本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種誘導pc-12細胞分化為神經(jīng)元的方法。

背景技術(shù)：

pc-12細胞是腎上腺嗜鉻細胞(chromaffincell)瘤克隆的細胞株，常取自小牛、大鼠、貓、豬等。既可分泌腎上腺素、去甲腎上腺素等兒茶酚胺類激素，又兼具神經(jīng)細胞的特性，如存在多種電壓依賴性的鈉、鉀、鈣離子通道及受體激活通道，嗜鉻細胞被作為分泌機制和膜離子通道研究中的經(jīng)典細胞模型。屬神經(jīng)峭源性，膜上有神經(jīng)生長因子ngf受體，受生理水平ngf誘導后，它們停止分裂，長出神經(jīng)突起，分化為具有交感神經(jīng)元特性的細胞，有神經(jīng)細胞特性，且可傳代培養(yǎng)，類型較為單一，細胞特性穩(wěn)定。被國內(nèi)外廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)方面的體外研究。

pc-12細胞的一個重要特性是，用神經(jīng)生長因子(ngf)處理后，在表型上獲得巨大的的變化和獲得大量的交感神經(jīng)元的屬性特征，并且能夠抑制細胞增殖和促進神經(jīng)突的生長。神經(jīng)生長因子(ngf)通過trka受體的行為來誘導分化。pc-12細胞的分化通常是通過半定量或定量形態(tài)學方法來評估。因此，我們需要解決的問題是如何誘導pc-12細胞分化成為神經(jīng)元，并使神經(jīng)元的功能和更接近真正的神經(jīng)元。l.a.green使細胞生長在25平方毫米的培養(yǎng)皿中，并用含有7.5％(v/v)胎牛血清、7.5％(v/v)馬血清、2mm羥乙基哌嗪乙硫磺酸和44mm碳酸氫鈉的dmem完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。按照培養(yǎng)標準保持在37℃、95％濕度和5％(v/v)二氧化碳的條件下培養(yǎng)。johanjaimemedinabenavente用含有10％(v/v)胎牛血清和10％(v/v)馬血清的dmem培養(yǎng)pc-12細胞。pc-12細胞培養(yǎng)在包被了多聚賴氨酸(pll)的氮化硅表面或塑料盤。保持在37℃、5％(v/v)二氧化碳的濕潤條件下培養(yǎng)。細胞形態(tài)分化后換新鮮的培養(yǎng)基培養(yǎng)，新鮮培養(yǎng)基中含有50ng/ml神經(jīng)生長因子(ngf)，或者不含有胎牛血清和馬血清。每3天換一次培養(yǎng)基，根據(jù)需要添加神經(jīng)生長因子(ngf)。chan-youngjeon用含有10％(v/v)的馬血清、5％(v/v)胎牛血清和抗生素(100單位/毫升的鏈霉素和100單位/毫升的青霉素)(lonza)的rpmi1640完全培養(yǎng)基，在37℃、5％(v/v)二氧化碳的條件下培養(yǎng)pc-12細胞。為了評估pc-12細胞的分化，細胞培養(yǎng)在用iv型膠原蛋白包被的60mm的培養(yǎng)皿中，細胞密度為5×10³個細胞/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，用含1％(v/v)的馬血清和0.5％(v/v)的胎牛血清的dmem培養(yǎng)基孵育12h。細胞用100ng/mlngf、100ng/mlbfgf、1mmdbcamp和2mg/ml但不含血清的含有抗生素的bsa處理2天。綜上，誘導pc-12細胞成為神經(jīng)元的方法有許多，什么樣的方法可以更好的誘導pc-12細胞成為神經(jīng)元還有待改進。本發(fā)明通過比較不同的誘導pc-12細胞成為神經(jīng)元的方法，旨在尋求一種更適合誘導pc-12細胞成為神經(jīng)元的方法。使嗜鉻細胞的神經(jīng)系統(tǒng)研究體外模型更貼近體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)狀態(tài)，為神經(jīng)系統(tǒng)研究奠定良好的方法學基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種誘導pc-12細胞分化為神經(jīng)元的方法。該方法可以顯著提高誘導細胞神經(jīng)突長度、形態(tài)更像是神經(jīng)元的感應，和細胞粘附能力更好，誘導細胞增殖緩慢，極大提高了pc-12細胞誘導效率。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述誘導pc-12細胞分化為神經(jīng)元的方法的應用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種誘導pc-12細胞分化為神經(jīng)元的方法，該方法是在pc-12細胞中加入誘導培養(yǎng)基和ngf(神經(jīng)生長因子)進行誘導分化形成神經(jīng)元；

