本發(fā)明涉及魚類寄生蟲檢測領(lǐng)域，具體涉及一種黃顙四錨蟲的pcr檢測引物、熒光定量pcr檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
：寄生于黃顙魚鰓上的黃顙四錨蟲(bychowskyellapseudobagriachmerov)分布很廣，東北、山東、浙江、湖北、廣東、江蘇、福建、云南、四川等均有記錄，而且宿主亦廣泛，它可寄生于多種黃顙屬魚類及鳠屬(hemibagrus)魚類鰓上。小型蟲體，體長0.210-0.588mm，體寬0.060-0.168mm。屬于一種單殖吸蟲，寄生于魚類鰓部時(shí)表現(xiàn)出明顯的“群居”現(xiàn)象，少量寄生黃顙四錨蟲時(shí)，養(yǎng)殖魚類并沒有明顯癥狀，多表現(xiàn)為吃食量下降或暗浮頭現(xiàn)象。大量寄生時(shí)，病魚呼吸困難，游動緩慢，鰓部明顯浮腫，鰓蓋張開，鰓上粘液增多，鰓絲腫脹或粘連，嚴(yán)重時(shí)發(fā)生變性或壞死，鰓因貧血而呈現(xiàn)蒼白色或花鰓狀。黃顙四錨蟲流行與春末夏初，對魚苗和魚種的危害較大，大量寄生蟲常引起苗種的大批死亡。寄生于大規(guī)格魚種或成魚時(shí)常引起養(yǎng)殖魚類繼發(fā)細(xì)菌寄生而產(chǎn)生大量死亡。黃顙四錨蟲由于體型小，小量寄生時(shí)無癥狀，因此傳統(tǒng)的檢測方法，并不適合該寄生蟲。而在檢測和診斷技術(shù)中，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-timefluorescentquantitativepolymerasechainreaction,rtfq-pcr)因其具有的簡便、快速、敏感、特異、適于早期和大量樣品檢測的優(yōu)點(diǎn)，已在該研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。目前對于黃顙四錨蟲的檢測國內(nèi)尚沒有熒光定量pcr檢測技術(shù)方面的研究報(bào)告。為了及時(shí)控制魚病發(fā)生，迫切需要一種能快速檢測魚鰓內(nèi)或環(huán)境水體中是否存在寄生蟲的技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對以上問題，提供了一對黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因熒光定量pcr檢測的專用引物，包含該引物的試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種黃顙四錨蟲的pcr檢測引物，所述引物包括上游引物18s-ⅱ-f和下游引物18s-ⅱ-r，18s-ⅱ-f的序列為：5’-ctggtcatggctctgctgac-3’，18s-ⅱ-r的序列為：5’-cgttaaaggagcatcagctg-3’。所述上游引物18s-ⅱ-f和下游引物18s-ⅱ-r的摩爾濃度比是1：1。一種黃顙四錨蟲的熒光定量pcr檢測試劑盒，包括以下組分：其中，上游引物為18s-ⅱ-f，序列為：5’-ctggtcatggctctgctgac-3’，下游引物為18s-ⅱ-r，序列為：5’-cgttaaaggagcatcagctg-3’。還包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照包括7.5×107拷貝/μl的強(qiáng)陽性對照和469拷貝/μl的臨界陽性對照質(zhì)粒；所述陰性對照為無菌水。所述陽性對照的核苷酸序列是：ctggtcatggctctgctgacttgtcagtggggaaatggctagctggtatattcactcatagcttcgcagctgtgtccatgtgtcctcggacgtatggatggcgttgggtgtcagctgatgctcctttaacg。所述陽性對照質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括如下步驟：1)、制備黃顙四錨蟲的dna模板：將形態(tài)鑒定好的黃顙四錨蟲置于1.5ml的ep管中，加入180μl組織裂解液tl，20mg/ml的蛋白酶k20μl，于55℃水浴3h或者直到消化完全；加入200μl結(jié)合液cb和100μl異丙醇，13000rpm離心5min，將上清加入一個(gè)吸附柱ac中，13000rpm離心30-60s；加入500μl抑制物去除液ir，12000rpm離心30s；加入600μl漂洗液wb，12000rpm離心30s，并重復(fù)該步驟一次；取出吸附柱ac，放入干凈的離心管中，加入100μl無菌水，室溫放置3-5min，12000rpm離心1min，并將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min，得到黃顙四錨蟲dna模板，在-20℃保藏備用；2)、pcr體系擴(kuò)增：pcr體系為：黃顙四錨蟲dna模板5μl10pmol/μl的上游引物18s-ⅱ-f