始dna分子和/或產(chǎn)生原始分子的變體。如通常使用自動(dòng)化寡核苷酸合成儀所進(jìn)行，dna分子或其片段也可通過其它技術(shù)例如用化學(xué)手段直接合成片段來獲得。

如本文所使用，術(shù)語″序列一致性″是指兩個(gè)優(yōu)化對(duì)比的多核苷酸序列或兩個(gè)優(yōu)化對(duì)比的多肽序列一致的程度。優(yōu)化的序列對(duì)比通過手動(dòng)對(duì)比兩個(gè)序列例如參考序列和另一序列來產(chǎn)生，以最大化在序列對(duì)比中具有適當(dāng)?shù)膬?nèi)部核苷酸插入、缺失或間隙的核苷酸匹配數(shù)。如本文所使用，術(shù)語″參考序列″是指以seqidno：1-199、211和212的多核苷酸序列提供的序列。

如本文所使用，術(shù)語″百分比序列一致性″或″百分比一致性″或″％一致性″為一致性分?jǐn)?shù)乘以100。用參考序列優(yōu)化對(duì)比的序列的″一致性分?jǐn)?shù)″為優(yōu)化對(duì)比中的核苷酸匹配數(shù)除以參考序列中的核苷酸總數(shù)(例如整個(gè)參考序列總長(zhǎng)的核苷酸總數(shù))。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式為當(dāng)與在本文中以seqidno：1-199、211和212提供的參考序列優(yōu)化對(duì)比時(shí)，包含與所述參考序列具有至少約85％的一致性、至少約90％的一致性、至少約95％的一致性，至少約96％的一致性、至少約97％的一致性、至少約98％的一致性，或約99％的一致性的序列的dna分子。在特定的實(shí)施方式中，這種序列可定義為具有基因調(diào)控活性或編碼作用于將可操作連接的多肽定位于細(xì)胞內(nèi)的肽。

調(diào)控元件

調(diào)控元件為具有基因調(diào)控活性的dna分子，即具有影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的能力的dna分子。因此，術(shù)語″基因調(diào)控活性″是指通過影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯而影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的表達(dá)模式的能力。如本文所使用，轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組(exp)可由可操作地連接的表達(dá)元件如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列和內(nèi)含子組成。因此，轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組可包含，例如可操作地連接5′至前導(dǎo)序列的啟動(dòng)子，所述前導(dǎo)序列接著可操作地連接5′至內(nèi)含子序列。所述內(nèi)含子序列可由從天然序列的第一內(nèi)含子/外顯子剪接點(diǎn)的點(diǎn)開始的序列組成，并可進(jìn)一步由包含第二內(nèi)含子/外顯子剪接點(diǎn)的小前導(dǎo)序列片段組成，以提供適當(dāng)?shù)膬?nèi)含子/外顯子加工以促進(jìn)所形成的轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄和適當(dāng)?shù)募庸?。前?dǎo)序列和內(nèi)含子可正面影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄以及所形成的轉(zhuǎn)錄rna的翻譯。所述加工前的rna分子包括可影響轉(zhuǎn)錄的rna的轉(zhuǎn)錄后加工和/或轉(zhuǎn)錄的rna分子從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的輸出的前導(dǎo)序列和內(nèi)含子。繼轉(zhuǎn)錄的rna分子的轉(zhuǎn)錄后加工之后，所述前導(dǎo)序列可以以最終的信使rna部分保留，并可正面影響所述信使rna分子的翻譯。

調(diào)控元件如啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)是具有基因調(diào)控活性以及對(duì)活體細(xì)胞的基因整體表達(dá)充當(dāng)整體部分的dna分子。術(shù)語″調(diào)控元件″是指具有基因調(diào)控活性的dna分子，即具有影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的能力的dna分子。因此，在植物中起作用的分離的調(diào)控元件例如啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列可用于通過遺傳工程方法修飾植物表型。

調(diào)控元件可通過其表達(dá)模式影響(定性地和/或定量地)，例如通過其時(shí)間、空間、發(fā)育、組織、環(huán)境、生理、病理、細(xì)胞周期和/或化學(xué)響應(yīng)的表達(dá)模式和其任意組合以及定量或定性指標(biāo)正向或負(fù)向影響和/或基本的或其它影響進(jìn)行表征。啟動(dòng)子用作調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的表達(dá)的調(diào)控元件。

如本文所使用，″基因表達(dá)模式″為將可操作地連接的dna分子轉(zhuǎn)錄為轉(zhuǎn)錄的rna分子的任何模式?？煞g轉(zhuǎn)錄的rna分子以產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子或可提供反義或其他調(diào)控rna分子，如dsrna、trna、rrna、mirna等。

如本文所使用，術(shù)語″蛋白質(zhì)表達(dá)″為將轉(zhuǎn)錄的rna分子翻譯為蛋白質(zhì)分子的任何模式。蛋白質(zhì)表達(dá)可通過其時(shí)間、空間、發(fā)育或形態(tài)學(xué)特性以及定量或定性指標(biāo)進(jìn)行表征。

如本文所使用，術(shù)語″啟動(dòng)子″通常是指參與識(shí)別和結(jié)合rna聚合酶ii和其它蛋白質(zhì)(反式作用轉(zhuǎn)錄因子)以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的dna分子。啟動(dòng)子可首先從基因的基因組拷貝的5′非翻譯區(qū)(5′utr)分離?？蛇x地，啟動(dòng)子可為合成產(chǎn)生的或操控的dna分子。啟動(dòng)子也可是嵌合的，即通過兩個(gè)或更多個(gè)異源dna分子的融合產(chǎn)生的啟動(dòng)子?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的啟動(dòng)子包括seqidno：2、6、8、10、12、163和169中任一個(gè)，或包含在seqidno：13-199、211和212中任一個(gè)的啟動(dòng)子元件，或它們的片段或變體。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，本文描述的這種分子及其任何變體或衍生物進(jìn)一步定義為包含啟動(dòng)子活性，即能夠在宿主細(xì)胞如在轉(zhuǎn)基因植物中作為啟動(dòng)子。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方式中，片段可定義為顯示由衍生其的起始啟動(dòng)子分子所具有的啟動(dòng)子活性，或片段可包含提供轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)水平的″最小啟動(dòng)子″并由用于識(shí)別和結(jié)合轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)用rna聚合酶ii復(fù)合物的tata盒或等價(jià)序列組成。

在一個(gè)實(shí)施方式中，提供啟動(dòng)子分子的片段。如上所述，啟動(dòng)子片段提供啟動(dòng)子活性，并可單獨(dú)或與其它啟動(dòng)子和啟動(dòng)子片段組合用于例如構(gòu)建嵌合的啟動(dòng)子。在具體實(shí)施方式中，提供了包含具有本文公開的啟動(dòng)子活性的多核苷酸分子的至少約50、95、150、250、500、750或至少約1000個(gè)連續(xù)核苷酸的啟動(dòng)子片段。

可產(chǎn)生衍生自以seqidno：2、6、8、10、12、163和169存在的任何啟動(dòng)子的組合物，或包含在seqidno：13-199、211和212內(nèi)的啟動(dòng)子元件，例如內(nèi)部或5′缺失，以提高或改變表達(dá)，包括通過去除對(duì)表達(dá)具有正向或負(fù)向影響的元件；復(fù)制對(duì)表達(dá)具有正向或負(fù)向影響的元件；和/或復(fù)制或除去對(duì)表達(dá)具有組織或細(xì)胞特異性影響的元件。衍生自以seqidno：2、6、8、10、12、163和169存在的任何啟動(dòng)子的組合物，或包含在seqidno：13-199、211和212內(nèi)的由′3缺失組成的啟動(dòng)子元件，其中去除了所述tata盒元件或其等價(jià)序列和下游序列，例如可用于制備增強(qiáng)子元件?？僧a(chǎn)生進(jìn)一步缺失以去除對(duì)表達(dá)具有正向或負(fù)向影響、組織特異性影響、細(xì)胞特異性影響、或時(shí)機(jī)特異性(例如，但不限于，晝夜節(jié)律)影響的所有元件。以seqidno：2、6、8、10、12、163和169存在的任何啟動(dòng)子，或包含在seqidno：13-199、211和212之內(nèi)的啟動(dòng)子元件，和由它們衍生的片段或增強(qiáng)子，可用于制備嵌合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件組合物，其由以seqidno：2、6、8、10、12、163和169存在的任何啟動(dòng)子，或包含在seqidno：13-199、211和212之內(nèi)的啟動(dòng)子元件以及可操作地連接其它增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的由它們衍生的片段或增強(qiáng)子組成。在本文描述的對(duì)特定轉(zhuǎn)基因的期望表達(dá)方面的修飾、復(fù)制或缺失的功效可通過穩(wěn)定且瞬時(shí)的植物試驗(yàn)如本文工作實(shí)施例中描述的那些憑經(jīng)驗(yàn)測(cè)試，以證實(shí)所述結(jié)果，其可隨所做出的改變和起始分子中改變的目標(biāo)而不同。

如本文所使用，術(shù)語″前導(dǎo)序列″是指從基因的基因組拷貝的5′非翻譯區(qū)(5′utr)分離并且通常定義為在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(tss)與蛋白編碼序列起始位點(diǎn)之間的核苷酸片段的dna分子?；蛘?，前導(dǎo)序列可為合成產(chǎn)生的或操控的dna元件。前導(dǎo)序列可用作調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的表達(dá)的5′調(diào)控元件。前導(dǎo)序列分子可與異源啟動(dòng)子或與它們的天然啟動(dòng)子一起使用。因此，本發(fā)明的啟動(dòng)子分子可以可操作地連接它們的天然前導(dǎo)序列或可以可操作地連接異源前導(dǎo)序列?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的前導(dǎo)序列包括seqidno：3、164、166和170，或包含在seqidno：13-199、211和212中的前導(dǎo)序列元件，或它們的片段或變體。在具體實(shí)施方式中，可提供定義為能夠作為包括例如轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的宿主細(xì)胞中的前導(dǎo)序列的這種序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，這種序列解碼為包含前導(dǎo)序列活性。

以seqidno：3、164、166和170存在的前導(dǎo)序列(5′utr)或包含在seqidno：13-199、211和212中任一個(gè)內(nèi)的前導(dǎo)序列元件可由調(diào)控元件組成，或可采用能夠影響轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。以seqidno：3、164、166和170存在的前導(dǎo)序列或包含在seqidno：13-199、211和212中的前導(dǎo)序列元件可根據(jù)本發(fā)明用于制備影響轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的嵌合的調(diào)控元件。此外，以seqidno：3、164、166和170存在的前導(dǎo)序列或包含在seqidno：13-199、211和212中任一個(gè)內(nèi)的前導(dǎo)序列元件可用于制備影響轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的嵌合的前導(dǎo)序列。

外源基因引入新植物宿主并不總是導(dǎo)致所引入基因的高表達(dá)。此外，如果處理復(fù)雜性狀，有時(shí)必須用空間或時(shí)間上不同的表達(dá)模式調(diào)節(jié)多個(gè)基因。內(nèi)含子可主要提供這種調(diào)節(jié)。然而，已表明同一內(nèi)含子在一種轉(zhuǎn)基因植物中的多種用途呈現(xiàn)出不足。在這些情況下，必須具有一批用于構(gòu)建適當(dāng)重組dna元件的基本控制元件。由于本領(lǐng)域已知的具有表達(dá)增強(qiáng)性的內(nèi)含子的現(xiàn)有集合是有限的，因而需要替代方案。

衍生自以seqidno：4、165和171存在的任何內(nèi)含子或包含在seqidno：13-199、211和212內(nèi)的內(nèi)含子元件的組合物可由順位調(diào)控元件的內(nèi)部缺失或復(fù)制組成；和/或當(dāng)可操作連接啟動(dòng)子+前導(dǎo)序列或嵌合的啟動(dòng)子+前導(dǎo)序列和編碼序列時(shí)，包含內(nèi)含子/外顯子剪接點(diǎn)的5′和3′序列的改變可用于提高表達(dá)或表達(dá)特異性。也可作出進(jìn)行包含內(nèi)含子/外顯子剪接點(diǎn)的5′和3′區(qū)域的改變，以在信使rna的加工和剪接后降低所形成的轉(zhuǎn)錄物中產(chǎn)生的假啟動(dòng)和終止密碼子的引入可能性。可如工作實(shí)施例中所描述憑經(jīng)驗(yàn)測(cè)試所述內(nèi)含子，以測(cè)定所述內(nèi)含子對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的影響。

根據(jù)本發(fā)明，可以分析啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段中已知啟動(dòng)子元件的存在，即dna序列特性，如tata盒和其它已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)基序。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用這種已知啟動(dòng)子元件的識(shí)別來設(shè)計(jì)具有與原始啟動(dòng)子相似的表達(dá)模式的變體。

