本發(fā)明屬于環(huán)境污染微生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株能夠降解土壤殘留二氯喹啉酸的菌株。

背景技術(shù)：

煙草（nicotianatabacum）屬茄科一年生或有限多年生草本植物，起源于南美洲，目前種植遍布世界各地。煙草是一種特殊的經(jīng)濟(jì)作物，我國自1982年實(shí)行煙草專賣制度以來，煙草行業(yè)得到長足發(fā)展并成為國民經(jīng)濟(jì)的一個(gè)重要支柱產(chǎn)業(yè)。煙草在我國南北各省區(qū)均有種植，其主要用途為加工煙葉生產(chǎn)卷煙。因此，優(yōu)質(zhì)的煙葉是煙草生產(chǎn)的重要目標(biāo)，如何保證優(yōu)質(zhì)的煙葉也是煙農(nóng)關(guān)心的重要問題。在福建，煙草種植主要以稻煙輪作方式為主，然而上茬作物水稻常用的農(nóng)藥如除草劑的使用，嚴(yán)重影響了后茬煙草的生長。煙草對除草劑較為敏感，隨著除草劑在水稻田的廣泛使用，煙草生產(chǎn)受到除草劑藥害的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，給煙草生產(chǎn)帶來極大的危害。

已有研究表明二氯喹啉酸施用后，在美國阿肯色州有研究者檢測到水稻田附近水域二氯喹啉酸的殘留量可達(dá)μg/l級(jí);利用測滲計(jì)模擬水稻田施用二氯喹啉酸的環(huán)境行為，結(jié)果表明95%殘留在水稻田的30cm表層土壤中。土壤中殘留的二氯喹啉酸會(huì)影響煙草植株的畸形生長，導(dǎo)致新葉向葉背卷縮，隨后逐漸發(fā)展成線狀鼠尾狀葉形。由于二氯喹啉酸的藥害，烤煙的產(chǎn)量和產(chǎn)值均明顯降低，嚴(yán)重危害時(shí)可降低80%以上，甚至絕收。

微生物法降解殘留農(nóng)藥具有環(huán)境友好，無污染，高效等特點(diǎn)，因此利用生物進(jìn)行環(huán)境修復(fù)是近年來的研究熱點(diǎn)。本發(fā)明通過田間長期使用二氯喹啉酸的土壤中分離篩選獲得降解菌株，本發(fā)明所采用的菌株為泛菌屬菌株，目前尚未見泛菌屬用于土壤殘留二氯喹啉酸降解的報(bào)道；本發(fā)明菌株來源于土壤，具有環(huán)境友好的特點(diǎn)。采用生物法解除煙田殘留除草劑二氯喹啉酸不僅能降低藥害帶給煙草的經(jīng)濟(jì)損失，而且也對保護(hù)環(huán)境，凈化土壤有不可小覷的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述二氯喹啉酸在土壤中殘留導(dǎo)致煙草產(chǎn)量和產(chǎn)值降低的問題，本發(fā)明提供一株能夠降解土壤殘留二氯喹啉酸的菌株。該菌株可有效降解土壤中殘留的二氯喹啉酸，從而提高煙草產(chǎn)量。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一株能夠降解土壤殘留二氯喹啉酸的菌株，經(jīng)鑒定，該菌株為泛菌j7(pantoeasp.j7)；保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路珞珈山，郵政編碼：430072；保藏日期為2017年3月16日，保藏編號(hào)為cctccm2017131。

本發(fā)明菌株j7通過如下方法富集得到：

本實(shí)驗(yàn)從福建煙田采集土壤，利用富集法篩選獲得，其篩選過程如下：

（1）二氯喹啉酸降解菌的富集：取0.1g土壤與100mlmm培養(yǎng)基混合，并加入二氯喹啉酸使其終濃度為100μg/ml，于30℃，150r/min培養(yǎng)1周；取培養(yǎng)液1ml加入100ml含同樣濃度除草劑的新鮮培養(yǎng)基中，同時(shí)于固體培養(yǎng)基劃線以確認(rèn)有細(xì)菌生長，同樣條件培養(yǎng)1周；連續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)10次后，經(jīng)平板劃線分離，獲得單菌落菌株。該菌為革蘭氏陰性菌，菌落呈淡黃色，表面光滑，圓形，邊緣整齊。

（2）液相色譜測定該菌降解率：將所得菌株分別置于含有5μg/ml二氯喹啉酸和不含二氯喹啉酸的mm培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以不加菌液只含相同濃度二氯喹啉酸的mm培養(yǎng)基為參照，利用高效液相色譜法進(jìn)行測定；取樣時(shí)間分別為第6d和第23d，樣品體積為1ml；將樣品在8000r/min條件下離心10min,上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后用于hplc分析，每個(gè)處理三次重復(fù)。hplc檢測條件為：固定相為c18柱（4.6×250nm，5μm，安捷倫）；流動(dòng)相為甲醇+0.5%乙酸水（體積比為65:35）；流速為1.0ml/min；柱溫為30℃；檢測波長為240nm；進(jìn)樣體積為10μl。

