摘要

本發(fā)明屬于環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域。它具體涉及一株檸檬酸桿菌(citrobactersp.)及其在含重金屬銅離子廢水去除中的應(yīng)用。該菌株為檸檬酸桿菌(citrobactersp.jpg1)，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為cgmccno.13480。該菌株具有耐受重金屬銅的能力，可用于含銅廢水的處理。

本發(fā)明屬于環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域。它具體涉及一株用于重金屬銅離子去除的檸檬酸桿菌(citrobactersp.jpg1)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

銅是生物生長的必需元素，但是濃度過高時會產(chǎn)生毒性。當(dāng)水中銅含量超過0.01mg/l時，不僅對水體自凈有明顯的抑制作用，而且會對水生生物產(chǎn)生毒性。銅作為一種重要的有色金屬資源，被廣泛應(yīng)用于電子電氣、輕工、機(jī)械制造、建筑工業(yè)、國防工業(yè)等領(lǐng)域。銅的冶煉、加工以及電鍍等工業(yè)生產(chǎn)過程中都會產(chǎn)生大量含銅廢水。通常情況下，含銅廢水其質(zhì)量濃度通常為幾十至幾百毫克每升，這些含銅廢水如果不經(jīng)過處理直接排放到環(huán)境中，將給環(huán)境帶來極大危害。因此，含銅廢水必須經(jīng)過處理才能排放到環(huán)境之中。

目前，含銅廢水的處理方法主要采用物理化學(xué)法或生物法?；瘜W(xué)法如電滲析、化學(xué)沉淀存在過程繁瑣，藥品使用量大，沉渣多、后續(xù)處理難度系數(shù)大等缺點；物理法如活性炭吸附、離子交換等技術(shù)的穩(wěn)定性能差，運(yùn)行費(fèi)用高等問題。重金屬微生物吸附是利用細(xì)菌、真菌和藻類等微生物為吸附劑吸附液相中的重金屬離子，再通過固液分離去除水溶液中金屬離子的一種方法。作為一種新興的重金屬去除技術(shù)，微生物吸附在處理低濃度重金屬工業(yè)廢水中顯示了獨特的優(yōu)勢，具有高效、低耗、去除率高、環(huán)境友好等特點。研究表明，低濃度重金屬離子廢水濃度低于100mg/l時，微生物吸附方法好于物理化學(xué)方法。因此，微生物吸附重金屬方法日益受到重視。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對低濃度含銅廢水中二價銅離子的去除問題，提供一株檸檬酸桿菌(citrobactersp.jpg1)及其在含重金屬銅離子廢水去除中的應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的檸檬酸桿菌(citrobactersp.jpg1)菌株，于2016年12月22日保藏于“中國微生物菌種保藏中心管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所)”，保藏登記號為cgmccno.13480，建議分類命名為檸檬酸桿菌(citrobactersp.)。

本發(fā)明所提供的檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1菌株是從吉林省某尾礦庫的尾礦渣中分離。以二價銅離子為選擇壓力，在lb培養(yǎng)基中反復(fù)馴化培養(yǎng)獲得。

檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1菌株在lb瓊脂平板培養(yǎng)基上的菌落特征：菌落呈圓形，直徑為3mm、乳白色、表面凸起濕潤、邊緣整齊。

檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1菌株的細(xì)胞特征：細(xì)胞呈球桿狀，表面略顯粗糙，細(xì)胞大小為0.5×0.8～1μm。

檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1菌株的生理生化特征：革蘭氏陽性，甲基紅、產(chǎn)吲哚試驗、葡萄糖發(fā)酵試驗、接觸酶試驗和檸檬酸鹽還原試驗反應(yīng)結(jié)果為陽性，v-p試驗結(jié)果為陰性。

檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1菌株的16srrna基因序列特征：菌株jpg1的16srrna基因序列長度為1337bp(序列如列表所示)，在genebank中的登錄號為ku513787。通過與genebank同源序列比對可知，菌株jpg1與檸檬酸桿菌citrobacterfreundiihq010516b-1同源性達(dá)99％。

參照《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》(第8版)，根據(jù)菌株形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征，結(jié)合該菌的16srrna基因序列在genebank中的比對結(jié)果，分離的菌株jpg1鑒定為檸檬酸桿菌citrobactersp.。

本發(fā)明的另一個目的是提供采用檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1去除含銅廢水中cu²⁺的方法。

以檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1菌株為活性成分制備的生物制劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1，分離自從吉林省某尾礦庫的尾礦渣。檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1的活細(xì)胞可使初始cu²⁺分別為100mg/l、50mg/l的含銅廢水中cu²⁺的去除率分別為24％和44％。因此，本發(fā)明提供檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1菌株的活細(xì)胞可通過細(xì)胞壁的吸附和胞內(nèi)積累作用去除含銅廢水中的cu²⁺，在利用活性細(xì)菌的吸附作用去除含銅廢水中cu²⁺方面具有良好的應(yīng)用前景。

下面結(jié)合說明書附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并非對本發(fā)明的限制。

附圖說明

圖1為檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1在lb平板下生長的菌落形態(tài)照片(a)及其掃描電鏡圖片(b)

圖2為檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1菌株的生長曲線

圖3為檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1對重金屬銅的耐受程度

圖4為檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1活細(xì)胞對含銅廢水中的cu²⁺去除率

具體實施方式

下述實施在實例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑購買獲得。

下述實驗方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所有培養(yǎng)基中的溶劑均為蒸餾水。每個實驗均為3個平行，并設(shè)置空白對照實驗。

下述實驗方法中菌株jpg1的生物量采用od600表征，即采用分光光度法測定菌株jpg1培養(yǎng)液在波長為600nm的吸光度值。

下述實驗中采用的含銅廢水由cucl2·2h2o配制而成。含銅廢水中的初始cu²⁺濃度分別為100mg/l和50mg/l。

本發(fā)明中cu²⁺濃度采用火焰原子吸收(aa6300)測定。

實施例1.檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1的分離、純化和鑒定。

檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1分離過程中使用的lb液體培養(yǎng)基組成為：蛋白胨2g，酵母粉1g，nacl2g，水200ml，ph7.0～7.5。

lb固體培養(yǎng)基的組成為：在上述液體培養(yǎng)基中加入瓊脂16g/l。

檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1菌株分離自吉林省某尾礦庫的尾礦渣，具體富集、分離、純化過程如下：

將1g尾礦渣接種到生理鹽水中(裝液量為20ml/100ml三角瓶)，180rpm下振蕩24h。吸取1ml懸液于離心管中，上清液加入99ml新鮮滅菌lb液體培養(yǎng)基中，30℃、180r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24h。擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液，按5％接種量依次接種到含cu²⁺濃度為50、100、200mg/l的lb液體培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)2d。最后取馴化后的混合菌液1ml，加至9ml無菌水中，搖動混勻，稀釋為10^-1倍稀釋菌液，并依次稀釋為10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9不同稀釋倍數(shù)，選取10^-7、10^-8、10^-9稀釋倍數(shù)的菌液進(jìn)行涂布。吸取200ul菌液于事先倒好的lb固體平板上，用刮板均勻涂布，涂布完成后正面朝上，開蓋靜置數(shù)分鐘，待液體干燥，將平板封口，倒置于生化培養(yǎng)箱中，最終獲得一株耐銅的菌株，命名為jpg1。

采用形態(tài)觀察、生理生化鑒定和16srrna基因測序?qū)阩pg1進(jìn)行鑒定。

在lb培養(yǎng)基上的可見直徑為3mm、乳白色、表面凸起濕潤，邊緣整齊的菌落(圖1a)。電鏡下觀察，菌株細(xì)胞呈球桿狀，表面略顯粗糙，細(xì)胞大小為0.5×0.8～1μm(圖1b)。

生理生化鑒定結(jié)果：革蘭氏陽性，甲基紅、產(chǎn)吲哚試驗、葡萄糖發(fā)酵試驗、接觸酶試驗和檸檬酸鹽還原試驗反應(yīng)結(jié)果為陽性，v-p試驗結(jié)果為陰性。

菌株jpg1的16srrna基因序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析。將經(jīng)純化保存后的菌株接種到lb液體培養(yǎng)基180r/min中培養(yǎng)12h，離心收集菌體，重新懸浮，采用酚-氯仿法提取菌株的dna，0.8％瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測。采用細(xì)菌16srdna通用引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。其中，正向引物為27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')，反向引物為1492r(5'-ggctaccttgttacgactt-3')’。pcr反應(yīng)條件為：先94℃6min；然后94℃45s，54℃45s，72℃90s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測序。菌株jpg1的16srrna基因序列長度為1337bp，在genebank中的登錄號為ku513787。通過與genebank同源序列比對可知，菌株jpg1與檸檬酸桿菌citrobacterfreundiihq010516b-1同源性達(dá)99％。菌株jpg1的16srrna基因序列如下：