如本文所使用的，術(shù)語″增強(qiáng)子″或″增強(qiáng)子元件″是指順式作用(cis-acting)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，也就是順式元件，其提供整體表達(dá)模式的一個(gè)方面，但是通常不足以單獨(dú)驅(qū)動(dòng)可操作地連接的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。不同于啟動(dòng)子，增強(qiáng)子元件通常不包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(tss)或tata盒或等價(jià)序列。啟動(dòng)子可以天然包含一個(gè)或多個(gè)影響可操作地連接的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子元件。分離的增強(qiáng)子元件也可與啟動(dòng)子融合以產(chǎn)生嵌合的啟動(dòng)子順式元件，其提供基因表達(dá)的整體調(diào)節(jié)的一方面。啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段可包含一個(gè)或多個(gè)影響可操作地連接的基因的轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子元件。據(jù)信許多啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件結(jié)合dna結(jié)合蛋白和/或影響dna拓?fù)鋵W(xué)，產(chǎn)生選擇性地允許或限制rna聚合酶接觸dna模板或在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)促進(jìn)雙螺旋選擇性打開的局部構(gòu)造。增強(qiáng)子元件可起作用以結(jié)合調(diào)控轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子。一些增強(qiáng)子元件結(jié)合多于一種轉(zhuǎn)錄因子，并且轉(zhuǎn)錄因子可通過不同的親合力與多于一個(gè)增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域相互作用。增強(qiáng)子元件可通過許多技術(shù)進(jìn)行鑒別，包括缺失分析，即從啟動(dòng)子5′端或內(nèi)部缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸；dna結(jié)合蛋白分析，使用dnasei足印法、甲基化干擾、電泳遷移率改變?cè)囼?yàn)、通過連接介導(dǎo)pcr的體內(nèi)基因組足印法和其它常規(guī)試驗(yàn)；或通過使用已知順式元件基序或增強(qiáng)子元件作為靶序列或靶基序和常規(guī)dna序列比較法如blast一起進(jìn)行dna序列相似性分析。增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域的精細(xì)結(jié)構(gòu)可通過一個(gè)或多個(gè)核苷酸的突變(或取代)或通過其它常規(guī)方法進(jìn)一步研究。增強(qiáng)子元件可通過化學(xué)合成獲得，或從包括這種元件的調(diào)控元件中分離獲得，并且它們可與另外的含有有用的限制酶位點(diǎn)的側(cè)翼核苷酸一起合成以促進(jìn)隨后操作。因此，本發(fā)明涵蓋根據(jù)本文公開的用于調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的表達(dá)的方法的增強(qiáng)子元件的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和使用。

在植物中，相對(duì)于缺乏所述內(nèi)含子的構(gòu)建體，在基因構(gòu)建體中包含一些內(nèi)含子導(dǎo)致增加的mrna和蛋白積聚。所述效果已稱作基因表達(dá)的″內(nèi)含子介導(dǎo)的增強(qiáng)″(ime)(mascarenhas等人，(1990)plantmol.biol.15：913-920)。在玉米基因中(例如tuba1、adh1、sh1、ubi1(jeon等人，(2000)plantphysiol.123：1005-1014；callis等人，(1987)genesdev.1：1183-1200；vasil等人，(1989)plantphysiol.91：1575-1579；christiansen等人，(1992)plantmol.biol.18：675-689)和在水稻基因中(例如salt、tpi：mcelroy等人，plantcell2：163-171(1990)；xu等人，plantphysiol.106：459-467(1994))已經(jīng)鑒別已知在植物中刺激表達(dá)的內(nèi)含子。類似地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來自雙子葉植物基因如來自矮牽牛(例如rbcs)、土豆(例如st-ls1)和擬南芥(例如ubq3和pat1)的那些的內(nèi)含子會(huì)提高基因表達(dá)速率(dean等人，(1989)plantcell1：201-208；leon等人，(1991)plantphysiol.95：968-972；norris等人，(1993)plantmolbiol21：895-906；rose和last(1997)plantj.11：455-464)。已經(jīng)證明，在內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)內(nèi)的缺失或突變降低基因表達(dá)，這表明ime可能需要剪接(mascarenhas等人，(1990)plantmolbiol.15：913-920；clancy和hannah，(2002)plantphysiol.130：918-929)。然而，來自擬南芥的pat1基因的剪接位點(diǎn)內(nèi)的點(diǎn)突變已經(jīng)表明，雙子葉植物中某個(gè)ime不需要剪接本身(rose和beliakoff(2000)plantphysiol.122：535-542)。

通過內(nèi)含子的基因表達(dá)增強(qiáng)不是普遍現(xiàn)象，因?yàn)椴迦胫亟M表達(dá)盒的一些內(nèi)含子不能增強(qiáng)表達(dá)(例如來自雙子葉植物基因(來自豌豆的rbcs基因、來自豆子的云扁豆蛋白基因和來自馬鈴薯的stls-1基因)的內(nèi)含子和來自玉米基因(adh1基因第九內(nèi)含子、hsp81基因第一內(nèi)含子)的內(nèi)含子)(chee等人，(1986)gene41：47-57；kuhlemeier等人，(1988)molgengenet212：405-411；mascarenhas等人，(1990)plantmol.biol.15：913-920；sinibaldi和mettler(1992)inwecohn，kmoldave，eds，progressinnucleicacidresearchandmolecularbiology，vol42.academicpress，newyork，pp229-257；vancanneyt等人，1990mol.gen.genet.220：245-250)。因此，不是每種內(nèi)含子均可用于操控轉(zhuǎn)基因植物中非內(nèi)源性基因或內(nèi)源性基因的基因表達(dá)水平。什么特性或具體序列特征必須存在于內(nèi)含子序列以增強(qiáng)給定基因的表達(dá)速率是現(xiàn)有技術(shù)未知的，因此，當(dāng)異源使用時(shí)，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)無法預(yù)測(cè)給定植物內(nèi)含子是否會(huì)引起ime。

如本文所使用，術(shù)語″嵌合的″是指通過將第一dna分子與第二dna分子融合而生成的單個(gè)dna分子，其中第一或第二dna分子通常都不會(huì)在該構(gòu)型、即融合其它的構(gòu)型中發(fā)現(xiàn)。因此，嵌合的dna分子為新的dna分子而不是通常在自然界中發(fā)現(xiàn)的。如本文所使用，術(shù)語″嵌合的啟動(dòng)子″是指通過對(duì)dna分子進(jìn)行這種操作而生成的啟動(dòng)子。嵌合的啟動(dòng)子可以結(jié)合兩種或更多種dna片段；實(shí)例是啟動(dòng)子與增強(qiáng)子元件的融合。因此，本發(fā)明涵蓋根據(jù)本文公開的用于調(diào)控可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的表達(dá)的方法的嵌合的啟動(dòng)子的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和使用。

如本文所使用，術(shù)語″變體″是指與第一dna分子組成相似但不相同的第二dna分子，而第二dna分子還保持常規(guī)功能性，即與第一dna分子具有相同或相似的表達(dá)模式。變體可以是第一dna分子的較短或截短形式和/或第一dna分子序列的變化形式，如具有不同的限制性酶位點(diǎn)和/或內(nèi)部缺失、取代和/或插入的dna分子?！遄凅w″還可以包括具有包含參考序列的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失和/或插入的核苷酸序列的調(diào)控元件，其中所述衍生的調(diào)控元件具有比相應(yīng)母體調(diào)控分子更強(qiáng)或更弱或相等的轉(zhuǎn)錄或翻譯活性。所述調(diào)控元件″變體″還可涵蓋由天然存在于細(xì)菌和植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的突變引起的變體。在本發(fā)明中，以seqidno：1-199、211和212提供的多核苷酸序列可用于生成與原始調(diào)控元件的多核苷酸序列組成相似但不相同的變體，而它們還保持常規(guī)功能性，即與原始的調(diào)控元件相同或相似的表達(dá)模式。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本公開熟知本發(fā)明的這種變體的生成，其包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。嵌合的調(diào)控元件的″變體″包含與參考嵌合的調(diào)控元件序列相同的組成元件，但可通過本領(lǐng)域已知的各種方法如限制酶消化和連接、不依賴于克隆的連接、擴(kuò)增過程中的pcr產(chǎn)物的模塊式組裝、或嵌合的調(diào)控元件的直接化學(xué)合成以及本領(lǐng)域已知的其它方法，可操作地連接包含所述嵌合的調(diào)控元件的組成元件。所形成的″變體″嵌合的調(diào)控元件由與所述參考序列相同但在用于可操作地連接所述組成元件的一條或多條序列方面不同的組成元件或其變體組成。在本發(fā)明中，以seqidno：1-199、211和212提供的多核苷酸序列各自提供參考序列，其中所述參考序列的組成元件可通過本領(lǐng)域已知的方法連接，并且可由天然存在于細(xì)菌和植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的一個(gè)或多個(gè)核苷酸或突變的取代、缺失和/或插入組成。

構(gòu)建體

如本文所使用，術(shù)語″構(gòu)建體″是指衍生自任何來源、能夠進(jìn)行基因組整合或自主復(fù)制、包含多核苷酸分子(其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸分子已經(jīng)以功能性操作方式連接，即可操作地連接)的任何重組多核苷酸分子，如質(zhì)粒、粘粒、病毒、自主復(fù)制多核苷酸分子、噬菌體，或線狀或環(huán)狀單鏈或雙鏈dna或rna多核苷酸分子。如本文所使用，術(shù)語″載體″是指任何可用于轉(zhuǎn)化目的(即將異源dna引入宿主細(xì)胞)的重組多核苷酸構(gòu)建體。所述術(shù)語包括從任何上述分子分離的表達(dá)盒。

如本文所使用的，術(shù)語″可操作地連接″是指第一分子連接到第二分子，其中所述分子如此排列以使第一分子影響第二分子的功能。所述兩個(gè)分子可以是或不是單個(gè)連續(xù)分子的一部分，并且可以相鄰或不相鄰。例如，如果啟動(dòng)子調(diào)節(jié)細(xì)胞中目標(biāo)可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子可操作地連接可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。例如，當(dāng)前導(dǎo)序列能夠用作編碼序列編碼的多肽的前導(dǎo)序列時(shí)，其可操作地連接所述編碼序列。

在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的構(gòu)建體可以以雙ti質(zhì)粒邊界(border)dna構(gòu)建體提供，其具有從包含t-dna的根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)分離的ti質(zhì)粒的右邊界(rb或agrtu.rb)和左邊界(lb或agrtu.lb)區(qū)域，連同根癌土壤桿菌細(xì)胞提供的轉(zhuǎn)化分子一起，允許t-dna整合至植物細(xì)胞的基因組中(參見，例如，美國專利6,603,061)。構(gòu)建體也可包含在細(xì)菌細(xì)胞中提供復(fù)制功能和抗生素選擇性的質(zhì)粒骨架dna片段，例如，大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)如ori322、寬宿主范圍復(fù)制起點(diǎn)如oriv或oriri，以及編碼tn7氨基糖苷腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(aminoglycosideadenyitransferase)(aada)提供對(duì)壯觀霉素或鏈霉素耐藥性的可選擇標(biāo)記如spec/strp或者慶大霉素(gm，gent)可選擇標(biāo)記基因的編碼區(qū)。對(duì)于植物的轉(zhuǎn)化，宿主細(xì)菌菌株通常為根癌土壤桿菌abi、c58或lba4404；然而，植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域已知的其它菌株可以在本發(fā)明中起作用。

以將可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子轉(zhuǎn)錄為翻譯和表達(dá)為蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能性mrna分子的方式，將構(gòu)建體組裝和引入細(xì)胞中的方法是已知的。對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施，制備和使用構(gòu)建體和宿主細(xì)胞的常規(guī)組合物和方法可參見，例如，molecularcloning：alaboratorymanual，3rdeditionvolumes1，2和3(2000)j.f.sambrook，d.w.russell和n.irwin，coldspringharborlaboratorypress。制備特別適合于植物轉(zhuǎn)化的重組載體的方法包括但不限于，以其整體描述在美國專利4,971,908、4,940,835、4,769,061和4,757,011中的那些。這些類型的載體也已在科學(xué)文獻(xiàn)中綜述過(參見，例如，rodriguez等人，vectors：asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses，butterworths，boston，(1988)和glick等人，methodsinplantmolecularbiologyandbiotechnology，crcpress，bocaraton，fl.(1993))。用于在高等植物中表達(dá)核酸的典型載體是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括衍生自根癌土壤桿菌的腫瘤誘導(dǎo)(ti)質(zhì)粒的載體(rogers等人，methodsinenzymology，153：253-277(1987))。用于植物轉(zhuǎn)化的包括pcamvcn轉(zhuǎn)化控制載體的其它重組載體也已經(jīng)描述在科學(xué)文獻(xiàn)中(參見，例如，fromm等人，proc.natl.acad.sc1.usa，82：5824-5828(1985))。

包括本文提供的任何那些構(gòu)建體可包括不同的調(diào)控元件。任何這種調(diào)控元件可與其它調(diào)控元件組合提供。可設(shè)計(jì)或修改這種組合以產(chǎn)生所期望的調(diào)控特性。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的構(gòu)建體包含至少一個(gè)可操作地連接可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的調(diào)控元件，所述可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子可操作地連接3′轉(zhuǎn)錄終止分子。

本發(fā)明的構(gòu)建體可包括本文提供的或本領(lǐng)域已知的任何啟動(dòng)子或前導(dǎo)序列。例如，本發(fā)明的啟動(dòng)子可以可操作地連接異源非翻譯5′前導(dǎo)序列，例如衍生自熱休克蛋白基因的異源非翻譯5′前導(dǎo)序列(參見，例如，美國專利號(hào)5,659,122和5,362,865)?？蛇x地，本發(fā)明的前導(dǎo)序列可以可操作地連接異源啟動(dòng)子如花椰菜花葉病毒35s轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(參見，美國專利號(hào)5,352,605)。異源元件的這種可操作的連接賦予的表達(dá)特性不必然是每個(gè)啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列所闡明特性的疊加，而是通過可操作地連接的異源啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列驅(qū)動(dòng)的表達(dá)的經(jīng)驗(yàn)分析來確定。

如本文所使用，術(shù)語″內(nèi)含子″是指可從基因的基因組拷貝中分離或鑒別、并且通?？啥x為翻譯前在mrna加工期間剪接出的區(qū)域的dna分子?；蛘?，內(nèi)含子可為合成產(chǎn)生的或操控的dna元件。內(nèi)含子可包含影響可操作地連接的基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子元件。內(nèi)含子可用作調(diào)控元件以調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的表達(dá)。dna構(gòu)建體可包含內(nèi)含子，所述內(nèi)含子與可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子序列可以是或者不是異源的。本領(lǐng)域的內(nèi)含子的實(shí)例包括水稻肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子(美國專利號(hào)5,641,876)以及玉米hsp70內(nèi)含子(美國專利號(hào)5,859,347)。對(duì)實(shí)施本發(fā)明有用的內(nèi)含子包括seqidno：4、165和171或包含在seqidno：13-199、211和212中任一個(gè)之內(nèi)的內(nèi)含子元件。