所述的誘導培養(yǎng)基為opti-mem完全培養(yǎng)基。

所述的opti-mem完全培養(yǎng)基為通過向opti-mem培養(yǎng)基中添加0.5％(v/v)胎牛血清，或是添加0.5％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)馬血清得到的opti-mem完全培養(yǎng)基；優(yōu)選為通過向opti-mem培養(yǎng)基中添加0.5％(v/v)胎牛血清得到的opti-mem完全培養(yǎng)基。

所述的加入ngf為加入終濃度為25～100ng/ml的ngf；優(yōu)選為加入終濃度為50ng/ml的ngf。

所述的pc-12細胞優(yōu)選為大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(pc-12)。

所述的誘導分化的條件為37℃，5％(v/v)co2條件下培養(yǎng)6～7天。

所述的誘導培養(yǎng)基隔天更換一次。

所述的誘導pc-12細胞分化為神經(jīng)元的方法，可將pc-12細胞接種于含0.5％(v/v)胎牛血清(fbs)的opti-mem完全培養(yǎng)基中，再添加終濃度為50ng/ml的ngf進行誘導分化，或是將終濃度為50ng/ml的ngf先加入含0.5％(v/v)胎牛血清(fbs)的opti-mem完全培養(yǎng)基中，然后再接種pc-12細胞進行誘導分化。

所述的pc-12細胞的接種密度約為3.0×10⁴個/ml。

所述的誘導pc-12細胞分化為神經(jīng)元的方法在神經(jīng)生物學和神經(jīng)藥理學研究模型中的應用。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

1、發(fā)明的目的在于更高效的誘導pc-12細胞的分化，同時，改善誘導后的pc-12細胞的神經(jīng)元特征，使其更貼近體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元的狀態(tài)，能更好的模擬各種實驗處理中神經(jīng)元的應答，使體外實驗的實際可行性及真實性得到提高和認可。為pc-12細胞在神經(jīng)系統(tǒng)研究中奠定良好的方法學基礎(chǔ)。

2、目前誘導pc-12細胞成為神經(jīng)元的方法多種多樣，最常用的是rpmi1640作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基來誘導pc-12分化為神經(jīng)元。本發(fā)明采用的是opti-mem作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基來誘導pc-12分化為神經(jīng)元。相對于傳統(tǒng)誘導pc-12細胞分化的方法具有如下的優(yōu)點及效果:(1)本發(fā)明提供了opti-mem完全培養(yǎng)基的一種新用途，應用于培養(yǎng)誘導pc-12細胞分化成具有神經(jīng)元特征的細胞；(2)用ngf誘導分化opti-mem完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的pc-12細胞，分化后的pc-12細胞的突起長度顯著性增加，且分化率也顯著性提高；(3)用ngf誘導分化opti-mem完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的pc-12細胞，分化后的pc-12細胞粘附率、增殖率都顯著性提高；(4)用ngf誘導分化opti-mem完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的pc-12細胞，分化后的pc-12細胞中的gap-43和突觸素-1(synapsin-1)的蛋白表達量也顯著性增加。

3、本發(fā)明采用的是opti-mem完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的pc-12細胞，i減血清培養(yǎng)基是emem的改良型，其中使用了hepes(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)和2400mg/l的碳酸氫鈉進行緩沖，并添加次黃嘌呤、胸腺嘧啶、丙酮酸鈉、l-谷氨酰胺、微量元素和生長因子，以及減量至1.1mg/l的酚紅。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中利用opti-mem培養(yǎng)基與傳統(tǒng)培養(yǎng)基誘導pc-12細胞分化的突起長度及分化率的對比圖；其中，圖a為pc-12細胞突起長度的對比圖，圖b為分化率的對比圖，圖c為免疫熒光拍照圖。