利用（2）中所述檢測條件對該菌株的二氯喹啉酸降解能力進(jìn)行檢測，并通過下列公式求得其二氯喹啉酸降解率：

本發(fā)明所述的菌株j7可用于降解二氯喹啉酸。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明通過田間長期使用二氯喹啉酸的土壤中分離篩選獲得降解菌株，采用生物法降解煙田殘留除草劑二氯喹啉酸不僅能降低藥害帶給煙草的經(jīng)濟(jì)損失，而且也對保護(hù)環(huán)境，凈化土壤有不可小覷的意義。

附圖說明

圖1富集法篩選可降解二氯喹啉酸的微生物菌株流程圖；

圖2j7菌落形態(tài)圖：菌落呈淡黃色，表面光滑，圓形，邊緣整齊；

圖3標(biāo)準(zhǔn)品二氯喹啉酸（5mg/l）在mm培養(yǎng)基及甲醇中的色譜圖。a為mm培養(yǎng)基，b為添加菌液的mm培養(yǎng)基，c為添加二氯喹啉酸的mm培養(yǎng)基，d為溶解在甲醇中的二氯喹啉酸；

圖4高效液相色譜法檢測二氯喹啉酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖5mm培養(yǎng)基中添加菌株j7培養(yǎng)6d和23d后對二氯喹啉酸的降解率；

圖6土壤中不同濃度二氯喹啉酸對煙苗生長的影響：從左至右依次分別表示未加藥的清水對照（ck），添加0.001μg/g、0.01μg/g及0.1μg/g二氯喹啉酸的處理；

圖7土壤中含不同濃度二氯喹啉酸對煙苗生長各指標(biāo)的影響：葉面積（a）、葉片數(shù)（b）、株高（c）的影響；

圖8菌株j7在含二氯喹啉酸的土壤中對煙苗生長的影響：a圖從左至右依次分別表示清水對照（ck）、添加菌株j7、添加0.01μg/g二氯喹啉酸、同時(shí)添加菌株j7和0.01μg/g二氯喹啉酸的處理；b圖從左至右依次分別表示清水對照（ck）、添加菌株j7、添加0.1μg/g二氯喹啉酸、同時(shí)添加菌株j7和0.1μg/g二氯喹啉酸的處理；

圖9菌株j7在含二氯喹啉酸的土壤中對煙苗各生長指標(biāo)的影響：橫坐標(biāo)從左至右依次分別表示清水對照（ck）、添加菌株j7、0.01μg/g及0.1μg/g二氯喹啉酸、同時(shí)添加菌株j7和0.01及0.1μg/g二氯喹啉酸的處理；a圖為以上條件對葉面積的影響，b圖為對葉片數(shù)的影響，c圖為對株高的影響。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1菌株j7的篩選

本試驗(yàn)從煙田采集土壤，利用富集法篩選可降解二氯喹啉酸的微生物菌株，過程如圖1所示。本試驗(yàn)篩選得到一株可以降解土壤二氯喹啉酸的菌株，將其命名為j7；其篩選過程如下：

（1）二氯喹啉酸降解菌的富集：取0.1g土壤與100mlmm培養(yǎng)基混合，并加入二氯喹啉酸使其終濃度為100μg/ml，于30℃，150r/min培養(yǎng)1周；取培養(yǎng)液1ml加入100ml含同樣濃度除草劑的新鮮培養(yǎng)基中，同時(shí)于固體培養(yǎng)基劃線以確認(rèn)有細(xì)菌生長，同樣條件培養(yǎng)1周；連續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)10次后，經(jīng)平板劃線分離，獲得單菌落菌株。該菌為革蘭氏陰性菌，菌落呈淡黃色，表面光滑，圓形，邊緣整齊；其菌落形態(tài)圖見圖2。

（2）液相色譜測定該菌降解率：將所得菌株分別置于含有5μg/ml二氯喹啉酸和不含二氯喹啉酸的mm培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以不加菌液只含相同濃度二氯喹啉酸的mm培養(yǎng)基為參照，利用高效液相色譜法進(jìn)行測定；取樣時(shí)間分別為第6d和第23d，樣品體積為1ml；將樣品在8000r/min條件下離心10min,上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后用于hplc分析，每個(gè)處理三次重復(fù)。hplc檢測條件為：固定相為c18柱（4.6×250nm，5μm，安捷倫）；流動(dòng)相為甲醇+0.5%乙酸水（體積比為65:35）；流速為1.0ml/min；柱溫為30℃；檢測波長為240nm；進(jìn)樣體積為10μl。其色譜圖見圖3，結(jié)果表明在該條件下，可以很好的地將二氯喹啉酸的目標(biāo)峰與雜質(zhì)分離開。