如本文所使用，術(shù)語″3′轉(zhuǎn)錄終止分子″或″3′utr″是指在轉(zhuǎn)錄期間用于生成mrna分子3′非翻譯區(qū)(3′utr)的dna分子。mrna分子的3′非翻譯區(qū)可通過特定的切割和3′多腺苷酸化(即聚a尾)產(chǎn)生。3′utr可以可操作地連接至和位于可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的下游，并且可包括提供多腺苷酸化信號(hào)和其它能夠影響轉(zhuǎn)錄、mrna加工或基因表達(dá)的調(diào)控信號(hào)的多核苷酸。聚a尾被認(rèn)為在mrna穩(wěn)定性和啟動(dòng)翻譯中起作用。3′轉(zhuǎn)錄終止分子的實(shí)例為胭脂堿合酶3′區(qū)域(參見，fraley等人，proc.natl.acad.scl.usa，80：4803-4807(1983))；小麥hspl73′區(qū)域；豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基3′區(qū)域；棉花e63′區(qū)域(美國專利6,096,950)；wo0011200a2中公開的3′區(qū)域；以及薏苡醇溶蛋白3′utr(美國專利號(hào)6,635,806)。

3′utr通常發(fā)現(xiàn)用于特定基因重組表達(dá)的有利用途。在動(dòng)物系統(tǒng)中，3′utr的機(jī)制已經(jīng)完全明確(例如zhao等人，microbiolmolbiolrev63：405-445(1999)；proudfoot，nature322：562-565(1986)；kim等人，biotechnologyprogress19：1620-1622(2003)；yonaha和proudfoot，emboj.19：3770-3777(2000)；cramer等人，febsletters498：179-182(2001)；kuerstem和goodwin，naturereviewsgenetics4：626-637(2003))。為了防止不需要的性狀無關(guān)的(下游)序列的轉(zhuǎn)錄(其會(huì)干涉性狀的表現(xiàn))，要求rna轉(zhuǎn)錄的有效終止。與無關(guān)的插入相比，在彼此局部鄰近中(例如在一個(gè)t-dna內(nèi))多基因表達(dá)盒的排列可導(dǎo)致對(duì)所述構(gòu)建體內(nèi)一個(gè)或多個(gè)基因的基因表達(dá)的抑制(padidam和cao，biotechniques31：328-334(2001))。例如在期望來自所有盒的強(qiáng)烈基因表達(dá)的情況下，這會(huì)妨礙實(shí)現(xiàn)足夠的表達(dá)水平。

在植物中，明確定義的多腺苷酸化信號(hào)序列是未知的。hasegawa等人，plantj.33：1063-1072，(2003)不能鑒別在林煙草(nicotianasylvestris)中體外和體內(nèi)系統(tǒng)中保守的多腺苷酸化信號(hào)序列并測(cè)定一級(jí)(非多腺苷酸化的)轉(zhuǎn)錄物的實(shí)際長(zhǎng)度。弱的3′utr具有產(chǎn)生通讀的可能性，這可影響位于相鄰表達(dá)盒中的基因表達(dá)(padidam和cao，biotechniques31：328-334(2001))。轉(zhuǎn)錄終止的適當(dāng)控制可以防止位于下游的序列(例如其它表達(dá)盒)中的通讀(read-through)，并可以進(jìn)一步允許rna聚合酶的有效再循環(huán)，從而提高基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄的有效終止(來自dna的rna聚合酶釋放)對(duì)于轉(zhuǎn)錄的再啟動(dòng)是必須的，并由此直接影響整個(gè)轉(zhuǎn)錄物水平。轉(zhuǎn)錄終止之后，從細(xì)胞質(zhì)的合成和模板位點(diǎn)釋放成熟的mrna。真核mrna以多(a)形式在體內(nèi)積聚，因此難以通過常規(guī)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄的終止位點(diǎn)。然而，通過生物信息學(xué)方法的功能和有效3′utr的預(yù)測(cè)是困難的，因?yàn)椴淮嬖谑褂行?′utr容易預(yù)測(cè)的保守的序列。

從實(shí)踐的觀點(diǎn)，在轉(zhuǎn)基因盒中使用的3′utr具有下述特征通常是有利的。3′utr將能高效且有效地終止轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄并防止轉(zhuǎn)錄物通讀任何相鄰dna序列中或t-dna已經(jīng)插入的相鄰染色體的dna，如在多個(gè)盒殘留在一個(gè)t-dna中的情況下，所述相鄰dna序列可由另一轉(zhuǎn)基因盒組成。所述3′utr不應(yīng)引起用于驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列和內(nèi)含子賦予的轉(zhuǎn)錄活性的降低。在植物生物工藝學(xué)中，所述3′utr通常用于啟動(dòng)從所述轉(zhuǎn)化的植物提取的反轉(zhuǎn)錄rna的擴(kuò)增反應(yīng)，并用于(1)評(píng)估曾經(jīng)整合入所述植物染色體的轉(zhuǎn)基因盒的轉(zhuǎn)錄活性或表達(dá)；(2)評(píng)估所述植物dna內(nèi)插入的拷貝數(shù)；和(3)評(píng)估育種后所形成的種子的接合性。所述3′utr也用于從所轉(zhuǎn)化的植物中提取的dna的擴(kuò)增反應(yīng)，以表征所插入的盒的完整性。

可基于由從衍生自小米(setariaitalica(l.)beauv)的種子、花和其它組織分離的信使rna構(gòu)成的cdna文庫中表達(dá)的序列標(biāo)簽(est)的表達(dá)鑒別對(duì)在植物中提供轉(zhuǎn)基因表達(dá)有用的3′utr。cdna文庫由使用花組織、種子、葉和根從所選擇的植物品種分離的組織構(gòu)成。使用不同的測(cè)序方法測(cè)序所得到的cdna。使用生物信息學(xué)軟件如clc_ref_assemble_complete版2.01.37139(clcbiousa，cambridge，massachusetts02142)，將所得到的est組裝成簇。通過計(jì)數(shù)每個(gè)簇的cdna讀取數(shù)目來測(cè)定每個(gè)簇的轉(zhuǎn)錄物豐度。所識(shí)別的3′utr可以由衍生自cdna序列以及衍生自基因組dna的序列組成。cdna序列用于設(shè)計(jì)引物，其然后與按照制造商的方案構(gòu)建的genomewalker^tm(clontechlaboratories，inc，mountainview，ca)文庫一起用于克隆相應(yīng)基因組dna序列的3′區(qū)域，以提供較長(zhǎng)的終止序列。通過每個(gè)組織文庫觀察到的序列讀取的直接計(jì)數(shù)或標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)數(shù)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄物豐度分析可用于推斷關(guān)于表達(dá)模式的特性。例如，與葉相反，可在根組織中觀察到的較高豐度的轉(zhuǎn)錄物中發(fā)現(xiàn)一些3′utr。這表明所述轉(zhuǎn)錄物在根中高度表達(dá)，且根表達(dá)的所述特性可歸因于啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、內(nèi)含子或3′utr的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。根據(jù)在特定器官、組織或細(xì)胞類型內(nèi)表達(dá)的所述特性鑒別3′utr的經(jīng)驗(yàn)性測(cè)試可導(dǎo)致在那些特定器官、組織或細(xì)胞類型中增強(qiáng)表達(dá)的3′utr的鑒別。

構(gòu)建體和載體也可包括表達(dá)連接的肽類的轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列，所述連接的肽用于將蛋白質(zhì)產(chǎn)物靶向特別是葉綠體、白色體或其它質(zhì)體細(xì)胞器；線粒體；過氧化物酶體；液泡或細(xì)胞外部位。使用葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的描述，參見美國專利號(hào)5,188,642和美國專利號(hào)5,728,925。許多葉綠體-定位(chloroplast-localized)蛋白質(zhì)從核基因中表達(dá)為前體，并且通過葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(ctp)靶向葉綠體。這種分離的葉綠體蛋白質(zhì)的實(shí)例包括但不限于，在美國專利號(hào)7,193,133中描述的與核酮糖-1，5，-二磷酸羧化酶的小亞基(ssu)、鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白氧化還原酶、捕光復(fù)合物蛋白i和蛋白ii、硫氧還蛋白f、烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合成酶(epsps)和轉(zhuǎn)運(yùn)肽類相關(guān)的那些。已在體內(nèi)和體外證明，通過使用與異源ctp的蛋白質(zhì)融合可將非-葉綠體蛋白質(zhì)靶向葉綠體，并且所述ctp足以將蛋白質(zhì)靶向葉綠體。適合的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽如擬南芥epspsctp(ctp2)(參見，klee等人，mol.gen.genet.，210：437-442(1987))或矮牽牛epspsctp(ctp4)(參見，della-cioppa等人，proc.natl.acad.sc1.usa，83：6873-6877(1986)))的引入已顯示在轉(zhuǎn)基因植物中將異源epsps蛋白質(zhì)序列靶向葉綠體(參見，美國專利號(hào)5,627,061、5,633,435和5,312,910以及ep0218571、ep189707、ep508909和ep924299)。

可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子

如本文所使用，術(shù)語″可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子″是指任何能夠被轉(zhuǎn)錄為rna分子的dna分子，包括但不限于具有蛋白質(zhì)編碼序列的那些以及生成具有用于基因抑制的序列的rna分子的那些。″轉(zhuǎn)基因″是指至少相對(duì)于其在基因組中的位置與宿主細(xì)胞異源的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子和/或人工引入目前或任何先代細(xì)胞中宿主細(xì)胞基因組的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。

本發(fā)明的啟動(dòng)子可以可操作地連接相對(duì)于啟動(dòng)子分子為異源的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。如本文所使用，術(shù)語″異源的″是指當(dāng)這種組合通常不存在于自然界時(shí)兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸分子的組合。例如，兩個(gè)分子可衍生自不同物種和/或兩個(gè)分子可衍生自不同基因，例如，來自相同物種的不同基因或來自不同物種的相同基因。因此，如果這種組合通常不存在于自然界，則啟動(dòng)子相對(duì)于可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子為異源的，即所述可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子與所述啟動(dòng)子分子的組合不是天然存在的可操作地連接的。

可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子通?？蔀楸磉_(dá)rna轉(zhuǎn)錄物所需的任何dna分子。rna轉(zhuǎn)錄物的這種表達(dá)可導(dǎo)致所得到的mrna分子的翻譯以及蛋白質(zhì)的表達(dá)。可選地，例如，可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子可設(shè)計(jì)為最終引起特定基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)降低。在一個(gè)實(shí)施方式中，這可通過使用以反義方向定向的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子來實(shí)現(xiàn)。簡(jiǎn)而言之，當(dāng)轉(zhuǎn)錄反義可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子時(shí)，rna產(chǎn)物在細(xì)胞中與互補(bǔ)rna分子雜交并且隔離(sequesters)互補(bǔ)rna分子。這種雙螺旋rna分子不能通過細(xì)胞的翻譯機(jī)制翻譯為蛋白質(zhì)，并且在細(xì)胞中降解?？梢赃@種方式負(fù)性調(diào)控任何基因。

因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是本發(fā)明的調(diào)控元件，例如以seqidno：1-199、211和212提供的那些，其可操作地連接可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子，使得當(dāng)將所述構(gòu)建體引入植物細(xì)胞的基因組中時(shí)以期望水平或以期望模式調(diào)控可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施方式中，可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子包含基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，并且啟動(dòng)子影響被翻譯和表達(dá)為蛋白質(zhì)產(chǎn)物的rna分子的轉(zhuǎn)錄。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子包含基因的反義區(qū)域，并且啟動(dòng)子影響反義rna分子、雙鏈rna或其它相似抑制性rna分子的轉(zhuǎn)錄以抑制靶宿主細(xì)胞中目的特定rna分子的表達(dá)。