圖2是本發(fā)明中不同濃度ngf對pc-12細胞分化的影響圖；其中，圖a～c為pc-12細胞在不同培養(yǎng)基和不同濃度ngf條件下，在2、4、6天神經(jīng)突起的長度比較圖；圖d為pc-12細胞在不同培養(yǎng)基和不同濃度ngf條件下的形態(tài)學比較圖。

圖3是本發(fā)明中利用不同培養(yǎng)基誘導分化pc-12細胞，細胞在不同時間點的粘附情況對比圖。

圖4是本發(fā)明中利用不同培養(yǎng)基誘導分化pc-12細胞，細胞在不同時間點增殖情況對比圖。

圖5是本發(fā)明中利用westernblot分析gap-43和突觸素-1(synapsin-1)的蛋白表達情況圖；其中，圖a和b為突觸素-1和gap-43的western蛋白表達圖；圖c和d是突觸素-1和gap-43兩種蛋白表達的定量圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實驗材料：

胎牛血清(fbs)：(invitrogen，gibco，美國)；馬血清(hs)：(invitrogen，gibco，美國)；opti-mem培養(yǎng)基：(invitrogen，gibco，美國)；rpmi1640培養(yǎng)基：(invitrogen，gibco，美國)；ngf(神經(jīng)生長因子)：(中國，武漢海特生物制藥股份有限公司，注射用鼠神經(jīng)生長因子ngf)；pc-12細胞(大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞)：(中國，中國科學院上海生化與細胞所)；基質(zhì)膠(matrigel)：美國bd公司。

實施例1：誘導pc-12分化神經(jīng)元的幾種不同的條件的比較

用含0.5％(v/v)胎牛血清(fbs)和/或1％(v/v)馬血清(hs)的opti-mem完全培養(yǎng)基，以及含0.5％(v/v)胎牛血清(fbs)和/或1％(v/v)馬血清(hs)的rpmi1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)pc-12細胞(培養(yǎng)皿中接種3ml約3.0*10⁴/ml的pc-12細胞，共計1.0*10⁵個細胞)，在37℃，5％(v/v)co2條件下用終濃度為50ng/ml的ngf誘導分化，繼續(xù)培養(yǎng)。量化pc-12細胞的分化情況，我們以七天為一個周期，統(tǒng)計分析細胞的突起長度及分化率(使用分析軟件imageproplus測量突起長度)。

結(jié)果如圖1所示，突起長度統(tǒng)計結(jié)果顯示，含0.5％(v/v)胎牛血清(fbs)的opti-mem完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的pc-12細胞在終濃度為50ng/ml的ngf誘導條件下，分化的突起長度及分化率最佳。含0.5％(v/v)胎牛血清(fbs)和1％(v/v)馬血清(hs)的opti-mem完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的pc-12細胞在終濃度為50ng/ml的ngf誘導條件下，分化的突起長度及分化率較只含0.5％(v/v)胎牛血清(fbs)的opti-mem完全培養(yǎng)基略有下降，但比傳統(tǒng)方法的rpmi1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的pc-12細胞顯著性提高。

實施例2：ngf對誘導pc-12細胞分化成神經(jīng)元的影響

用含0.5％(v/v)胎牛血清(fbs)的opti-mem完全培養(yǎng)基及含0.5％(v/v)胎牛血清(fbs)的rpmi1640完全培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)條件，探究不同濃度ngf(終濃度為25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml)在不同時間點(培養(yǎng)2天、4天、6天)對pc-12細胞分化的影響；其中，加入等體積的不含ngf的pbs(濃度為0.01m，ph7.4)與不同濃度的ngf作為對比。

結(jié)果如圖2所示，其中，圖2a～2c為pc-12細胞在opti-mem和1640組在2、4、6天神經(jīng)突起的長度比較；圖d為pc-12細胞在opti-mem+0.5％fbs和1640+0.5％fbs培養(yǎng)條件下，加入25，50和100ng/ml神經(jīng)生長因子的形態(tài)學比較。從圖中可以看出，當ngf的濃度達到50ng/ml，對pc-12細胞分化的突起長度影響不大，即為ngf誘導分化的上限濃度。同時，opti-mem完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果較傳統(tǒng)的rpmi1640完全培養(yǎng)基有顯著性的提高。

