本發(fā)明涉及植物dna制備技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種改良試劑盒法從微量干燥葉片中提取dna的方法。

背景技術(shù)：

核酸是構(gòu)成生命體中基本遺傳物質(zhì)的主要化合物，從核酸分子水平系統(tǒng)深入的研究是認(rèn)識各種生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)。植物dna的提取主要用于基因文庫構(gòu)建、pcr分析及southern雜交等，因此高質(zhì)量的dna的獲得對于功能基因組學(xué)以及遺傳學(xué)研究具有重要意義。目前，在植物提取dna的研究中，已經(jīng)發(fā)展了多種方法，成功地從植物葉片、愈傷組織、組培苗、果實(shí)、初皮部等組織器官中提取出dna。這些方法多采用新鮮或冷凍的材料，但對于野外，尤其是遠(yuǎn)距離采樣，攜帶冰壺或液氮非常不方便，這需要在提取dna前對樣本作一些特殊的處理，有研究發(fā)現(xiàn)通過硅膠干燥后的片可用于植物基因組dna的提取，但是不論幼嫩的葉片或成熟的葉片，雖葉片迅速失水，但在植物葉片組織中還含有大量的多糖、多酚、蛋白和酯類等植物次生代謝產(chǎn)物及降解的dna，這使得提取dna的常出現(xiàn)產(chǎn)量低、質(zhì)量差、易降解，影響了dna質(zhì)量和純度，不能被限制性內(nèi)切酶酶切，嚴(yán)重的甚至不能作為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，用新鮮葉片材料提取有著很大的差異。

生態(tài)建設(shè)、環(huán)境保護(hù)日益受到大家的關(guān)注，植物是重要的自然資源環(huán)境要素，對于維持生態(tài)平衡和發(fā)展經(jīng)濟(jì)有著重要作用，然而隨著科技的發(fā)展,我們的生活日益提高.可是,我們的地球卻受到了危害，森林資源遭受嚴(yán)重的破壞，許多珍貴的植物資源遭到毀滅性的打擊，因此，植物dna的提取研究對植物的就地保護(hù)、種質(zhì)資源收集保存及種源培育工作尤為重要。

目前，關(guān)于植物dna提取方法的報道絕大部分都是在sds法和ctab法基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，但都無法擺脫用研磨棒或玻璃棒對樣品逐個研磨的操作步驟，且提取步驟繁瑣耗時,傳統(tǒng)的ctab法是目前應(yīng)用最廣泛的dna提取方法，但是該方法在提取植物干燥葉片時，殘留了大量的蛋白糖類物質(zhì)，影響到后續(xù)的pcr擴(kuò)增、遺傳多態(tài)性分析研究,迄今，還未見針對植物干燥葉片中提取高質(zhì)量dna的研究報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的提取復(fù)雜繁瑣、無法提取高質(zhì)量dna的缺陷，提供一種改良試劑盒法從微量干燥葉片中提取dna的方法來解決上述問題。

本發(fā)明公開了一種改良試劑盒法從微量干燥葉片中提取dna的方法，具體步驟為：

(1)、取20mg干燥海葉片組織加入到2.0ml冷凍研磨離心管中，并放入1個已滅菌鋼珠，液氮冷凍3-5min，將離心管放入研磨儀中研磨8-12min，得到干粉；

(2)、將步驟(1)得到的干粉加入500ullp1和6ulrnase，渦旋震蕩1min，室溫放置15min，期間上下顛倒5-10次；

(3)、向步驟(2)中產(chǎn)品加入130ul緩沖液lp2，渦旋震蕩1min；

(4)、將步驟(3)中的離心管置于離心機(jī)中，12000rpm(～13400*g)離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中；

(5)、向步驟(4)得到的上清液中加入1.5倍的緩沖液lp3，充分震蕩混勻15-30sec；

(6)、將步驟(5)得到的溶液及沉淀全部加入同一個吸附柱cb3中，將吸附柱放入收集管中，12000rpm(～13400*g)離心30sec，倒掉廢液，重新將吸附柱cb3放回收集管中；

(7)、向吸附柱中加入600ul漂洗液pw,12000rpm(～13400*g)離心30sec，倒掉廢液，重復(fù)此步驟一次；

(8)、將吸附柱放回收集管中，12000rpm(～13400*g)離心3min，倒掉廢液，將吸附柱放入新的1.5ml離心管中，室溫放置5-10min，徹底晾干吸附柱中的殘余漂洗液，得到吸附膜；

(9)、向吸附膜中間部位懸空加入50ul無核酸酶水，室溫放置5min，12000rpm(～13400*g)離心5min，取出并丟棄吸附柱；

(10)、對dna濃度及純度檢測，-20℃保存樣本。

作為優(yōu)選，所述的步驟(1)中，在將離心管放入研磨儀之前，需要對研磨儀先預(yù)冷；

作為優(yōu)選，所述的步驟(1)中，在將干燥海葉片組織加入冷凍研磨離心管之前，先使用無菌水配置的80％乙醇進(jìn)行沖洗，晾干后，將海葉片組織剪碎；

作為優(yōu)選，所述的步驟(2)中，所述的rnase的濃度為10mg/ml；

作為優(yōu)選，所述的步驟(4)中，在將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管的過程中，不要碰到沉淀；

作為優(yōu)選，所述的步驟(9)中，在將無核酸酶水加入吸附膜中間部位時，需要先將無核酸酶水預(yù)熱至65℃。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

根據(jù)本發(fā)明，在傳統(tǒng)試劑盒與研磨法的基礎(chǔ)上，靈活調(diào)整步驟，使干燥葉片快速高效的研磨成粉末抽提dna，能夠從微量干燥葉片中提取高質(zhì)量的基因組dna，提取比較便捷。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的實(shí)施例與ctab法抽提dna的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2是改良試劑盒法抽提dna，2ul稀釋10倍稀釋后dnapcr電泳圖。