農(nóng)學(xué)目的基因

可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子可以是農(nóng)學(xué)目的基因。如本文所使用，術(shù)語″農(nóng)學(xué)目的基因″是指當(dāng)在特定的植物組織、細(xì)胞或細(xì)胞類型中表達(dá)時(shí)賦予與植物形態(tài)、生理、生長(zhǎng)、發(fā)育、產(chǎn)量、產(chǎn)物、營養(yǎng)分布、疾病或抗害蟲性和/或環(huán)境或化學(xué)耐受性相關(guān)的期望特征的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。農(nóng)學(xué)目的基因包括，但不限于，編碼產(chǎn)量蛋白、應(yīng)激抗性蛋白、發(fā)育控制蛋白、組織分化蛋白、分生組織蛋白、環(huán)境響應(yīng)蛋白、衰老蛋白、激素響應(yīng)蛋白、脫落蛋白(abscissionprotein)、來源蛋白、sink蛋白、花控制蛋白、種子蛋白、除草劑抗性蛋白、疾病抗性蛋白、脂肪酸生物合成酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、殺蟲蛋白或例如靶向抑制特定基因的反義或rnai分子的任何其它試劑的那些基因。農(nóng)學(xué)目的基因的產(chǎn)物可在植物內(nèi)起作用以影響植物生理或代謝，或可作為以植物為食的害蟲的食物的殺蟲劑起作用。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，將本發(fā)明的啟動(dòng)子引入構(gòu)建體中，以使啟動(dòng)子可操作地連接作為農(nóng)學(xué)目的基因的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。為了賦予農(nóng)學(xué)有益性狀，農(nóng)學(xué)目的基因的表達(dá)是所期望的。有益農(nóng)學(xué)性狀可以是例如，但不限于，除草劑耐受性、昆蟲控制、改良的產(chǎn)量、真菌疾病抗性、病毒抗性、線蟲抗性、細(xì)菌疾病抗性、植物生長(zhǎng)和發(fā)育、淀粉生產(chǎn)、改良的油生產(chǎn)、高的油生產(chǎn)、改良的脂肪酸含量、高的蛋白質(zhì)生產(chǎn)、果實(shí)成熟、提高的動(dòng)物和人類營養(yǎng)、生物聚合物、環(huán)境壓力抗性、藥用肽和可分泌肽、改良的加工性狀、改良的消化性、酶生產(chǎn)、味道、固氮、雜交制種、纖維生產(chǎn)和生物燃料生產(chǎn)。農(nóng)學(xué)目的基因的實(shí)例包括具有除草劑抗性(美國專利號(hào)6,803,501、6,448,476、6,248,876、6,225,114、6,107,549、5,866,775、5,804,425、5,633,435、和5,463,175)、提高的產(chǎn)量(美國專利號(hào)usre38,446、6,716,474、6,663,906、6,476,295、6,441,277、6,423,828、6,399,330、6,372,211、6,235,971、6,222,098和5,716,837)、昆蟲控制(美國專利號(hào)6,809,078、6,713,063、6,686,452、6,657,046、6,645,497、6,642,030、6,639,054、6,620,988、6,593,293、6,555,655、6,538,109、6,537,756、6,521,442、6,501,009、6,468,523、6,326,351、6,313,378、6,284,949、6,281,016、6,248,536、6,242,241、6,221,649、6,177,615、6,156,573、6,153,814、6,110,464、6,093,695、6,063,756、6,063,597、6,023,013、5,959,091、5,942,664、5,942,658、5,880,275、5,763,245和5,763,241)、真菌疾病抗性(美國專利號(hào)6,653,280、6,573,361、6,506,962、6,316,407、6,215,048、5,516,671、5,773,696、6,121,436、6,316,407和6,506,962)、病毒抗性(美國專利號(hào)6,617,496、6,608,241、6,015,940、6,013,864、5,850,023和5,304,730)、線蟲抗性(美國專利號(hào)6,228,992)、細(xì)菌疾病抗性(美國專利號(hào)5,516,671)、植物生長(zhǎng)和發(fā)育(美國專利號(hào)6,723,897和6,518,488)、淀粉生產(chǎn)(美國專利號(hào)6,538,181、6,538,179、6,538,178、5,750,876、6,476,295)、改良的油生產(chǎn)(美國專利號(hào)6,444,876；6,426,447和6,380,462)、高的油生產(chǎn)(美國專利號(hào)6,495,739、5,608,149、6,483,008和6,476,295)、改良的脂肪酸含量(美國專利號(hào)6,828,475、6,822,141、6,770,465、6,706,950、6,660,849、6,596,538、6,589,767、6,537,750、6,489,461和6,459,018)、高的蛋白質(zhì)生產(chǎn)(美國專利號(hào)6,380,466)、果實(shí)成熟(美國專利號(hào)5,512,466)、提高的動(dòng)物和人類營養(yǎng)(美國專利號(hào)6,723,837、6,653,530、6,5412,59、5,985,605和6,171,640)、生物聚合物(美國專利號(hào)usre37,543、6,228,623、5,958,745和6,946,588)、環(huán)境壓力抗性(美國專利號(hào)6,072,103)、藥用肽和可分泌肽(美國專利號(hào)6,812,379、6,774,283、6,140,075和6,080,560)、改良的加工性狀(美國專利號(hào)6,476,295)、改良的消化性(美國專利號(hào)6,531,648)、低棉子糖(美國專利號(hào)6,166,292)、工業(yè)酶生產(chǎn)(美國專利號(hào)5,543,576)、改良的味道(美國專利號(hào)6,011,199)、固氮(美國專利號(hào)5,229,114)、雜交制種(美國專利號(hào)5,689,041)、纖維生產(chǎn)(美國專利號(hào)6,576,818、6,271,443、5,981,834和5,869,720)和生物燃料生產(chǎn)(美國專利號(hào)5,998,700)。

可選地，農(nóng)學(xué)目的基因可以通過編碼引起內(nèi)源基因的基因表達(dá)的靶向調(diào)節(jié)的rna分子而影響上述的植物特性或表型，例如通過反義(參見，例如，美國專利5,107,065)、抑制性rna(″rnai″，包括通過mirna-、sirna-、反式作用sirna-和相控srna-介導(dǎo)機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)，例如，如公開的申請(qǐng)us2006/0200878和us2008/0066206和美國專利申請(qǐng)11/974,469中所描述的)，或共抑制-介導(dǎo)機(jī)制。rna也可以是經(jīng)工程化以切割期望的內(nèi)源性mrna產(chǎn)物的催化的rna分子(例如，核酶或核糖開關(guān)；參見例如，us2006/0200878)。因此，任何編碼影響農(nóng)學(xué)重要表型或目的形態(tài)學(xué)變化的轉(zhuǎn)錄rna分子的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子可用于實(shí)施本發(fā)明。通過將可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子轉(zhuǎn)錄為能夠引起基因抑制的分子的方式，構(gòu)建構(gòu)建體并將構(gòu)建體引入細(xì)胞內(nèi)的方法在本領(lǐng)域是已知的。例如，在植物細(xì)胞中使用構(gòu)建體和反義定向的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子以調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因抑制在美國專利號(hào)5,107,065和5,759,829中公開，并且在植物中使用構(gòu)建體和有義定向的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子以調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因抑制在美國專利號(hào)5,283,184和5,231,020中公開。在植物細(xì)胞中表達(dá)可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸也可用于抑制食用植物細(xì)胞的植物害蟲，例如，從鞘翅目害蟲分離的組合物(美國專利公開號(hào)us20070124836)和從線蟲害蟲分離的組合物(美國專利公開號(hào)us20070250947)。植物害蟲包括，但不限于節(jié)肢類害蟲、線蟲害蟲和真菌或微生物害蟲。引入本發(fā)明的構(gòu)建體的示例性的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子包括，例如，來自不同于靶物種的物種的dna分子或基因，或起始于或存在于相同物種但通過遺傳工程方法而不是傳統(tǒng)的繁殖或育種技術(shù)而引入受體細(xì)胞中的基因。多核苷酸分子的類型包括但不限于，已經(jīng)存在于植物細(xì)胞中的多核苷酸分子、來自另一種植物的多核苷酸分子、來自不同生物體的多核苷酸分子或外部產(chǎn)生的多核苷酸分子，例如含有基因反義消息的多核苷酸分子，或編碼人工、合成或另外的改良形式的轉(zhuǎn)基因的多核苷酸分子。

可選擇性標(biāo)記

如在本文中所用，術(shù)語″標(biāo)記″是指其表達(dá)或不表達(dá)可以以某種方式篩選或評(píng)分的任何可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。用于實(shí)施本發(fā)明的標(biāo)記基因包括但不限于，編碼β-葡萄糖醛酸酶(在美國專利號(hào)5,599,670中描述的gus)、綠色熒光蛋白及其變體(在美國專利號(hào)5,491,084和6,146,826中描述的gfp)、賦予抗生素耐藥性的蛋白質(zhì)或賦予除草劑耐受性的蛋白質(zhì)的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子?？捎玫目股啬退幮詷?biāo)記包括編碼賦予卡那霉素(nptii)、潮霉素b(aphiv)、鏈霉素或壯觀霉素(aad，spec/strep)和慶大霉素(aac3和aacc4)耐藥性的蛋白質(zhì)的那些標(biāo)記。已證實(shí)轉(zhuǎn)基因植物耐受性并且可應(yīng)用本發(fā)明方法的除草劑包括但不限于：氨基-甲基-膦酸、草甘膦、草胺膦(glufosinate)、磺酰脲、咪唑啉酮、溴苯腈、delapon、麥草畏、環(huán)己二酮、原卟啉原氧化酶抑制劑和異噁唑草酮(isoxafiutole)除草劑。編碼涉及除草劑耐受性的蛋白質(zhì)的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子包括，但不限于，編碼5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(在美國專利號(hào)5,627,061、5,633,435、6,040,497和5,094,945中描述的用于草甘膦耐受性的epsps)的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子；編碼草甘膦氧化還原酶和草甘膦-n-乙?；D(zhuǎn)移酶(在美國專利號(hào)5,463,175中描述的gox、在美國專利公開號(hào)20030083480中描述的gat，和美國專利公開號(hào)20030135879中的麥草畏單加氧酶)的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子；編碼溴苯腈腈水解酶(在美國專利號(hào)4,810,648中描述的用于溴苯腈耐受性的bxn)的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子；在misawa等人，plantjournal4：833-840(1993)和misawa等人，plantjournal6：481-489(1994)中描述的用于達(dá)草滅耐受性的編碼八氫番茄紅素去飽和酶(crti)的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子；在sathasiivan等人，nucl.acidsres.18：2188-2193(1990)中描述的用于磺酰脲類除草劑耐受性的編碼乙酰羥基酸合成酶(ahas，也就是als)的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子；以及在deblock等人，emboembojournal6：2513-2519(1987)中描述的用于草胺膦和雙丙氨磷耐受性的bar基因。本發(fā)明的啟動(dòng)子分子可表達(dá)連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子，其編碼草胺膦(phosphinothricin)乙?；D(zhuǎn)移酶、草甘膦抗性epsps、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶、羥苯基丙酮酸脫氫酶、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、茅草枯脫鹵素酶、溴苯腈抗性腈水解酶、鄰氨基苯甲酸酯合成酶、芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶、乙酰輔酶a羧化酶、草甘膦氧化還原酶和草甘膦-n-乙?；D(zhuǎn)移酶。

包括在術(shù)語″可選擇性標(biāo)記″中的還有編碼可分泌的標(biāo)記的基因，其分泌可作為鑒別或選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的手段。實(shí)例包括編碼可通過抗體相互作用鑒別的可分泌的抗原的標(biāo)記或甚至編碼可催化檢測(cè)的可分泌酶的標(biāo)記?？蛇x擇的分泌的標(biāo)記蛋白質(zhì)分為幾種類型，包括可檢測(cè)的(例如通過elisa)小的可擴(kuò)散的蛋白質(zhì)、可在胞外溶液中檢測(cè)到的小的活性酶(例如，α-淀粉酶、β-內(nèi)酰胺酶、草胺膦轉(zhuǎn)移酶)或插入或陷入細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)(例如包括在例如延伸表達(dá)單元中發(fā)現(xiàn)的前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)或者又稱為煙草pr-s的與煙草致病相關(guān)的蛋白質(zhì))。其它可能的可選擇性標(biāo)記基因?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的并且涵蓋在本發(fā)明中。

細(xì)胞轉(zhuǎn)化

本發(fā)明還涉及生產(chǎn)包含可操作地連接可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和植物的方法。

術(shù)語″轉(zhuǎn)化″是指將核苷酸引入受體宿主。如本文所使用，術(shù)語″宿主″是指細(xì)菌、真菌或植物，包括細(xì)菌、真菌或植物的任何細(xì)胞、組織、器官或后代。特定的目標(biāo)植物組織和細(xì)胞包括原生質(zhì)體、愈傷組織、根、塊莖、種子、莖、葉、幼苗、胚芽和花粉。

如本文所使用，術(shù)語″轉(zhuǎn)化的″是指已引入外源多核苷酸分子如構(gòu)建體的細(xì)胞、組織、器官或生物體。引入的多核苷酸分子可被整合至受體細(xì)胞、組織、器官或生物體的基因組dna，因此引入的多核苷酸分子由后續(xù)的后代繼承。″轉(zhuǎn)基因的″或″轉(zhuǎn)化的″細(xì)胞或生物體還包括細(xì)胞或生物體的后代，以及由使用這種轉(zhuǎn)基因生物體作為母代雜交并顯示由外源多核苷酸分子的存在所引起的改變的表型的育種程序生成的后代。術(shù)語″轉(zhuǎn)基因″是指含有一個(gè)或多個(gè)異源多核苷酸分子的細(xì)菌、真菌或植物。

存在許多將多核苷酸分子引入植物細(xì)胞的方法。所述方法通常包括選擇合適的宿主細(xì)胞、使用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以及獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的步驟。合適的方法包括細(xì)菌感染(例如土壤桿菌屬)、二元細(xì)菌人工染色體載體、dna的直接遞送(例如，通過peg-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)、干燥/抑制-介導(dǎo)的dna攝取、電穿孔、用碳化硅纖維攪拌以及dna涂層顆粒的加速等(在potrykus等人，ann.rev.plantphysiol.plantmol.biol.，42：205(1991)中綜述)。

任何轉(zhuǎn)化方法均可以用于用本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子和/或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是諸如植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞、藻類、真菌細(xì)胞、真菌、細(xì)菌細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞的任何細(xì)胞或生物體。優(yōu)選的宿主和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞包括來自于植物、曲霉屬(aspergillus)、酵母、昆蟲、細(xì)菌和藻類的細(xì)胞。

再生的轉(zhuǎn)基因植物可以自花授粉以提供純合的轉(zhuǎn)基因植物。可選地，從再生的轉(zhuǎn)基因植物獲得的花粉可與非轉(zhuǎn)基因植物，優(yōu)選農(nóng)學(xué)重要物種的自交系雜交。通常用于不同性狀和作物的育種方法的描述可見于幾本參考書之一，參見，例如，allard，principlesofplantbreeding，johnwiley&sons，ny，u.ofca，davis，ca，50-98(1960)；simmonds，principlesofcropimprovement，longman，inc.，ny，369-399(1979)；sneep和hendriksen，plantbreedingperspectives，wageningen(ed)，centerforagriculturalpublishinganddocumentation(1979)；fehr，soybeans：improvement，productionanduses，2ndedition，monograph，16：249(1987)；fehr，principlesofvarietydevelopment，theoryandtechnique，(vol.1)andcropspeciessoybean(vol2)，iowastateuniv.，macmillanpub.co.，ny，360-376(1987)。相反地，來自非轉(zhuǎn)基因植物的花粉可用于為再生的轉(zhuǎn)基因植物授粉。