基于菌落特征、菌株形態(tài)、生理生化特征與16srrna測定結(jié)果，將篩選到的菌株鑒定并命名為檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1。該菌株已于2016年12月22日保藏于“中國微生物菌種保藏中心管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所)”，保藏登記號為cgmccno.13480。

實施例2.檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1菌株的生長曲線及其對cu²⁺的耐受程度檢驗。

為研究檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1的生長規(guī)律，將保存的菌種活化制成菌懸液按1％接種量接種到lb培養(yǎng)基中，在溫度為28℃、搖床搖速為180rpm的搖床培養(yǎng)96h，然后分別在0、3、6、9、12、18、24、32、36、48h取樣，測定菌液od600值，繪制檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1的生長曲線。檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1的生長曲線見圖2。檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1的生長周期一般為48h。適應(yīng)期約為0～9h；9～24h為對數(shù)生長期；24h后進(jìn)入穩(wěn)定期。

為研究檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1對cu²⁺的耐受程度，研究了該菌株在不同cu²⁺濃度抑制情況下的生長規(guī)律。將保存的菌懸液按1％接種量接種到lb培養(yǎng)基中，28℃、180rpm搖床培養(yǎng)8-12h。待菌液od600值生長到為0.2左右時混勻、分裝，加入梯度稀釋的含cu²⁺溶液，使各體系中cu²⁺濃度依次為0、0.25、0.5、1、2、3、4mm，繼續(xù)搖床培養(yǎng)96h，然后在0、6、12、24、36、48、60、72、84、96h取樣測定菌液od600值。檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1對cu²⁺的耐受情況下如圖3。實驗結(jié)果表明，檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1對cu²⁺的最小耐受濃度為3mm。當(dāng)cu²⁺濃度在0～3mm時，菌株jpg1可以生長。當(dāng)cu²⁺離子濃度為1mm時，對菌株jpg1的生長抑制率為50％。當(dāng)cu²⁺濃度為0.25mm時，菌株jpg1生長基本不受影響，其最大生物量與cu²⁺濃度為0mm時的最大生物量相同。因此，菌株jpg1是典型的cu²⁺耐受菌株，具有環(huán)境應(yīng)用前景。

實施例3.檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1對含銅廢水中cu²⁺的生物吸附

細(xì)菌活細(xì)胞對重金屬的吸附包括兩個階段：第一階段是細(xì)菌表面對重金屬的吸附作用，第二階段是重金屬離子直接經(jīng)由細(xì)胞表面的離子通道或者與酶結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞，在胞內(nèi)積累的過程。為研究檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1活細(xì)胞對含銅廢水中cu²⁺的吸附作用，取活細(xì)胞(1.0g/l)，加入人工配制的含銅廢水(cu²⁺濃度分別為50mg/l和100mg/l)，在搖床振蕩吸附24h后，離心取樣(8000r/min，5min)，測定上清濃度，計算吸附量。無菌水洗滌2次，收集菌體，加入10ml5mmedta，振蕩30min，再次離心，收集菌體和上清液，上清液中銅量即為活細(xì)胞表面吸附銅的量，菌體加濃硝酸微波消解后，測量濃度，即為細(xì)胞胞內(nèi)積累銅的量。菌株jpg1的活細(xì)胞對cu²⁺的胞外吸附和胞內(nèi)積累結(jié)果如圖4所示。當(dāng)銅離子初始濃度為50mg/l時，菌株jpg1對cu²⁺總吸附量為22mg/g，去除率為44％。其中，表面吸附量為15.3mg/g(占總吸附量的70％)，胞內(nèi)積累量為5.66mg/g(占吸附量的30％)。當(dāng)銅離子初始濃度為100mg/l時，菌株jpg1對cu²⁺總吸附量為24mg/g，去除率為24％。其中，表面吸附量為16.05mg/g(占總吸附量的67％)，胞內(nèi)積累量為6.06mg/g(占總吸附量的26％)。

由此可見，本發(fā)明提供的檸檬酸桿菌citrobactersp.jpg1可通過細(xì)胞外吸附和胞內(nèi)積累作用去除含銅廢水中cu²⁺，具備良好的應(yīng)用前景。

genbank數(shù)據(jù)庫中，獲得登錄號genbankaccessnumber-ku513787

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