具體實(shí)施方式

下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

本發(fā)明公開了一種改良試劑盒法從微量干燥葉片中提取dna的方法，具體步驟為：

(1)、取20mg干燥海葉片組織加入到2.0ml冷凍研磨離心管中，并放入1個已滅菌鋼珠，液氮冷凍3-5min，將離心管放入研磨儀中研磨8-12min，得到干粉；

(2)、將步驟(1)得到的干粉加入500ullp1和6ulrnase，渦旋震蕩1min，室溫放置15min，期間上下顛倒5-10次；

(3)、向步驟(2)中產(chǎn)品加入130ul緩沖液lp2，渦旋震蕩1min；

(4)、將步驟(3)中的離心管置于離心機(jī)中，12000rpm(～13400*g)離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中；

(5)、向步驟(4)得到的上清液中加入1.5倍的緩沖液lp3，充分震蕩混勻15-30sec；

(6)、將步驟(5)得到的溶液及沉淀全部加入同一個吸附柱cb3中，將吸附柱放入收集管中，12000rpm(～13400*g)離心30sec，倒掉廢液，重新將吸附柱cb3放回收集管中；

(7)、向吸附柱中加入600ul漂洗液pw,12000rpm(～13400*g)離心30sec，倒掉廢液，重復(fù)此步驟一次；

(8)、將吸附柱放回收集管中，12000rpm(～13400*g)離心3min，倒掉廢液，將吸附柱放入新的1.5ml離心管中，室溫放置5-10min，徹底晾干吸附柱中的殘余漂洗液，得到吸附膜；

(9)、向吸附膜中間部位懸空加入50ul無核酸酶水，室溫放置5min，12000rpm(～13400*g)離心5min，取出并丟棄吸附柱；

(10)、對dna濃度及純度檢測，-20℃保存樣本。

作為優(yōu)選，所述的步驟(1)中，在將離心管放入研磨儀之前，需要對研磨儀先預(yù)冷；

作為優(yōu)選，所述的步驟(1)中，在將干燥海葉片組織加入冷凍研磨離心管之前，先使用無菌水配置的80％乙醇進(jìn)行沖洗，晾干后，將海葉片組織剪碎；

作為優(yōu)選，所述的步驟(2)中，所述的rnase的濃度為10mg/ml；

作為優(yōu)選，所述的步驟(4)中，在將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管的過程中，不要碰到沉淀；

作為優(yōu)選，所述的步驟(9)中，在將無核酸酶水加入吸附膜中間部位時，需要先將無核酸酶水預(yù)熱至65℃。

實(shí)施例1

本發(fā)明公開了一種改良試劑盒法從微量干燥葉片中提取dna的方法，具體步驟為：

(1)、取同種植物的不同生長時期干燥海葉片組織20mg，使用無菌水配置的80％乙醇進(jìn)行沖洗，并將晾干葉片剪碎并轉(zhuǎn)移至2.0ml冷凍研磨離心管中，并放入1個已滅菌鋼珠，液氮冷凍4min，并將離心管放入液氮預(yù)冷研磨儀中研磨10min，得到干粉；

(2)、將步驟(1)得到的干粉加入500ullp1和6ulrnase，渦旋震蕩1min，室溫放置15min，期間上下顛倒7次；

(3)、向步驟(2)中產(chǎn)品加入130ul緩沖液lp2，渦旋震蕩1min；

(4)、將步驟(3)中的離心管置于離心機(jī)中，12000rpm(～13400*g)離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中；

(5)、向步驟(4)得到的上清液中加入1.5倍的緩沖液lp3，充分震蕩混勻20sec；

(6)、將步驟(5)得到的溶液及沉淀全部加入同一個吸附柱cb3中，將吸附柱放入收集管中，12000rpm(～13400*g)離心30sec，倒掉廢液，重新將吸附柱cb3放回收集管中；

(7)、向吸附柱中加入600ul漂洗液pw,12000rpm(～13400*g)離心30sec，倒掉廢液，重復(fù)此步驟一次；

(8)、將吸附柱放回收集管中，12000rpm(～13400*g)離心3min，倒掉廢液，將吸附柱放入新的1.5ml離心管中，室溫放置7min，徹底晾干吸附柱中的殘余漂洗液，得到吸附膜；

(9)、向吸附膜中間部位懸空加入50ul無核酸酶水，室溫放置5min，12000rpm(～13400*g)離心5min，取出并丟棄吸附柱；

(10)、對dna濃度及純度檢測，-20℃保存樣本。

作為優(yōu)選，所述的步驟(1)中，在將離心管放入研磨儀之前，需要對研磨儀先預(yù)冷；

作為優(yōu)選，所述的步驟(2)中，所述的rnase的濃度為10mg/ml；

作為優(yōu)選，所述的步驟(4)中，在將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管的過程中，不要碰到沉淀；

作為優(yōu)選，所述的步驟(9)中，在將無核酸酶水加入吸附膜中間部位時，需要先將無核酸酶水預(yù)熱至65℃。

采用nanodrop測定提取dna的濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測提取dna的完整性，經(jīng)測定樣本的a260/a280在1.8左右，從nanodrop和瓊脂糖電泳可以看出，對比采用傳統(tǒng)的ctab法提取干燥葉片dna，盡管可獲得dna，但dna的純度和濃度均很低，質(zhì)量很差，相對的，采用實(shí)施例的方法可在相同樣品量的前提下，提取獲得純度和濃度高，完整性好的基因組dna，在后續(xù)的pcr作為模板進(jìn)行高效擴(kuò)增，尤其適用于比較稀缺珍貴的樣本。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求的保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。