2.0μl，10pmol/μl的下游引物18s-ⅱ-r2.0μl，5utaqdna聚合酶0.6μl，2×進(jìn)口實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液12.5μl，depc水補(bǔ)充至25μl；pcr反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10s，60℃20s，72℃20s，75℃5s,讀板共40個(gè)循環(huán)；3)、將步驟2)得到的黃顙四錨蟲的目的片段用2％瓊脂糖凝膠電泳分離得到靶標(biāo)條帶，用干凈的手術(shù)刀切下包含靶標(biāo)條帶的凝膠，瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒回收靶標(biāo)dna；4)、將回收的dna在16℃下加入到連接體系中，并于16℃下放置10h；5)、將步驟4)得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到制備好的大腸桿菌感受態(tài)，并涂布于含有氨芐青霉素的lb平板，37℃培養(yǎng)至長出菌落；6)、挑取菌落并制備成菌懸液，使用載體通用引物及菌落pcr驗(yàn)證并挑選陽性克隆子；7)、將陽性克隆子對應(yīng)的細(xì)菌于lb液體培養(yǎng)基中，37℃下200rpm搖菌培養(yǎng)10h，并取1ml用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒dna，從而得到陽性對照質(zhì)粒，測定提取的陽性對照質(zhì)粒dna的濃度，稀釋后作為陽性對照用于pcr檢測。一種黃顙四錨蟲的檢測方法，使用上述的試劑盒進(jìn)行檢測，包括如下步驟：1)、制備dna模板：取樣品一小塊鰓組織塊，加入200μlmilliporeh2o，搗爛，取出沒有搗爛的組織塊，剩余渾濁液12000rpm離心1min，棄上清，加入200μlmilliporeh2o重懸，充分混勻后取50μl加入到200μl6％的chelex-100中，混勻，56℃保溫20min，劇烈震蕩混勻后于100℃保溫8min，劇烈震蕩，并于12000rpm離心3min，取上清作為pcr的模板；2)、實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增：配置pcr反應(yīng)體系，每25μl的pcr反應(yīng)體系具體包括：其中，12.5μl的2×進(jìn)口實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液包括2.5μl的10×buffer、2μl的10mmdntp、0.0025μl的10000×sybrgreeni以及8μldepc水。pcr反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，讀板共40個(gè)循環(huán)；3)、結(jié)果判斷：觀察實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增曲線，若獲得的熒光擴(kuò)增曲線ct值低于臨界對照ct值，則樣品患有黃顙四錨蟲病。本發(fā)明的有益效果是：1)首次提供了黃顙四錨蟲18s基因熒光定量pcr檢測中的專用引物，使利用熒光定量pcr對待測樣本中18s可變區(qū)基因檢測成為可能；2)本檢測方法與黃顙四錨蟲其他常規(guī)檢測方法，如顯微鏡觀察法和普通pcr相比，靈敏度和特異性極高，具有操作程序簡單易用的特點(diǎn)，本試劑盒可用于操作程序化，適合大面積推廣和應(yīng)用，檢測效率得到了很大的提高；3)本檢測方法不僅能夠評價(jià)魚體的黃顙四錨蟲寄生情況，同時(shí)也可用于水體中黃顙四錨蟲的檢測。本發(fā)明能為快速、準(zhǔn)確地檢測出黃顙四錨蟲提供保證，為預(yù)防疾病，科學(xué)用藥和保障魚類健康提供了保障。依據(jù)本發(fā)明專用引物的檢測方法及試劑盒可用于魚類鰓及水體中黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因的核苷酸檢測。附圖說明圖1是采用三對引物分別對于黃顙四錨蟲的目標(biāo)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增后的電泳圖；圖2是采用三對引物對六種非靶標(biāo)魚類寄生蟲的目標(biāo)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增后的電泳圖；圖3是利用第二對引物18s-ⅱ-f/r進(jìn)行的陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增曲線圖；圖4是利用第二對引物18s-ⅱ-f/r對魚dna樣本進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增曲線圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明的一種黃顙四錨蟲的pcr檢測引物，包括上游引物18s-ⅱ-f和下游引物18s-ⅱ-r，18s-ⅱ-f的序列為：5’-ctggtcatggctctgctgac-3’，18s-ⅱ-r的序列為：5’-cgttaaaggagcatcagctg-3’。