可以分析轉(zhuǎn)化的植物的目標(biāo)基因的存在以及本發(fā)明調(diào)控元件所賦予的表達(dá)水平和/或分布。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解許多可用于分析轉(zhuǎn)化植物的方法。例如，植物分析方法包括，但不限于southern印跡法或northern印跡法、基于pcr的方法、生化分析、表型篩選法、現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估以及免疫診斷試驗(yàn)?？赊D(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的表達(dá)可用(appliedbiosystems，fostercity，ca)試劑和制造商描述的方法和使用testingmatrix測(cè)定的pcr周期時(shí)間來測(cè)量?；蛘撸?imgfile="bda0001254334910000263.gif"wi="259"he="55"img-content="drawing"img-format="gif"orientation="portrait"inline="no"/>(thirdwavetechnologies，madison，wi)試劑和制造商描述的方法可用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)。

本發(fā)明的植物的種子可從能繁殖的轉(zhuǎn)基因植物中收獲并且用于生長(zhǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的植物后代，包括包含本發(fā)明構(gòu)建體并表達(dá)農(nóng)學(xué)目標(biāo)基因的植物雜交系。

本發(fā)明還提供本發(fā)明所述植物的部分。植物部分包括但不限于葉、莖、根、塊莖、種子、胚乳、胚珠和花粉。本發(fā)明還包括和提供包含本發(fā)明的核酸分子的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。

轉(zhuǎn)基因植物可將轉(zhuǎn)基因多核苷酸分子傳遞至其后代。后代包括任何可再生的包含衍生自祖代植物的轉(zhuǎn)基因的植物部分或種子。對(duì)于轉(zhuǎn)化的多核苷酸分子，轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選是純合的，并且作為有性繁殖的結(jié)果將所述序列傳遞至所有后代。后代可從轉(zhuǎn)基因植物生成的種子生長(zhǎng)。然后，這些另外的植物可以自花授粉，以生成植物的真正育種系。在其他事項(xiàng)中，評(píng)價(jià)來自這些植物的后代的基因表達(dá)?；虮磉_(dá)可通過若干常規(guī)方法如western印跡法、northern印跡法、免疫沉淀和elisa來檢測(cè)。

現(xiàn)已大體上描述了本發(fā)明，通過參考以下通過舉例說明的方式提供的實(shí)施例將會(huì)更加容易地理解本發(fā)明，除非規(guī)定，其并不意圖限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，以下實(shí)施例中公開的技術(shù)代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的很好地實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，可以對(duì)公開的具體實(shí)施方式進(jìn)行許多改變，并仍然會(huì)得到類似或相似的結(jié)果，而不會(huì)偏離本發(fā)明的精神和范圍，因此列于或顯示于所附附圖中的所有內(nèi)容應(yīng)被理解為示例性的，而不是限制性的。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：調(diào)控元件的鑒別和克隆

從雙子葉植物物種甜瓜wsh-39-1070an的基因組dna中鑒別并分離新型轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件或轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組(exp)序列。

基于專有的和公共的微陣列數(shù)據(jù)選擇轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件，所述微陣列數(shù)據(jù)來源于在大豆(glycinemax)和擬南芥中進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄譜實(shí)驗(yàn)以及使用已知的雙子葉植物序列對(duì)專有的甜瓜序列查詢的基于同源性的搜索。

使用所鑒別的序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析以鑒別擴(kuò)增dna中的調(diào)控元件，接著鑒別轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)(tss)以及序列中存在的任何雙向性、內(nèi)含子或上游編碼序列。使用該分析結(jié)果，在所述dna序列內(nèi)確定調(diào)控元件，并設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增所述調(diào)控元件。使用標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈反應(yīng)條件、使用含有獨(dú)特的限制性酶位點(diǎn)的引物和從甜瓜分離的基因組dna來擴(kuò)增每個(gè)調(diào)控元件的相應(yīng)dna分子。使用相容限制性位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)限制酶消化和dna連接方法將所得到的dna片段連接至基礎(chǔ)植物表達(dá)載體中。

可使用轉(zhuǎn)化的植物原生質(zhì)體進(jìn)行所述調(diào)控元件tss和內(nèi)含子/外顯子剪接點(diǎn)的分析。簡(jiǎn)而言之，用包含可操作地連接異源可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的克隆dna片段的所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化所述原生質(zhì)體，并且通過分析由此生成的所述mrna轉(zhuǎn)錄物的序列，使用用于cdna末端快速擴(kuò)增的5′race系統(tǒng)，2.0版(invtrogen，carlsbad，california92008)確認(rèn)所述調(diào)控元件tss和內(nèi)含子/外顯子剪接點(diǎn)。

如上所述分析編碼泛素1轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組(exp)的序列，并將每個(gè)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組(″e(cuò)xp″)分解為包含每個(gè)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組的相應(yīng)啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列和內(nèi)含子。在本文中以seqidno：1、5、7、9和11提供所鑒別的泛素1轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組(″e(cuò)xp″)的序列，并列于下表1中。在本文中以seqidno：2、6、8、10和12提供相應(yīng)的泛素1啟動(dòng)子。在本文中分別以seqidno：3和4提供所述泛素1前導(dǎo)序列和內(nèi)含子。

以seqidno：13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、159、162、167、168、172、175、176、177、178、181、182、183、184、185、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、211和212提供編碼其它甜瓜屬轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組或exp序列的序列，并且所述序列也列于下表1中，其中所述exp序列由可操作地連接前導(dǎo)序列元件的啟動(dòng)子元件；或可操作地連接前導(dǎo)序列元件和內(nèi)含子元件的啟動(dòng)子元件；或可操作地連接前導(dǎo)序列元件、可操作地連接內(nèi)含子元件、可操作地連接前導(dǎo)序列元件的啟動(dòng)子元件組成。以seqidno：163和169提供額外的啟動(dòng)子元件。以seqidno：164、166和170提供額外的前導(dǎo)序列元件。以seqidno：165和171提供額外的內(nèi)含子元件。以seqidno：157、160、173、179和186提供其中啟動(dòng)子可操作地連接前導(dǎo)序列元件的元件。以seqidno：158、161、174、180和187提供其中內(nèi)含子可操作地連接前導(dǎo)序列元件的元件。相對(duì)于以seqidno：13-199、211和212提供的序列的子集，基于實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如由來自不同物種的同系基因提出期望表達(dá)模式如組成型表達(dá)、根表達(dá)、地上表達(dá)(abovegroundexpression)或種子表達(dá)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄物分布或表達(dá)來選擇并克隆這些序列。所述甜瓜屬序列賦予的實(shí)際活性憑經(jīng)驗(yàn)來確定，并且當(dāng)用于轉(zhuǎn)化的植物宿主細(xì)胞和整個(gè)轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，其不必然與衍生自來自不同于甜瓜的物種的同系基因的調(diào)控元件的活性相同。

如表1所示，例如，具有從甜瓜分離的組件的exp-cucme.ubq1∶1∶1(seqidno：1)表示的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組(exp)包含可操作地連接5′至前導(dǎo)序列元件l-cucme.ubq1-1∶1∶1(seqidno：3)、可操作地連接5′至內(nèi)含子元件i-cucme.ubq1-1∶1∶1(seqidno：4)的大小(bp)為2068個(gè)堿基對(duì)的啟動(dòng)子元件p-cucme.ubq1-1∶1∶15(seqidno：2)。具有從甜瓜分離的組件的exp-cucme.ubq1∶1∶2(seqidno：5)表示的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組(exp)包含可操作地連接5′至前導(dǎo)序列元件l-cucme.ubq1-1∶1∶1(seqidno：3)、可操作地連接5′至內(nèi)含子元件i-cucme.ubq1-1∶1∶1(seqidno：4)的1459bp的啟動(dòng)子元件p-cucme.ubq1-1∶1∶16(seqidno：6)。具有從甜瓜分離的組件的exp-cucme.ubq1∶1∶3(seqidno：7)表示的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組(exp)包含可操作地連接5′至前導(dǎo)序列元件l-cucme.ubq1-1∶1∶1(seqidno：3)、可操作地連接5′至內(nèi)含子元件i-cucme.ubq1-1∶1∶1(seqidno：4)的964bp的啟動(dòng)子元件p-cucme.ubq1-1∶1∶17(seqidno：8)。具有從甜瓜分離的組件的exp-cucme.ubq1∶1∶4(seqidno：9)表示的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組(exp)包含可操作地連接5′至前導(dǎo)序列元件l-cucme.ubq1-1∶1∶1(seqidno：3)、可操作地連接5′至內(nèi)含子元件i-cucme.ubq1-1∶1∶1(seqidno：4)的479bp的啟動(dòng)子元件p-cucme.ubq1-1∶1∶18(seqidno：10)。具有從甜瓜分離的組件的exp-cucme.ubq1∶1∶5(seqidno：11)表示的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組(exp)包含可操作地連接5′至前導(dǎo)序列元件l-cucme.ubq1-1∶1∶1(seqidno：3)、可操作地連接5′至內(nèi)含子元件i-cucme.ubq1-1∶1∶1(seqidno：4)的173bp的啟動(dòng)子元件p-cucme.ubq1-1∶1∶19(seqidno：12)。

所述泛素1啟動(dòng)子序列的對(duì)比提供于圖1a-1f中。通過引入來自所述啟動(dòng)子p-cucme.ubq1-1∶1∶15(seqidno：2)的5′端的不同長(zhǎng)度的缺失，構(gòu)造啟動(dòng)子元件p-cucme.ubq1-1∶1∶16(seqidno：6)、p-cucme.ubq1-1∶1∶17(seqidno：8)、p-cucme.ubq1-1∶1∶18(seqidno：10)和p-cucme.ubq1-1∶1∶19(seqidno：12)。

實(shí)施例2：大豆子葉原生質(zhì)體中驅(qū)動(dòng)gus的調(diào)控元件的分析

用含有驅(qū)動(dòng)所述β-葡糖醛酸酶(gus)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的測(cè)試轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)元件組的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大豆子葉原生質(zhì)體，并與葉原生質(zhì)體中的gus表達(dá)進(jìn)行比較，其中g(shù)us的表達(dá)由已知的組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。

將exp-cucme.ubq1∶1∶1(seqidno：1)、exp-cucme.ubq1∶1∶2(seqidno：5)、exp-cucme.ubq1∶1∶3(seqidno：7)、exp-cucme.ubq1∶1∶4(seqidno：9)和exp-cucme.ubq1∶1∶5(seqidno：11)驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)與來自已知的組成型啟動(dòng)子的表達(dá)進(jìn)行比較。每種植物表達(dá)載體由來自根癌土壤桿菌的右邊界區(qū)域、第一轉(zhuǎn)基因盒、第二轉(zhuǎn)基因選擇盒和來自根癌土壤桿菌的左邊界區(qū)域組成，其中所述第一轉(zhuǎn)基因盒由可操作地連接5′至含衍生自土豆光誘導(dǎo)組織特異性st-ls1基因(基因庫登記號(hào)：x04753)的可加工內(nèi)含子的β-葡糖醛酸酶(gus，seqidno：206)用編碼序列的、可操作地連接5′至來自海島棉(gossypiumbarbadense)e6基因(t-gb.e6-3b∶1∶1，seqidno：204)、豌豆(pisumsativum)rbcs2-e9基因(t-ps.rbcs2-e9-1∶1∶6，seqidno：203)或海島棉fblate-2基因(t-gb.fbl2-1∶1∶1，seqidno：205)的3′終止區(qū)域的exp序列或已知的組成型啟動(dòng)子組成；所述第二轉(zhuǎn)基因選擇盒用于選擇賦予除草劑草甘膦(由擬南芥肌動(dòng)蛋白7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))或抗生素、卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。無啟動(dòng)子的對(duì)照植物表達(dá)載體(pmon124912)作為表達(dá)的陰性對(duì)照。將上述測(cè)試和組成型表達(dá)元件組克隆成如下表2所示的植物表達(dá)載體。

表2.植物表達(dá)載體和相應(yīng)的表達(dá)元件組以及3′utr

此外，構(gòu)建用于共-轉(zhuǎn)化和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的兩個(gè)質(zhì)粒。一個(gè)轉(zhuǎn)化對(duì)照質(zhì)粒由驅(qū)動(dòng)螢火蟲(photinuspyralis)熒光素酶編碼序列(fluc，seqidno：207)表達(dá)的組成型啟動(dòng)子組成，所述組成型啟動(dòng)子可操作地連接5′至來自根癌土壤桿菌胭脂堿合酶基因(t-agrtu.nos-1∶1∶13，seqidno：209)的3′終止區(qū)域。另一個(gè)轉(zhuǎn)化對(duì)照質(zhì)粒由驅(qū)動(dòng)海腎(renillareniformis)熒光素酶編碼序列(rluc，seqidno：208)表達(dá)的組成型啟動(dòng)子組成，所述組成型啟動(dòng)子可操作地連接5′至來自根癌土壤桿菌胭脂堿合酶基因的3′終止區(qū)域。

使用peg轉(zhuǎn)化方法，使用植物表達(dá)載體pmon80585、pmon109584、pmon118756、pmon124912、pmon138776、pmon138777、pmon138778、pmon138779和pmon138780轉(zhuǎn)化大豆子葉原生質(zhì)體細(xì)胞。用等摩爾量的所述兩個(gè)轉(zhuǎn)化對(duì)照質(zhì)粒中每一個(gè)和測(cè)試植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體細(xì)胞。測(cè)定gus和熒光素酶活性。通過將等分的如上轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的裂解制劑放入兩個(gè)不同的小孔托盤中來進(jìn)行g(shù)us和熒光素酶的測(cè)量。一個(gè)托盤用于gus測(cè)量，而另一個(gè)托盤用于進(jìn)行使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(promegacorp.，madison，wi；參見例如，promeganotesmagazine，no：57，1996，p.02)的雙熒光素酶檢測(cè)。每次轉(zhuǎn)化使用3或4個(gè)復(fù)制物來進(jìn)行試樣測(cè)量。gus和熒光素酶的平均值顯示于下表3中。