實施例3：opti-mem培養(yǎng)基對分化后pc-12細胞粘附的改善

用含0.5％(v/v)胎牛血清(fbs)的opti-mem完全培養(yǎng)基及含0.5％(v/v)胎牛血清(fbs)的rpmi1640完全培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)條件，用終濃度為50ng/mlngf誘導分化pc-12細胞，在下一個時間周期(7天為一個周期)的不同時間點(0.5h，1h，2h，3h，4h，5h，6h)檢測細胞的粘附情況，檢測的方法如下：96孔板中分別加入50μl基質(zhì)膠(matrigel)，37℃、5％(v/v)co2孵育1h，pbs沖洗2次后加入1.0*10⁵/ml密度的pc-12細胞懸液100ul，在37℃、5％(v/v)co2培養(yǎng)0.5、1、2、3、4、5、6h。每組有一半孔不用pbs洗，另一半的孔用溫熱(37℃水浴鍋，水浴30分鐘)的pbs洗去未黏附的細胞，然后通過mtt實驗，測各孔的吸光度值(a值)，其中，粘附率＝黏附細胞a值/全部細胞a值。

結(jié)果如圖3所示，圖3為pc-12細胞在含0.5％(v/v)胎牛血清(fbs)的opti-mem完全培養(yǎng)基培養(yǎng)、終濃度為50ng/ml的ngf誘導條件下以及在含0.5％(v/v)胎牛血清(fbs)的1640完全培養(yǎng)基、終濃度為50ng/ml的ngf誘導條件下的培養(yǎng)結(jié)果。從圖中可以看出，opti-mem完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果較傳統(tǒng)的rpmi1640完全培養(yǎng)基有顯著性的提高，最高粘附率分別為85％和64％。

實施例4：opti-mem培養(yǎng)基對分化后pc-12細胞增殖的改善

用含0.5％(v/v)胎牛血清(fbs)的opti-mem完全培養(yǎng)基及含0.5％(v/v)胎牛血清(fbs)的rpmi1640完全培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)條件，用終濃度為50ng/mlngf誘導分化pc-12細胞一個周期(7天為一個周期)。通過mtt實驗來檢測兩種條件下，不同時間點的細胞增殖情況(接種6塊96孔板，起始細胞數(shù)都為8*10³～1.0*10⁴/孔，每天測一塊板的細胞數(shù)，連續(xù)測6天)。

mtt結(jié)果如圖4所示，圖4是pc-12細胞在opti-mem+0.5％fbs+50ng/mlngf以及在1640+0.5％fbs+50ng/mlngf培養(yǎng)條件下，pc-12細胞的增值情況的對比。在opti-mem+0.5％fbs+50ng/mlngf培養(yǎng)條件下pc-12細胞增值緩慢，表明在此條件下更多的pc-12細胞向分化方向發(fā)展；而在1640+0.5％fbs+50ng/mlngf培養(yǎng)條件下，細胞增值更快，表明更多的pc-12細胞向增值方向發(fā)展。結(jié)果說明了opti-mem完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果較傳統(tǒng)的rpmi1640完全培養(yǎng)基有顯著性的提高。

實施例5：opti-mem培養(yǎng)基改善分化后pc-12細胞中神經(jīng)元相關(guān)蛋白表達

用含0.5％(v/v)胎牛血清(fbs)的opti-mem完全培養(yǎng)基及含0.5％(v/v)胎牛血清(fbs)的rpmi1640完全培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)條件，用終濃度為50ng/mlngf誘導分化pc-12細胞一個周期(7天為一個周期)。培養(yǎng)高密度(6孔板中，每孔8.0*10⁴個細胞)的pc-12細胞以得到足夠分析的蛋白含量。通過westernblot分析gap-43(軸突膜蛋白)和突觸素-1(synapsin-1)的蛋白表達量。

結(jié)果如圖5所示，westernblot分析結(jié)果顯示，較傳統(tǒng)的rpmi1640完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，opti-mem完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下gap-43和突觸素-1的蛋白表達量均有顯著性的提高(圖5a和5b)。且在未經(jīng)ngf誘導分化的pc-12細胞中g(shù)ap-43的蛋白表達水平極低，ngf誘導分化后的2，4，6天gap-43的蛋白表達水平顯著性上升(圖5d)。同樣的，突觸素-1的表達水平在ngf誘導分化后的2，4，6天也顯著性提高(圖5c)。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。