所述上游引物18s-ⅱ-f和下游引物18s-ⅱ-r的摩爾濃度比是1：1。一種黃顙四錨蟲的熒光定量pcr檢測試劑盒，包括以下組分：其中上游引物為18s-ⅱ-f，序列為：5’-ctggtcatggctctgctgac-3’，下游引物為18s-ⅱ-r，序列為：5’-cgttaaaggagcatcagctg-3’。試劑盒還包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照包括7.5×107拷貝/μl的強(qiáng)陽性對照和469拷貝/μl的臨界陽性對照質(zhì)粒；所述陰性對照為無菌水。所述陽性對照的核苷酸序列是：ctggtcatggctctgctgacttgtcagtggggaaatggctagctggtatattcactcatagcttcgcagctgtgtccatgtgtcctcggacgtatggatggcgttgggtgtcagctgatgctcctttaacg。所述陽性對照質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括如下步驟：1)、制備黃顙四錨蟲的dna模板：將形態(tài)鑒定好的黃顙四錨蟲置于1.5ml的ep管中，加入180μl組織裂解液tl，20mg/ml的蛋白酶k20μl，于55℃水浴3h或者直到消化完全；加入200μl結(jié)合液cb和100μl異丙醇，13000rpm離心5min，將上清加入一個(gè)吸附柱ac中，13000rpm離心30-60s；加入500μl抑制物去除液ir，12000rpm離心30s；加入600μl漂洗液wb，12000rpm離心30s，并重復(fù)該步驟一次；取出吸附柱ac，放入干凈的離心管中，加入100μl無菌水，室溫放置3-5min，12000rpm離心1min，并將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min，得到黃顙四錨蟲dna模板，在-20℃保藏備用；2)、pcr體系擴(kuò)增：pcr體系為：黃顙四錨蟲dna模板5μl10pmol/μl的上游引物18s-ⅱ-f2.0μl，10pmol/μl的下游引物18s-ⅱ-r2.0μl，5utaqdna聚合酶0.6μl，2×進(jìn)口實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液12.5μl，depc水補(bǔ)充至25μl；pcr反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10s，60℃20s，72℃20s，75℃5s,讀板共40個(gè)循環(huán)；3)、將步驟2)得到的黃顙四錨蟲的目的片段用2％瓊脂糖凝膠電泳分離得到靶標(biāo)條帶，用干凈的手術(shù)刀切下包含靶標(biāo)條帶的凝膠，瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒回收靶標(biāo)dna；4)、將回收的dna在16℃下加入到連接體系中，并于16℃下放置10h；5)、將步驟4)得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到制備好的大腸桿菌感受態(tài)，并涂布于含有氨芐青霉素的lb平板，37℃培養(yǎng)至長出菌落；6)、挑取菌落并制備成菌懸液，使用載體通用引物及菌落pcr驗(yàn)證并挑選陽性克隆子；7)、將陽性克隆子對應(yīng)的細(xì)菌于lb液體培養(yǎng)基中，37℃下200rpm搖菌培養(yǎng)10h，并取1ml用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒dna，從而得到陽性對照質(zhì)粒，測定提取的陽性對照質(zhì)粒dna的濃度，稀釋后作為陽性對照用于pcr檢測。一種使用上述試劑盒檢測黃顙四錨蟲的檢測方法，包括如下步驟：1)、制備dna模板：取樣品一小塊鰓組織塊，加入200μlmilliporeh2o，搗爛，取出沒有搗爛的組織塊，剩余渾濁液12000rpm離心1min，棄上清，加入200μlmilliporeh2o重懸，充分混勻后取50μl加入到200μl6％的chelex-100中，混勻，56℃保溫20min，劇烈震蕩混勻后于100℃保溫8min，劇烈震蕩，并于12000rpm離心3min，取上清作為pcr的模板；2)、實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增：配置pcr反應(yīng)體系，每25μl的pcr反應(yīng)體系具體包括：其中，12.5μl的2×進(jìn)口實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液包括2.5μl的10×buffer、2μl的10mmdntp、0.0025μl的10000×sybrgreeni以及8μldepc水。