表3.gus和熒光素酶表達(dá)平均值和gus/熒光素酶比值

為了比較大豆子葉原生質(zhì)體中每個(gè)啟動(dòng)子的相對(duì)活性，將gus值表示為gus與熒光素酶活性的比例，并且根據(jù)觀察到的組成型表達(dá)元件組exp-at.act7∶1∶11和exp-camv.35s-enh+ph.dnak∶1∶3的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。下表4顯示根據(jù)exp-at.act7∶1∶11和exp-camv.35s-enh+ph.dnak∶1∶3標(biāo)準(zhǔn)化的gus與螢火蟲熒光素酶(fluc)的比例。下表5顯示根據(jù)exp-at.act7∶1∶11和exp-camv.35s-enh+ph.dnak∶1∶3標(biāo)準(zhǔn)化的gus與海腎熒光素酶(rluc)的比例。

表4.根據(jù)exp-at.act7∶1∶11和exp-camv.35s-enh+ph.dnak∶1∶3標(biāo)準(zhǔn)化的gus與螢火蟲熒光素酶(fluc)的比例

表5.根據(jù)exp-at.act7∶1∶11和exp-camv.35s-enh+ph.dnak∶1∶3標(biāo)準(zhǔn)化的gus與海腎熒光素酶(rluc)的比例

從上表4和5中可以看出，表達(dá)元件組exp-cucme.ubq1∶1∶1(seqidno：1)、exp-cucme.ubq1∶1∶2(seqidno：5)、exp-cucme.ubq1∶1∶3(seqidno：7)、exp-cucme.ubq1∶1∶4(seqidno：9)和exp-cucme.ubq1∶1∶5(seqidno：11)中每一個(gè)均顯示在大豆子葉原生質(zhì)體中驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。其在該檢測(cè)中的表達(dá)水平高于exp-at.act7∶1∶11的表達(dá)水平，并且比exp-at.act7∶1∶11高2.9至5.8倍(fluc)或3至7倍(rluc)。所述表達(dá)與觀察到的exp-camv.35s-enh+ph.dnak∶1∶3的表達(dá)相當(dāng)，或高于觀察到的exp-camv.35s-enh+ph.dnak∶1∶3的表達(dá)。所述表達(dá)水平比觀察到的exp-camv.35s-enh+ph.dnak∶1∶3的表達(dá)高0.8至1.7倍(fluc)或1至2.4倍(rluc)。

實(shí)施例3：在轟擊的大豆葉和根中驅(qū)動(dòng)gus的調(diào)控元件的分析

用含有驅(qū)動(dòng)所述β-葡糖醛酸酶(gus)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的測(cè)試轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)元件組的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大豆葉和根，并與根和葉中的gus表達(dá)進(jìn)行比較，其中g(shù)us的表達(dá)由已知的組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。

將在粒子轟擊的大豆葉和根中由exp-cucme.ubq1∶1∶1(seqidno：1)、exp-cucme.ubq1∶1∶2(seqidno：5)、exp-cucme.ubq1∶1∶3(seqidno：7)、exp-cucme.ubq1∶1∶4(seqidno：9)和exp-cucme.ubq1∶1∶5(seqidno：11)驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)與來自已知的組成型啟動(dòng)子的表達(dá)進(jìn)行比較。用于轉(zhuǎn)化葉和根的植物表達(dá)載體與以上實(shí)施例2的表2中所示的那些相同。

使用粒子轟擊轉(zhuǎn)化方法，將植物表達(dá)載體pmon80585、pmon109584、pmon118756、pmon124912、pmon138776、pmon138777、pmon138778、pmon138779和pmon138780用于轉(zhuǎn)化大豆葉和根。

簡(jiǎn)而言之，對(duì)a3244大豆種子進(jìn)行表面消毒，并用16小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗的光周期使其在托盤中發(fā)芽。大約13天后，在無菌條件下從所述幼苗收獲葉和根組織，并用于轟擊。將所述組織試樣隨機(jī)放置在含植物培養(yǎng)基的陪替氏培養(yǎng)皿上。使用10微克的質(zhì)粒dna包被用于轟擊的0.6微米金粒子(目錄#165-2262bio-rad，hercules，ca)。用所述dna包被的金粒子(目錄#165-2335bio-rad，herculesca)裝載大載體。使用pds1000/he基因槍進(jìn)行轉(zhuǎn)化(目錄#165-2257bio-rad，herculesca)。使所轟擊的根和葉組織在26攝氏度下在黑暗中培育24小時(shí)。繼該過夜培育之后，在用于gus表達(dá)的溶液中，在37攝氏度下過夜染色所述組織。過夜染色后，在70％的乙醇中過夜浸泡所述組織，以除去葉綠素并顯示gus染色。然后，對(duì)所述組織拍照，并將反映gus表達(dá)水平的″0″、″+″至″++++++″的等級(jí)量表分配給每個(gè)構(gòu)建體(0為不表達(dá)，+至++++++分別為低至高)。

在每個(gè)組織中顯示的gus轉(zhuǎn)基因的表達(dá)用來推斷每個(gè)元件在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米植物中驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力的相對(duì)潛在水平和特異性。gus表達(dá)平均等級(jí)提供于下表6中。

表6.粒子轟擊的葉和根的gus表達(dá)等級(jí)

從上表6中可以看出，表達(dá)元件組exp-cucme.ubq1∶1∶1(seqidno：1)、exp-cucme.ubq1∶1∶2(seqidno：5)、exp-cucme.ubq1∶1∶3(seqidno：7)、exp-cucme.ubq1∶1∶4(seqidno：9)和exp-cucme.ubq1∶1∶5(seqidno：11)中每一個(gè)均顯示在粒子轟擊的轉(zhuǎn)化的葉和根組織中驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。

實(shí)施例4：大豆子葉原生質(zhì)體中驅(qū)動(dòng)gus的調(diào)控元件的分析

將由p-cucme.1-1∶1∶1rc(seqidno：155)、p-cucme.2-1∶1∶1(seqidno：14)、p-cucme.3-1∶1∶3(seqidno：15)、exp-cucme.4∶1∶1(seqidno：156)、exp-cucme.5∶1∶1(seqidno：159)、p-cucme.6-1∶1∶1(seqidno：18)、p-cucme.8-1∶1∶2(seqidno：19)、p-cucme.9-1∶1∶2(seqidno：20)、p-cucme.10-1∶1∶1(seqidno：21)、exp-cucme.eef1a∶1∶1(seqidno：162)、p-cucme.15-1∶1∶2(seqidno：23)、p-cucme.16a-1∶1∶2(seqidno：24)、p-cucme.17-1∶1∶2(seqidno：26)、p-cucme.18-1∶1∶2(seqidno：27)、p-cucme.19-1∶1∶3(seqidno：167)、p-cucme.20-1∶3(seqidno：211)、p-cucme.21-1∶1∶1(seqidno：30)、p-cucme.22-1∶1∶3(seqidno：31)、exp-cucme.sams2∶1∶1(seqidno：168)、p-cucme.26-1∶1∶2(seqidno：33)、p-cucme.28-1∶1∶2(seqidno：34)和exp-cucme.29∶1∶2(seqidno：212)驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)與來自已知的組成型表達(dá)元件組的表達(dá)進(jìn)行比較。每種植物表達(dá)載體由來自根癌土壤桿菌的右邊界區(qū)域、第一轉(zhuǎn)基因盒、第二轉(zhuǎn)基因選擇盒和來自根癌土壤桿菌的左邊界區(qū)域組成，其中所述第一轉(zhuǎn)基因盒由可操作地連接5′至含有衍生自土豆光誘導(dǎo)組織特異性st-ls1基因(基因庫登記號(hào)：x04753)的可加工內(nèi)含子的β-葡糖醛酸酶(gus，seqidno：206)用編碼序列的、可操作地連接5′至來自海島棉e6基因(t-gb.e6-3b∶1∶1，seqidno：204)、豌豆rbcs2-e9基因(t-ps.rbcs2-e9-1∶1∶6，seqidno：203)或海島棉fblate-2基因(t-gb.fbl2-1∶1∶1，seqidno：205)的3′終止區(qū)域的測(cè)試啟動(dòng)子或已知的組成型啟動(dòng)子組成；所述第二轉(zhuǎn)基因選擇盒用于選擇賦予除草劑草甘膦(由擬南芥肌動(dòng)蛋白7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))或抗生素、卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。無啟動(dòng)子的對(duì)照植物表達(dá)載體(pmon124912)作為表達(dá)的陰性對(duì)照。將上述測(cè)試和組成型表達(dá)元件組克隆成如下表7所示的植物表達(dá)載體。

表7.植物表達(dá)載體和相應(yīng)的表達(dá)元件組以及3′utr

使用peg轉(zhuǎn)化法，使用植物表達(dá)載體pmon80585、pmon109584、pmon118756、pmon124912、pmon140818、pmon140819、pmon140820、pmon140821pmon140822、pmon140823、pmon140824、pmon140825、pmon140826、pmon140827、pmon140828、pmon140829、pmon140830、pmon140831、pmon140832、pmon140833、pmon140834、pmon140835、pmon140836、pmon140837、pmon140838和pmon140839轉(zhuǎn)化大豆子葉原生質(zhì)體細(xì)胞。用等摩爾量的所述兩個(gè)轉(zhuǎn)化對(duì)照質(zhì)粒中每一個(gè)和測(cè)試植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體細(xì)胞。測(cè)定gus和熒光素酶活性。通過將等分的如上轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的裂解制劑放入兩個(gè)不同的小孔托盤中來進(jìn)行g(shù)us和熒光素酶的測(cè)量。一個(gè)托盤用于gus測(cè)量，而另一個(gè)托盤用于進(jìn)行使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(promegacorp.，madison，wi；參見例如，promeganotesmagazine，no：57，1996，p.02)的雙熒光素酶檢測(cè)。每次轉(zhuǎn)化使用3或4個(gè)復(fù)制物來進(jìn)行試樣測(cè)量。gus和熒光素酶的平均值顯示于下表8中。

表8.gus和熒光素酶表達(dá)平均值和gus/熒光素酶比例

為了比較大豆子葉原生質(zhì)體中每個(gè)啟動(dòng)子的相對(duì)活性，將gus值表示為gus與熒光素酶活性的比例，并且根據(jù)觀察到的組成型表達(dá)元件組exp-at.act7∶1∶11和exp-camv.35s-enh+ph.dnak∶1∶3的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。下表9顯示根據(jù)exp-at.act7∶1∶11和exp-camv.35s-enh+ph.dnak∶1∶3標(biāo)準(zhǔn)化的gus與螢火蟲熒光素酶(fluc)的比例。下表10顯示根據(jù)exp-at.act7∶1∶11和exp-camv.310s-enh+ph.dnak∶1∶3標(biāo)準(zhǔn)化的gus與海腎熒光素酶(rluc)的比例。

表9.根據(jù)exp-at.act7∶1∶11和exp-camv.35s-enh+ph.dnak∶1∶3標(biāo)準(zhǔn)化的gus與螢火蟲熒光素酶(fluc)的比例

表10.根據(jù)exp-at.act7∶1∶11和exp-camv.35s-enh+ph.dnak∶1∶3標(biāo)準(zhǔn)化的gus與海腎熒光素酶(rluc)的比例

從表9和10中可以看出，大部分所測(cè)試的表達(dá)元件組顯示在大豆子葉原生質(zhì)體細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。在該檢測(cè)中，一個(gè)表達(dá)元件組exp-cucme.4∶1∶1(seqidno：156)顯示高于exp-at.act7∶1∶11的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。

實(shí)施例5：在轟擊的大豆葉和根中驅(qū)動(dòng)gus的調(diào)控元件的分析

將在粒子轟擊的大豆葉和根中由p-cucme.1-1∶1∶1rc(seqidno：155)、p-cucme.2-1∶1∶1(seqidno：14)、p-cucme.3-1∶1∶3(seqidno：15)、exp-cucme.4∶1∶1(seqidno：156)、exp-cucme.5∶1∶1(seqidno：159)、p-cucme.6-1∶1∶1(seqidno：18)、p-cucme.8-1∶1∶2(seqidno：19)、p-cucme.9-1∶1∶2(seqidno：20)、p-cucme.10-1∶1∶1(seqidno：21)、exp-cucme.eef1a∶1∶1(seqidno：162)、p-cucme.15-1∶1∶2(seqidno：23)、p-cucme.16a-1∶1∶2(seqidno：24)、p-cucme.17-1∶1∶2(seqidno：26)、p-cucme.18-1∶1∶2(seqidno：27)、p-cucme.19-1∶1∶3(seqidno：167)、p-cucme.20-1∶3(seqidno：211)、p-cucme.21-1∶1∶1(seqidno：30)、p-cucme.22-1∶1∶3(seqidno：31)、exp-cucme.sams2∶1∶1(seqidno：168)、p-cucme.26-1∶1∶2(seqidno：33)、p-cucme.28-1∶1∶2(seqidno：34)和exp-cucme.29∶1∶2(seqidno：212)驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)與來自已知的組成型表達(dá)元件組的表達(dá)進(jìn)行比較。用于轉(zhuǎn)化葉和根的植物表達(dá)載體與以上實(shí)施例4的表7中所示的那些相同。

使用粒子轟擊轉(zhuǎn)化法，使用植物表達(dá)載體pmon80585、pmon109584、pmon118756、pmon124912、pmon140818、pmon140819、pmon140820、pmon140821、pmon140822、pmon140823、pmon140824、pmon140825、pmon140826、pmon140827、pmon140828、pmon140829、pmon140830、pmon140831、pmon140832、pmon140833、pmon140834、pmon140835、pmon140836、pmon140837、pmon140838和pmon140839轉(zhuǎn)化大豆葉和根。

在每個(gè)組織中顯示的gus轉(zhuǎn)基因的表達(dá)用來推斷每個(gè)元件在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米植物中驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力的相對(duì)潛在水平和特異性。gus表達(dá)平均等級(jí)提供于下表11中。

表11.粒子轟擊的葉和根的gus表達(dá)等級(jí)

從上表11中可以看出，所述表達(dá)元件組除一個(gè)以外都顯示在粒子轟擊的大豆葉和根組織中驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。在該檢測(cè)中，相對(duì)于由exp-camv.35s-enh+ph.dnak∶1∶3驅(qū)動(dòng)的表達(dá)，兩個(gè)表達(dá)元件組p-cucme.28-1∶1∶2(seqidno：34)和exp-cucme.4∶1∶1(seqidno：156)顯示相似的或更高的表達(dá)水平。