（3）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：用色譜甲醇配制得到500μg/ml二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再用色譜甲醇稀釋得到0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0和10.0μg/ml二氯喹啉酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣，獲得的峰面積與藥液濃度作相關(guān)圖，求相關(guān)系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，結(jié)果表明不同濃度二氯喹啉酸與峰面積間的線性相關(guān)系數(shù)r為0.9980；表明二氯喹啉酸含量與響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系。

利用（2）中所述檢測條件對該菌株的二氯喹啉酸降解能力進(jìn)行測定，并通過下列公式求得其二氯喹啉酸降解率：

測定結(jié)果如圖5所示，表明培養(yǎng)6d后，菌株j7對二氯喹啉酸的降解率為4%；培養(yǎng)23d后，菌株j7對二氯喹啉酸的降解率為39%。由此可見菌株j7對土壤中的二氯喹啉酸具有較佳的降解能力。

實(shí)施例2分子鑒定

利用細(xì)菌16srdna通用引物fd2/rp1，通過菌落pcr擴(kuò)增菌株的16srdna測序后進(jìn)行對比分析鑒定菌株：

fd2：5’-agagtttgatcatggctcag-3’，

rp1：5’-acggttaccttgttacgactt-3’；

pcr反應(yīng)體系：pcr反應(yīng)體系為：1×pcrmix反應(yīng)液（全式金生物科技有限公司，北京），0.4μm引物，并利用牙簽挑取少量菌落作為模板；

pcr反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4min后進(jìn)行32次循環(huán)，每次循環(huán)包括95℃變性30s，58℃退火30s及72℃延伸1min；最后在72℃再延伸10min。

pcr產(chǎn)物j7-16srdna經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后進(jìn)行dna回收、測序，測序結(jié)果與genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，本發(fā)明篩選所得菌株j7的序列與genbank中的泛菌屬pantoeaagglomerans（登錄號(hào)am184264.1和kc764985.1）同源性達(dá)99%。經(jīng)鑒定，菌株j7為泛菌屬(pantoeasp.)，編號(hào)j7，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路珞珈山，郵政編碼：430072；保藏日期為2017年3月16日，保藏編號(hào)為cctccm2017131。

實(shí)施例3煙苗實(shí)驗(yàn)：菌株j7的防治效果

（1）測定土壤中藥液對煙苗產(chǎn)生藥害的的濃度：分別配置含有0、0.001、0.01和0.1μg/g二氯喹啉酸藥液的營養(yǎng)土，均勻攪拌后等量裝入花盆，移栽入生長情況相似的煙苗，40天后觀察煙草生長情況，并測定煙苗株高、葉面積和葉片數(shù)等參數(shù)。每處理5次重復(fù)。結(jié)果表明當(dāng)二氯喹啉酸為0.001μg/g土壤時(shí)，藥害不明顯；當(dāng)二氯喹啉酸為0.01μg/g和0.1μg/g土壤時(shí)，藥害明顯（圖6）。藥害主要表現(xiàn)為葉片面積縮小，同時(shí)對株高有一定的影響，但是對葉片數(shù)無明顯抑制作用（圖7）。

（2）測定菌株j7在有二氯喹啉酸藥害的土壤中對煙苗生長的影響：分別配置含有0.01和0.1μg/g藥液的營養(yǎng)土，均勻攪拌后等量裝入花盆。然后添加100ml新鮮菌液(od=0.2)于土壤中。試驗(yàn)中設(shè)置處理包括：清水對照（ck）、添加菌株j7、添加二氯喹啉酸、同時(shí)添加菌株j7和二氯喹啉酸的營養(yǎng)土處理，每個(gè)處理包括5次重復(fù)。7d后將生長情況相近的煙苗移栽入花盆中，于溫室中自然光照下培養(yǎng)40d，調(diào)查不同處理中煙苗的生長情況，并測定煙苗株高、葉面積和葉片數(shù)等參數(shù)。

煙苗生長情況如圖8所示，各生長指標(biāo)情況如圖9所示。圖8表明在產(chǎn)生藥害的土壤中添加菌液后，發(fā)現(xiàn)菌株j7能明顯降低藥害作用。圖9表明，與不加菌液只含藥劑的處理相比，j7菌株能顯著增大最大葉面積，且對增加葉片數(shù)及提高株高度也有一定作用。煙苗試驗(yàn)結(jié)果與mm培養(yǎng)基中檢測到的降解效果一致。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>福建農(nóng)林大學(xué)

中國煙草總公司福建省公司

<120>一株能夠降解土壤殘留二氯喹啉酸的菌株

<130>3

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

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