pcr反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，讀板共40個(gè)循環(huán)；3)、結(jié)果判斷：觀察實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增曲線，若獲得的熒光擴(kuò)增曲線ct值低于臨界對照ct值，則樣品患有黃顙四錨蟲病。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作具體說明。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法均參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(f.m.奧斯伯等主編，科學(xué)出版社2005年出版)所建議的實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)施例1用于對黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因進(jìn)行熒光定量pcr檢測的引物設(shè)計(jì)及篩選1、生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)引物及進(jìn)行引物篩選根據(jù)文獻(xiàn)信息，對中科院水生生物研究所篩選并獲得的黃顙四錨蟲18s(genbank登錄號：ky680236)可變區(qū)進(jìn)行分析，同時(shí)下載12種近源寄生蟲18s基因序列作為參考序列，請見下表。參考序列物種名稱(拉丁名)genbankmizelleusindicuskr296800bychowskyellatchangikt852455bychowskyellafossilisikt852454mizelleuslongicirruskr296801hamatopedunculariaelongatakt252896thysanotohaptorrexkt252903neocalceostomoidesspinivaginaliskt252904hamatopedunculariathalassinikt252900chauhanelluschauhanikt252897euzetremaknoepffleriaj564212pseudomurraytremaardensaj228793lamellodiscusdonatellaefn296214通過clustalx進(jìn)行比對后，選擇合適區(qū)域設(shè)計(jì)引物，該區(qū)域在黃顙四錨蟲18s基因可變區(qū)，是分辨黃顙四錨蟲的特異性序列，但相對于參考序列至少存在10％-30％的差異，選定區(qū)域后采用abiprimerexpress3.0實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)合成引物。將所提取的備選引物按以下要求進(jìn)行篩選：1)引物在可變區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性；2)產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)(自由能小于58.61kj/mol)；3)引物長度一般在17-25堿基之間,上下游引物不能相差太大；4)g+c含量在40％～60％之間；5)堿基要隨機(jī)分布，盡量均勻；6)引物自身不能有連續(xù)超過4個(gè)堿基的互補(bǔ)；7)引物之間不能有連續(xù)超過4個(gè)堿基的互補(bǔ)；8)引物5’端可以修飾；9)3’端不可修飾，而且要避開at,gcrich的區(qū)域(2-3個(gè))；10)引物整體設(shè)計(jì)自由能分布5’端大于3’端，且3’端自由能最好小于9kj/mol；11)引物設(shè)計(jì)避免dna污染，最好跨外顯子接頭區(qū)；12)引物與非特異性擴(kuò)增序列的同源性最好小于70％或者有8個(gè)互補(bǔ)堿基同源；13)查看有無假基因的存在。假基因就是無功能的dna序列，與需要擴(kuò)增的目的片段長度相似；14)tm值在55-65℃之間。所用pcr引物由上海生工公司合成，引物要求page純化，到貨時(shí)為引物干粉，用無菌水復(fù)溶后，對干粉進(jìn)行含量測定，引物至100pmol/μl貯存液后備用。