實(shí)施例6：使用轉(zhuǎn)基因盒擴(kuò)增子在大豆子葉原生質(zhì)體中驅(qū)動(dòng)gus的調(diào)控元件的分析

用含有驅(qū)動(dòng)所述β-葡糖醛酸酶(gus)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)元件組的轉(zhuǎn)基因盒擴(kuò)增子轉(zhuǎn)化大豆子葉原生質(zhì)體，并與葉原生質(zhì)體中的gus表達(dá)進(jìn)行比較，其中g(shù)us的表達(dá)由已知的組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。所述轉(zhuǎn)基因盒擴(kuò)增子由可操作地連接gus編碼序列(gus，seqidno：206)、可操作地連接3′utr(t-gb.fbl2-1∶1∶1，seqidno：205)的exp序列組成。將gus平均表達(dá)與所述對(duì)照exp元件p-camv.35s-enh-1∶1∶102/l-camv.35s-1∶1∶2(seqidno：210)和exp-at.atntt1∶1∶2(seqidno：200)進(jìn)行比較。

此外，以與如上在實(shí)施例2中所描述的相似方式使用用于共-轉(zhuǎn)化和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)粒。所述轉(zhuǎn)化對(duì)照質(zhì)粒由驅(qū)動(dòng)螢火蟲(photinuspyralis)熒光素酶編碼序列(fluc，seqidno：205)表達(dá)的組成型啟動(dòng)子組成，所述組成型啟動(dòng)子可操作地連接5′至來自根癌土壤桿菌胭脂堿合酶基因(t-agrtu.nos-1∶1∶13，seqidno：209)的3′終止區(qū)域。

下表12顯示由每個(gè)轉(zhuǎn)基因擴(kuò)增子賦予的gus表達(dá)平均值。下表13顯示根據(jù)exp-at.atntt1∶1∶2和p-camv.35s-enh-1∶1∶102/l-camv.35s-1∶1∶2標(biāo)準(zhǔn)化的gus與螢火蟲熒光素酶(fluc)的比例。

從上表12中可以看出，當(dāng)與所述無啟動(dòng)子的對(duì)照相比時(shí)，不是所有的exp序列都顯示驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。然而，exp序列cumme_wsm_sf16429.g5670(seqidno：40)、p-cucme.cumme_wsm_sf16444.g5140-1∶1∶1(seqidno：175)、p-cucme.cumme_wsm_sf16563.g5560-1∶1∶1(seqidno：176)、cumme_wsm_sf17051.g5470(seqidno：48)、p-cucme.cumme_wsm_sf17111.g5790-1∶1∶1(seqidno：177)、p-cucme.wsm_sf17252.g7330-1∶1∶1(seqidno：179)、cumme_wsm_sf17866.g6050(seqidno：62)、p-cucme.cumme_wsm_sf18488.g5340-1∶1∶1(seqidno：181)、p-cucme.cumme_wsm_sf18536.g6480-1∶1∶1(seqidno：182)、cumme_wsm_sf18575.g6410(seqidno：71)、p-cucme.cumme_wsm_sf18634.g5190-1∶1∶1(seqidno：183)、cumme_wsm_sf18986.g6110(seqidno：79)、exp-cucme.wsm_sf19064.g5690∶1∶1(seqidno：185)、p-cucme.cumme_wsm_sf19647.g5760-1∶1∶1(seqidno：188)、p-cucme.cumme_wsm_sf19839.g5090-1∶1∶1(seqidno：189)、cumme_wsm_sf19902.g5260(seqidno：87)、p-cucme.cumme_wsm_sf20132.g5560-1∶1∶1(seqidno：190)、cumme_wsm_sf20359.g5870(seqidno：92)、cumme_wsm_sf206458.g5970(seqidno：98)、cumme_wsm_sf206534.g5200(seqidno：99)、cumme_wsm_sf22008.g5670(seqidno：108)、cumme_wsm_sf22355.g5310(seqidno：113)、p-cucme.cumme_wsm_sf22531.g5120-1∶1∶1(seqidno：192)、exp-cucme.wsm_sf19064.g5690∶1∶1(seqidno：193)、p-cucme.cumme_wsm_sf23906.g6180-1∶1∶1(seqidno：194)、cumme_wsm_sf24045.g5400(seqidno：123)、p-cucme.cumme_wsm_sf25141.g5160-1∶1∶2(seqidno：195)、p-cucme.cumme_wsm_sf25936.g5450-1∶1∶1(seqidno：197)、cumme_wsm_sf28729.g5340(seqidno：134)、cumme_wsm_sf31264.g5380(seqidno：136)和p-cucme.cumme_wsm_sf35856.g5150-1∶1∶1(seqidno：198)顯示以與exp-at.atntt1∶1∶2相似或更高的水平驅(qū)動(dòng)大豆子葉原生質(zhì)體中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。如上表13所示，在該檢測(cè)中，exp序列p-cucme.cumme_wsm_sf19647.g5760-1∶1∶1(seqidno：188)顯示以高于exp-at.atntt1∶1∶2的水平驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。

實(shí)施例7：棉花葉原生質(zhì)體中驅(qū)動(dòng)gus的調(diào)控元件的分析

用含有驅(qū)動(dòng)所述β-葡糖醛酸酶(gus)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的測(cè)試轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)元件組的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化棉花葉原生質(zhì)體，并與葉原生質(zhì)體中的gus表達(dá)進(jìn)行比較，其中g(shù)us表達(dá)由已知的組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。

將由p-cucme.1-1∶1∶1rc(seqidno：155)、p-cucme.2-1∶1∶1(seqidno：14)、p-cucme.3-1∶1∶3(seqidno：15)、exp-cucme.4∶1∶1(seqidno：156)、p-cucme.6-1∶1∶1(seqidno：18)、p-cucme.8-1∶1∶2(seqidno：19)、p-cucme.9-1∶1∶2(seqidno：20)、p-cucme.10-1∶1∶1(seqidno：21)、exp-cucme.eef1a∶1∶1(seqidno：162)、p-cucme.15-1∶1∶2(seqidno：23)、p-cucme.16a-1∶1∶2(seqidno：24)、p-cucme.17-1∶1∶2(seqidno：26)、p-cucme.18-1∶1∶2(seqidno：27)、p-cucme.19-1∶1∶3(seqidno：167)、p-cucme.20-1∶3(seqidno：211)、p-cucme.21-1∶1∶1(seqidno：30)、p-cucme.22-1∶1∶3(seqidno：31)、exp-cucme.sams2∶1∶1(seqidno：168)、p-cucme.26-1∶1∶2(seqidno：33)、p-cucme.28-1∶1∶2(seqidno：34)和exp-cucme.29∶1∶2(seqidno：212)驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)與來自已知的組成型表達(dá)元件組的表達(dá)進(jìn)行比較。每種植物表達(dá)載體由來自根癌土壤桿菌的右邊界區(qū)域、第一轉(zhuǎn)基因盒、第二轉(zhuǎn)基因選擇盒和來自根癌土壤桿菌的左邊界區(qū)域組成，其中所述第一轉(zhuǎn)基因盒由可操作地連接5′至含有衍生自土豆光誘導(dǎo)組織特異性st-ls1基因(基因庫登記號(hào)：x04753)的可加工內(nèi)含子的β-葡糖醛酸酶(gus，seqidno：206)用編碼序列的、可操作地連接5′至來自海島棉e6基因(t-gb.e6-3b∶1∶1，seqidno：204)、豌豆rbcs2-e9基因(t-ps.rbcs2-e9-1∶1∶6，seqidno：203)或海島棉fblate-2基因(t-gb.fbl2-1∶1∶1，seqidno：205)的3′終止區(qū)域的測(cè)試啟動(dòng)子或已知的組成型啟動(dòng)子組成；所述第二轉(zhuǎn)基因選擇盒用于選擇賦予除草劑草甘膦(由擬南芥肌動(dòng)蛋白7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))或抗生素、卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。無啟動(dòng)子的對(duì)照植物表達(dá)載體(pmon124912)作為表達(dá)的陰性對(duì)照。將上述測(cè)試和組成型表達(dá)元件組克隆成如下表14所示的植物表達(dá)載體。

表14.植物表達(dá)載體和相應(yīng)的表達(dá)元件組以及3′utr

此外，構(gòu)建用于共-轉(zhuǎn)化和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的兩個(gè)質(zhì)粒。一個(gè)轉(zhuǎn)化對(duì)照質(zhì)粒由驅(qū)動(dòng)螢火蟲(photinuspyralis)熒光素酶編碼序列(fluc，seqidno：205)表達(dá)的組成型啟動(dòng)子組成，所述組成型啟動(dòng)子可操作地連接5′至來自根癌土壤桿菌胭脂堿合酶基因(t-agrtu.nos-1∶1∶13，seqidno：209)的3′終止區(qū)域。另一個(gè)轉(zhuǎn)化對(duì)照質(zhì)粒包含驅(qū)動(dòng)海腎(renillareniformis)熒光素酶編碼序列(rluc，seqidno：206)表達(dá)的組成型啟動(dòng)子組成，所述組成型啟動(dòng)子可操作地連接5′至來自根癌土壤桿菌胭脂堿合酶基因的3′終止區(qū)域。

使用peg轉(zhuǎn)化法，使用植物表達(dá)載體pmon80585、pmon109584、pmon118756、pmon124912、pmon140818、pmon140819、pmon140820、pmon140821、pmon140822、pmon140823、pmon140824、pmon140825、pmon140826、pmon140827、pmon140828、pmon140829、pmon140830、pmon140831、pmon140832、pmon140833、pmon140834、pmon140835、pmon140836、pmon140837、pmon140838和pmon140839轉(zhuǎn)化棉花葉原生質(zhì)體細(xì)胞。用等摩爾量的所述兩個(gè)轉(zhuǎn)化對(duì)照質(zhì)粒中每一個(gè)和測(cè)試植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體細(xì)胞。測(cè)定gus和熒光素酶活性。通過將等分的如上轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的裂解制劑放入兩個(gè)不同的小孔托盤中來進(jìn)行g(shù)us和熒光素酶的測(cè)量。一個(gè)托盤用于gus測(cè)量，而另一個(gè)托盤用于進(jìn)行使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(promegacorp.，madison，wi；參見例如，promeganotesmagazine，no：57，1996，p.02)的雙熒光素酶檢測(cè)。每次轉(zhuǎn)化使用4個(gè)復(fù)制物來進(jìn)行試樣測(cè)量。gus和熒光素酶的平均值顯示在下表15中。

表15.gus和熒光素酶表達(dá)平均值和gus/熒光素酶比例

為了比較棉花葉原生質(zhì)體中每個(gè)啟動(dòng)子的相對(duì)活性，將gus值表示為gus與熒光素酶活性的比例，并且根據(jù)觀察到的組成型表達(dá)元件組exp-at.act7∶1∶11和exp-camv.35s-enh+ph.dnak∶1∶3的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。下表16顯示根據(jù)exp-at.act7∶1∶11和exp-camv.35s-enh+ph.dnak∶1∶3標(biāo)準(zhǔn)化的gus與螢火蟲熒光素酶(fluc)的比例。下表17顯示根據(jù)exp-at.act7∶1∶11和exp-camv.317s-enh+ph.dnak∶1∶3標(biāo)準(zhǔn)化的gus與海腎熒光素酶(rluc)的比例。

表16.根據(jù)exp-at.act7∶1∶11和exp-camv.35s-enh+ph.dnak∶1∶3標(biāo)準(zhǔn)化的gus與螢火蟲熒光素酶(fluc)的比例

表17.根據(jù)exp-at.act7∶1∶11和exp-camv.35s-enh+ph.dnak∶1∶3標(biāo)準(zhǔn)化的gus與海腎熒光素酶(rluc)的比例

從表16和17中可以看出，大部分所測(cè)試的表達(dá)元件組顯示在棉花葉原生質(zhì)體細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。在該檢測(cè)中，一個(gè)表達(dá)元件組exp-cucme.4∶1∶1(seqidno：156)顯示高于exp-at.act7∶1∶11的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。

實(shí)施例8：使用轉(zhuǎn)基因盒擴(kuò)增子在棉花葉原生質(zhì)體中驅(qū)動(dòng)gus的調(diào)控元件的分析

用含有驅(qū)動(dòng)所述β-葡糖醛酸酶(gus)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控表達(dá)元件組的轉(zhuǎn)基因盒擴(kuò)增子轉(zhuǎn)化棉花葉原生質(zhì)體，并與葉原生質(zhì)體中的gus表達(dá)進(jìn)行比較，其中g(shù)us表達(dá)由已知的組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。所述轉(zhuǎn)基因盒擴(kuò)增子由可操作地連接gus編碼序列(gus，seqidno：206)、可操作地連接3′utr(t-gb.fbl2-1∶1∶1，seqidno：205)的exp序列組成。將gus平均表達(dá)與所述對(duì)照exp元件p-camv.35s-enh-1∶1∶102/l-camv.35s-1∶1∶2(seqidno：210)和exp-at.atntt1∶1∶2(seqidno：200)進(jìn)行比較。

下表18顯示由每個(gè)轉(zhuǎn)基因擴(kuò)增子賦予的gus表達(dá)平均值。下表19顯示根據(jù)exp-at.atntt1∶1∶2和p-camv.35s-enh-1∶1∶102/l-camv.35s-1∶1∶2標(biāo)準(zhǔn)化的gus與螢火蟲熒光素酶(fluc)的比例。

表18.gus和熒光素酶表達(dá)平均值和gus/熒光素酶比例

表19.根據(jù)exp-at.atntt1∶1∶2和p-camv.35s-enh-1∶1∶102/l-camv.35s-1∶1∶2標(biāo)準(zhǔn)化的gus與螢火蟲熒光素酶(fluc)的比例