針對黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因，共設(shè)計(jì)了3組上下游引物，序列如下：18s-ⅰ(154bp)上游引物18s-ⅰ-f：5’-caaatcaaacgcttcggcgtg-3’；下游引物18s-ⅰ-r：5’-tccccgttacccgtcataatc-3’；18s-ⅱ(131bp)上游引物18s-ⅱ-f：5’-ctggtcatggctctgctgac-3’；下游引物18s-ⅱ-r：5’-cgttaaaggagcatcagctg-3’；18s-ⅲ(181bp)上游引物18s-ⅲ-f：5’-acctccatgtcgttaccttg-3’；下游引物18s-ⅲ-r：5’-accaggcaaatcatgctcac-3’。2、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行引物檢測2.1實(shí)驗(yàn)材料及試劑材料：魚類常見致病黃顙四錨蟲，6個(gè)陰性對照，即黃顙華指環(huán)蟲(sinidactylogyruspseudobagrus)，黃顙偽錨盤蟲(pseudoancylodiscoidesgigi)，月斧偽錨盤蟲(pseudoancylodiscoidesstrelkowi)，河鱸錨首蟲(ancyrocephalusmogurndae)，東方車輪蟲(trichodinaorientalis)和鯉斜管蟲(chilodonellacyprini)。七個(gè)寄生蟲均來自中科院武漢水生生物研究所。用動物dna提取試劑盒(tiangen)提取寄生蟲基因組dna。同時(shí)分別提取患病魚的鰓、及混合有黃顙四錨蟲的水體中微生物的基因組dna，用于評價(jià)pcr體系的特異性和靈敏度。試劑：5u/μltaqdnapolymerase(promega，含10×reactionbuffer和25mmmg2+)、10mmdntps(promega)、dnamarkeri(tiangen)；milliporeh2o(millipore公司生產(chǎn)的超純水)高壓滅菌后分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?.2引物、寄生蟲測試用常規(guī)pcr測試所設(shè)計(jì)的引物及供試寄生蟲，pcr反應(yīng)體系(10pmol/μl的上游引物18s-ⅱ-f2.0μl，10pmol/μl的下游引物18s-ⅱ-r2.0μl，樣品dna5μl，5utaqdna聚合酶0.6μl，2.9μldepc水，2×進(jìn)口實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液12.5μl；所述12.5μl的2×進(jìn)口實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液是2.5μl的thermofisher公司的10×buffer、2μl的10mmdntp、0.0025μl的10000×sybrgreeni以及8μldepc水的混合物；pcr反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10s，60℃20s，72℃20s，75℃5s，讀板共40個(gè)循環(huán))根據(jù)各組分的濃度配制，擴(kuò)增程序根據(jù)引物的tm值及產(chǎn)物的大小編寫。常規(guī)pcr擴(kuò)增在bio-radmycycler梯度擴(kuò)增儀上進(jìn)行，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合凝膠成像系統(tǒng)檢測所得到的pcr產(chǎn)物，結(jié)果如圖1所示。2.3黃顙四錨蟲常規(guī)pcr方法檢測三對引物結(jié)果2.3.1常規(guī)pcr測試寄生蟲及設(shè)計(jì)的引物設(shè)計(jì)的三對引物序列如下：18s-ⅰ上游引物18s-ⅰ-f：5’-caaatcaaacgcttcggcgtg-3'；下游引物18s-ⅰ-r：5’-tccccgttacccgtcataatc-3'；18s-ⅱ上游引物18s-ⅱ-f：5’-ctggtcatggctctgctgac-3'；下游引物18s-ⅱ-r：5’-cgttaaaggagcatcagctg-3'；18s-ⅲ上游引物18s-ⅲ-f：5’-acctccatgtcgttaccttg-3'；下游引物18s-ⅲ-r：5’-accaggcaaatcatgctcac-3'.從圖1可以看出，對于黃顙四錨蟲，病魚鰓部組織以及混有黃顙四錨蟲的水體，所設(shè)計(jì)的三對引物均可擴(kuò)增出靶標(biāo)條帶，表明黃顙四錨蟲、自行設(shè)計(jì)的引物以及使用的pcr擴(kuò)增體系均可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。2.3.2常規(guī)pcr檢測體系的特異性對于常見的六種非靶標(biāo)魚類寄生蟲，使用建立的常規(guī)pcr檢測體系(如2.2中所述)均為檢測陰性，對黃顙四錨蟲為檢測陽性，這表明所建立的常規(guī)pcr檢測體系具有極好的特異性，可以用于黃顙四錨蟲的快速檢測(如圖2所示)。3、實(shí)時(shí)熒光定量檢測引物擴(kuò)增效率3.1陽性對照質(zhì)粒及標(biāo)準(zhǔn)模板的制備用建立的常規(guī)pcr體系擴(kuò)增黃顙四錨蟲的目的片段，2％瓊脂糖凝膠電泳分離得到特定的靶標(biāo)條帶。用干凈的手術(shù)刀切下包含靶標(biāo)條帶的凝膠，瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收靶標(biāo)dna。將回收的部分dna16℃下加入到連接體系中(10μl，含線性克隆載體、連接酶和連接酶buffer)，并在16℃下放置10h后將全部的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到制備好的大腸桿菌感受態(tài)，并涂布于含有氨芐青霉素的lb平板，37℃培養(yǎng)至長出菌落。挑取菌落并制備成菌懸液，使用載體引物及菌落pcr驗(yàn)證并挑選陽性克隆子。將陽性克隆子對應(yīng)的細(xì)菌于lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，并取1ml提取質(zhì)粒dna(普通質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司)，從而得到陽性對照物。測定提取的質(zhì)粒dna的濃度，稀釋到一定倍數(shù)作為陽性對照用于pcr檢測。3.2引物pcr擴(kuò)增效率檢測引物的篩選原則為：在目的可變區(qū)中選擇pcr擴(kuò)增效率較高(90～110％的擴(kuò)增效率比較合適)的引物作為候選引物。3.2.1梯度模板準(zhǔn)備將陽性對照物dna(上述3.1所得)，用無菌水以20倍梯度稀釋，作為熒光定量pcr反應(yīng)體系優(yōu)化用模板。取20×、400×、8000×、160000×、3200000×稀釋度，編號依次對應(yīng)為l1、l2、l3、l4、l5。分裝后于-80℃保存?zhèn)溆谩?.2.2熒光定量pcr緩沖液及pcr程序pcr反應(yīng)體系為：10pmol/μl的上游引物2.0μl，10pmol/μl的下游引物2.0μl，樣品dna5μl，5utaqdna聚合酶0.6μl，2.9μldepc水，2×進(jìn)口實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液12.5μl；所述12.5μl的2×進(jìn)口實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液是2.5μl的thermofisher公司的10×buffer、2μl的10mmdntp、0.0025μl的10000×sybrgreeni以及8μldepc水的混合物；所述pcr反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s,讀板共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果如表1所示。3.2.3結(jié)果表1不同引物擴(kuò)增效率引物l1l2l3l4l5擴(kuò)增效率18s-i18.2321.4024.5827.7530.92157.23％18s-ii14.9419.1522.7127.1331.78101.72％18s-iii13.9519.2524.5529.8535.1576.02％注：表格中注明值為ct值。根據(jù)擴(kuò)增效率來看，選擇ii號引物對18s-ii-f/r繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)(因?yàn)?0～110％的擴(kuò)增效率比較合適)。實(shí)施例2：熒光定量pcr引物用量的優(yōu)化1、熒光定量pcr引物用量的第一次優(yōu)化用稀釋好的l1(20×)和l2(400×)陽性對照質(zhì)粒作為引物量優(yōu)化的模板，分別對引物的上下游的用量進(jìn)行梯度優(yōu)化，引物工作液濃度10pmol/μl，pcr反應(yīng)體系為：上下游引物量見表2，樣品(模板)dna5μl，taqdna聚合酶(5u)0.6μl，實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液(2×)12.5μl(2.5μl的thermofisher公司的10×buffer2.5μl，2μl的10mmdntp以及的10000×sybrgreeni0.0025μl和8μldepc水的混合物配制而成)，補(bǔ)充無菌水至25μl。pcr反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，讀板共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果如表2所示，從結(jié)果可以分析出，pcr引物在以下梯度組合可以正常工作，其中引物組合(2.0μl×10pmol/μl、2.0μl×10pmol/μl)、(1.5μl×10pmol/μl、1.5μl×10pmol/μl)擴(kuò)增效率高于引物組合(2.5μl×10pmol/μl、2.5μl×10pmol/μl)的擴(kuò)增效率，這三組引物組合的擴(kuò)增效率又明顯高于其他幾組的擴(kuò)增效率，因此將上游引物量1.5-2.0μl×10pmol/μl、下游引物量1.5-2.0μl×10pmol/μl作為引物用量進(jìn)行第二次篩選。