從上表18中可以看出，當(dāng)與所述無啟動(dòng)子的對(duì)照相比時(shí)，不是所有的exp序列都顯示驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。然而，exp序列p-cucme.cumme_wsm_sf16444.g5140-1∶1∶1(seqidno：175)和p-cucme.cumme_wsm_sf19839.g5090-1∶1∶1(seqidno：189)顯示以與exp-at.atntt1∶1∶2相似或更高的水平驅(qū)動(dòng)大豆子葉原生質(zhì)體中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。如上表19所示，在該檢測(cè)中，exp序列p-cucme.cumme_wsm_sf19839.g5090-1∶1∶1(seqidno：189)顯示以高于exp-at.atnttl∶1∶2的水平驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。

實(shí)施例9：在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的大豆中驅(qū)動(dòng)gus的調(diào)控元件的分析

用含有驅(qū)動(dòng)所述β-葡糖醛酸酶(gus)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的exp序列的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大豆植物。

通過對(duì)染色的組織切片的檢查定性地和定量地檢測(cè)由exp-cucme.ubq1∶1∶1(seqidno：1)、exp-cucme.ubq1∶1∶3(seqidno：7)、p-cucme.1-1∶1∶1rc(seqidno：155)、p-cucme.2-1∶1∶1(seqidno：14)、p-cucme.3-1∶1∶3(seqidno：15)、exp-cucme.4∶1∶1(seqidno：156)、exp-cucme.5∶1∶1(seqidno：159)、p-cucme.6-1∶1∶1(seqidno：18)、p-cucme.8-1∶1∶2(seqidno：19)、p-cucme.9-1∶1∶2(seqidno：20)、p-cucme.10-1∶1∶1(seqidno：21)、exp-cucme.eef1a∶1∶1(seqidno：162)、p-cucme.15-1∶1∶2(seqidno：23)、p-cucme.17-1∶1∶2(seqidno：26)、p-cucme.18-1∶1∶2(seqidno：27)、p-cucme.19-1∶1∶3(seqidno：167)、p-cucme.20-1∶3(seqidno：211)、p-cucme.21-1∶1∶1(seqidno：30)、exp-cucme.sams2∶1∶1(seqidno：168)、p-cucme.26-1∶1∶2(seqidno：33)、exp-cucme.29∶1∶2(seqidno：212)、p-cucme.cumme_wsm_sf25355.g5000-1∶1∶1(seqidno：196)、p-cucme.cumme_wsm_sf17111.g5790-1∶1∶1(seqidno：177)、p-cucme.cumme_wsm_sf22531.g5120-1∶1∶1(seqidno：192)、p-cucme.cumme_wsm_sf18488.g5340-1∶1∶1(seqidno：181)、p-cucme.cumme_wsm_sf23760.g5200-1∶1∶1(seqidno：193)、exp-cucme.wsm_sf19064.(35690∶1∶1(seqidno：185)、p-cucme.wsm_sf17252.g7330-1∶1∶1(seqidno：179)、p-cucme.cumme_wsm_sf18634.g5190-1∶1∶1(seqidno：183)、p-cucme.cumme_wsm_sf19647.g5760-1∶1∶1(seqidno：188)、p-cucme.cumme_wsm_sf25936.g5450-1∶1∶1(seqidno：197)、p-cucme.cumme_wsm_sf19839.g5090-1∶1∶1(seqidno：189)、cumme_wsm_sf206458.g5970(seqidno：98)和p-cucme.cumme_wsm_sf18716.g5860-1∶1∶1(seqidno：184)驅(qū)動(dòng)的gus轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。每種植物表達(dá)載體由來自根癌土壤桿菌的右邊界區(qū)域、第一轉(zhuǎn)基因盒、第二轉(zhuǎn)基因選擇盒和來自根癌土壤桿菌的左邊界區(qū)域組成，其中所述第一轉(zhuǎn)基因盒由可操作地連接5′至含有衍生自土豆光誘導(dǎo)組織特異性st-ls1基因(基因庫登記號(hào)：x04753)的可加工內(nèi)含子的β-葡糖醛酸酶(gus，seqidno：206)用編碼序列的、可操作地連接5′至來自海島棉fblate-2基因(t-gb.fbl2-1∶1∶1，seqidno：205)的3′終止區(qū)域的exp序列組成；所述第二轉(zhuǎn)基因選擇盒用于選擇賦予除草劑草甘膦(由擬南芥肌動(dòng)蛋白7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))抗性的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。

將上述exp序列克隆成如下表20-23所示的植物表達(dá)構(gòu)建體，并利用土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法用于轉(zhuǎn)化大豆植物。使用所選擇組織的組織切片定性地和定量地檢測(cè)gus的表達(dá)。

組織化學(xué)的gus分析用于轉(zhuǎn)化植物的定性的表達(dá)分析。用gus染色溶液x-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-葡糖苷酸)(1毫克/毫升)培育整個(gè)組織切片持續(xù)適當(dāng)長(zhǎng)度的時(shí)間，沖洗并目測(cè)檢查藍(lán)色染色。通過使用所選擇的植物器官和組織直接目測(cè)檢查或在顯微鏡下檢查，定性地確定gus活性。檢查r0代植物在vn5根、r1根、vn5庫葉、vn5源葉、r1源葉、r1葉柄、黃色豆莢胚、黃色豆莢子葉、r3未成熟種子、r3豆莢、r5子葉和r1花中的表達(dá)。

對(duì)于定量分析，從所選擇的轉(zhuǎn)化的玉米植物組織提取總蛋白質(zhì)。1微克總蛋白質(zhì)與50微升總反應(yīng)體積中的熒光底物4-甲基傘形酮基(methyleumbelliferyl)-β-d-葡糖苷酸(mug)一起使用。所述反應(yīng)產(chǎn)物4-甲基傘形酮基(4-mu)在高ph時(shí)熒光最大，其中所述羥基被離子化。加入碳酸鈉的堿性溶液同時(shí)停止所述檢測(cè)，并調(diào)節(jié)ph以定量熒光產(chǎn)物。使用具有micromax讀數(shù)器的fluoromax-3(horiba；kyoto，日本)，將狹縫寬度設(shè)置為在2nm激發(fā)和在3nm發(fā)射，測(cè)定在365nm激發(fā)、在445nm發(fā)射的熒光。

下表20和21顯示在r0代植物組織中測(cè)量的定量表達(dá)平均水平。在兩個(gè)表中，未檢測(cè)的那些組織顯示為空白單元。

從表20和21可以看出，取決于用于驅(qū)動(dòng)表達(dá)的exp序列，exp序列exp-cucme.ubq1∶1∶1(seqidno：1)、exp-cucme.ubq1∶1∶3(seqidno：7)、p-cucme.1-1∶1∶1rc(seqidno：155)、p-cucme.2-1∶1∶1(seqidno：14)、exp-cucme.4∶1∶1(seqidno：156)、exp-cucme.5∶1∶1(seqidno：159)、p-cucme.6-1∶1∶1(seqidno：18)、p-cucme.8-1∶1∶2(seqidno：19)、p-cucme.9-1∶1∶2(seqidno：20)、p-cucme.10-1∶1∶1(seqidno：21)、exp-cucme.eef1a∶1∶1(seqidno：162)、p-cucme.15-1∶1∶2(seqidno：23)、p-cucme.17-1∶1∶2(seqidno：26)、p-cucme.18-1∶1∶2(seqidno：27)、p-cucme.19-1∶1∶3(seqidno：167)、p-cucme.20-1∶3(seqidno：211)、p-cucme.21-1∶1∶1(seqidno：30)、exp-cucme.sams2∶1∶1(seqidno：168)、p-cucme.26-1∶1∶2(seqidno：33)、exp-cucme.29∶1∶2(seqidno：212)、p-cucme.cumme_wsm_sf25355.g5000-1∶1∶1(seqidno：196)、p-cucme.cumme_wsm_sf17111.g5790-1∶1∶1(seqidno：177)、p-cucme.cumme_wsm_sf22531.g5120-1∶1∶1(seqidno：192)、p-cucme.cumme_wsm_sf18488.g5340-1∶1∶1(seqidno：181)、p-cucme.cumme_wsm_sf23760.g5200-1∶1∶1(seqidno：193)、exp-cucme.wsm_sf19064.g5690∶1∶1(seqidno：185)、p-cucme.wsm_sf17252.g7330-1∶1∶1(seqidno：179)、p-cucme.cumme_wsm_sf18634.g5190-1∶1∶1(seqidno：183)、p-cucme.cumme_wsm_sf19647.g5760-1∶1∶1(seqidno：188)、p-cucme.cumme_wsm_sf25936.g5450-1∶1∶1(seqidno：197)、p-cucme.cumme_wsm_sf19839.g5090-1∶1∶1(seoidno：189)、cumme_wsm_sf206458.g5970(seqidno：98)和p-cucme.cumme_wsm_sf18716.g5860-1∶1∶1(seqidno：184)定量地顯示在一些或全部檢測(cè)組織中驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。

所選擇的組織切片的組織學(xué)分析進(jìn)一步提供了許多exp序列表達(dá)的證據(jù)。雖然定量分析顯示相當(dāng)?shù)偷谋磉_(dá)水平，但exp-cucme.ubq1∶1∶1(seqidno：1)和exp-cucme.ubq1∶1∶3(seqidno：7)顯示在所有組織中觀察到染色的組成型表達(dá)模式。這類驅(qū)動(dòng)要求組成型低表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的表達(dá)模式可能是最偶然的。由p-cucme.1-1∶1∶1rc(seqidno：155)驅(qū)動(dòng)的表達(dá)顯示在庫葉和源葉維管束和木質(zhì)部以及在根皮、韌皮部、木質(zhì)部、內(nèi)皮、中柱和尖端中表達(dá)。在所有組織中觀察到由exp-cucme.4∶1∶1(seqidno：156)驅(qū)動(dòng)的表達(dá)，其中在所述植物的繁殖期中觀察到最高的表達(dá)。僅在v5庫葉和r1花花藥中觀察到由p-cucme.10-1∶1∶1(seqidno：21)驅(qū)動(dòng)的表達(dá)。由exp-cucme.eef1a∶1∶1(seqidno：162)驅(qū)動(dòng)的表達(dá)顯示在黃色豆莢胚和子葉中觀察到最高表達(dá)的組成型表達(dá)模式。在r1代中的黃色豆莢胚活性比r0代中高5倍(參見下表23)。由p-cucme.15-1∶1∶2(seqidno：23)、p-cucme.17-1∶1∶2(seqidno：26)和p-cucme.18-1∶1∶2(seqidno：27)驅(qū)動(dòng)的表達(dá)顯示組織學(xué)組成型表達(dá)水平。除所述v5根和r1葉柄之外，由p-cucme.19-1∶1∶3(seqidno：167)驅(qū)動(dòng)的表達(dá)顯示組織學(xué)組成型表達(dá)模式。r3豆莢顯示最高的表達(dá)。

除在v5根的表達(dá)之外，由p-cucme.20-1∶3(seqidno：211)驅(qū)動(dòng)的表達(dá)顯示組織學(xué)組成型表達(dá)模式。r8階段子葉中的表達(dá)最高。由exp-cucme.sams2∶1∶1(seqidno：168)驅(qū)動(dòng)的表達(dá)顯示在所有組織中具有組織學(xué)觀察到的表達(dá)的組成型表達(dá)模式。在r1代中觀察到gus表達(dá)增加(參見下表22和23)。r1階段花和葉柄顯示在大豆中的最高表達(dá)水平。由p-cucme.cumme_wsm_sf22531.g5120-1∶1∶1(seqidno：192)驅(qū)動(dòng)的表達(dá)顯示在r8階段子葉和胚中具有最高表達(dá)的組織學(xué)組成型表達(dá)模式。由p-cucme.cumme_wsm_sf18488.g5340-1∶1∶1(seqidno：181)驅(qū)動(dòng)的表達(dá)顯示組成型表達(dá)水平，而在黃色豆莢胚中觀察到定量的高表達(dá)。

將用包含exp-cucme.eef1a∶1∶1(seqidno：162)和exp-cucme.sams2∶1∶1(seqidno：168)的質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的r0代植物結(jié)籽，并分析r1代植物的gus表達(dá)。分析r1代植物在vn5根、vn5庫葉、vn5源葉、r1源葉、r1葉柄、黃色豆莢胚、黃色豆莢子葉、r3未成熟種子、r3豆莢、r5子葉和r1花中的表達(dá)。表22和23顯示在r1代轉(zhuǎn)化植物的每個(gè)組織中測(cè)量的平均gus表達(dá)。

從上表22和23可以看出，由exp-cucme.eef1a∶1∶1(seqidno：162)和exp-cucme.sams2∶1∶1(seqidno：168)在r1代中驅(qū)動(dòng)的表達(dá)顯示，在r1代許多組織中觀察到相對(duì)于r0代表達(dá)增加的組成型表達(dá)水平。

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已經(jīng)闡明并描述了本發(fā)明的原則，在不背離這種原則的情況下可以改變本發(fā)明的安排和細(xì)節(jié)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)是顯而易見的。在權(quán)利要求書的精神和范圍內(nèi)的所有變型均意圖包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。本文引用的所有出版物和公開的專利文件在此以引用方式引入，如同具體地和單獨(dú)地表示每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)均以引用方式引入。

序列表

<110>s.弗拉辛斯基

b.c.福阿特

m.奧法托勒

r.w.舒爾茨

x.韋

w.吳

s-p.楊

<120>植物調(diào)控元件及其應(yīng)用

<130>mons:304wo

<140>未知的

<141>2012-05-11

<150>61/485,876

<151>2011-05-13

<160>212

<210>1

<211>2611

<212>dna

<213>甜瓜

<400>1

atctgaaaggaacacctagcaaggggctactctacaagcatactaagtctacaaagctag60

agttgtatggttatgcagaagacctggacaaaagaagatcactcgctgcttttactttta120

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tgtttttgtttaattggggtcatgacaggtg2611

<210>2

<211>2068

<212>dna

<213>甜瓜

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