表2實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物用量的第一次優(yōu)化結(jié)果注：表格中注明值為ct值，“1.0,1.5,2.0,2.5”為25μlpcr體系中引物(濃度為10pmol/μl)的用量(μl)。2、熒光定量pcr引物用量的第二次優(yōu)化為測試不同引物用量組合對于試劑靈敏度的影響，選用濃度更低的dna模板進(jìn)行測試。使用陽性對照提取的dna(實(shí)施例l中擴(kuò)增得到)進(jìn)行梯度稀釋取l3(8000×)、l4(160000×)，l5(3200000×)作為第二次引物量優(yōu)化的模板，對各組引物在第一次優(yōu)化基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化。pcr反應(yīng)體系為：上下游引物量見表3，樣品(模板)dna5μl，taqdna聚合酶(5u)0.6μl，實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液(2×)12.5μl(用購自thermofisher公司的10×buffer2.5μl，2μl的10mmdntp以及的10000×sybrgreeni0.0025μl和8μldepc水的混合物配制而成)，補(bǔ)充無菌水至25μl。pcr反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s,讀板共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果如表3所示，本次優(yōu)化上游引物在2.0μl，下游引物在2.0μl時(shí)pcr擴(kuò)增效率最高，選擇此體積為本發(fā)明實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物的使用體積。表3實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物用量的第二次優(yōu)化結(jié)果注：表格中注明值為ct值，“1.5,2.0”為25μlpcr體系中引物(濃度為10pmol/μl)的用量(μl)。基于以上優(yōu)化結(jié)果，本發(fā)明黃顙四錨蟲實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測試劑的基本組成和各組分含量基本如表4所示。表4黃顙四錨蟲實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測試劑的基本組成和各組分含量組份規(guī)格用量實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)緩沖液2×12.5μldna模板5μl引物用量10pmol/μl上游2.0μl，下游2.0μltaqdna聚合酶5u0.6μl無菌水補(bǔ)充至25μl實(shí)施例3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立1、陽性對照質(zhì)粒熒光定量pcr檢測將陽性對照質(zhì)粒dna作為模板進(jìn)行熒光定量pcr檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體操作如下：將質(zhì)粒dna進(jìn)行20倍系列稀釋成1：3.0×1010拷貝/μl；2：1.5×109拷貝/μl；3：7.5×107拷貝/μl；4：3.75×106拷貝/μl；5：1.88×105拷貝/μl；6：9.38x103拷貝/μl。每個(gè)稀釋度重復(fù)平行試驗(yàn)3次。標(biāo)準(zhǔn)品檢測pcr反應(yīng)體系為：上游引物2.0μl(10pmol/μl)，下游引物2.0μl(10pmol/μl)，質(zhì)粒dna5μl，taqdna聚合酶(5u)0.6μl，實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液(2×)12.5μl(用購自thermofisher公司的10×buffer2.5μl，2μl的10mmdntp以及的10000×sybrgreeni0.0025μl和8μldepc水的混合物配制而成)，補(bǔ)充無菌水至25μl。pcr反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s,讀板共40個(gè)循環(huán)。標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增曲線如圖3所示(圖3，橫坐標(biāo)為ct值，縱坐標(biāo)為熒光值，1：3.0×1010拷貝/μl；2：1.5×109拷貝/μl；3：7.5×107拷貝/μl；4：3.75×106拷貝/μl；5：1.88×105拷貝/μl；6：9.38x103拷貝/μl)2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制根據(jù)所得ct值與其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的對數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測陽性對照的線性范圍是3×1010～1×104拷貝/μl反應(yīng)體系，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r平方值為0.9989(y＝-3.2813x+44.668)，熒光定量pcr反應(yīng)的擴(kuò)增效率為101.72％。標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示：本發(fā)明建立的黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因?qū)崟r(shí)熒光定量pcr檢測方法有至少6個(gè)數(shù)量級的線性檢測范圍，進(jìn)一步說明該檢測方法具有非常高的靈敏度。實(shí)施例4黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因熒光定量pcr檢測試劑盒黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因熒光定量pcr檢測試劑盒包括各自獨(dú)立包裝的反應(yīng)液1ml/管和taq聚合酶(5u，每個(gè)反應(yīng)0.6μl)30μl/管，兩試劑管再共同組裝在一外包裝盒中。其中，反應(yīng)液為2×buffer(每12.5μl用購自thermofisher公司的10×buffer2.5μl，2μl的10mmdntp以及的10000×sybrgreeni0.0025μl和8μldepc水的混合物配制而成)。實(shí)施例2確定的組合2.0μl上游引物、2.0μl下游引物和2.9μl的無菌水按比例混合，配制時(shí)將每一組分乘以一個(gè)系數(shù)(如10000，根據(jù)生產(chǎn)量定)，混勻后，分裝，每支1ml為方便檢測。試劑盒還包括另外各自獨(dú)立包裝的強(qiáng)陽性對照7.5×107拷貝/μl(400×稀釋度的陽性對照l2)、臨界陽性對照469拷貝/μl(64000000×稀釋度的陽性對照品l6)、dna提取液((用于提取待測魚鰓或水體內(nèi)的dna)(配方為：chelex-100)及陰性對照品(無菌水)，并與反應(yīng)液和taq聚合酶試劑管共同組裝在外包裝盒中。pcr反應(yīng)體系：上游引物2.0μl(10pmol/μl)，下游引物2.0μl(10pmol/μl)，樣品dna5μl，taqdna聚合酶(5u)0.6μl，實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液(2×)12.5μl，補(bǔ)充無菌水至25μl。pcr反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，讀板共40個(gè)循環(huán)。分別取5μl陽性對照l2、l6于pcr反應(yīng)體系中反應(yīng)，反應(yīng)體系包括：上游引物2.0μl(10pmol/μl)，下游引物2.0μl(10pmol/μl)，陽性對照5μl，taqdna聚合酶(5u)0.6μl，實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液(2×)12.5μl，補(bǔ)充無菌水至25μl。pcr反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，讀板共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果(如表5所示)表明，經(jīng)過5次重復(fù)測定結(jié)果比較穩(wěn)定，確定為本發(fā)明試劑盒的陽性對照。表5陽性對照的測試結(jié)果重復(fù)12345l218.818.518.718.518.9l636.136.536.436.836.3實(shí)施例5黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因熒光定量pcr檢測試劑盒的性能評估為對本發(fā)明試劑盒的性能進(jìn)行評估，按照產(chǎn)品優(yōu)化后的工藝多次配制出產(chǎn)品小樣對試劑盒的靈敏度、特異性、精確度以及穩(wěn)定性，用試生產(chǎn)的產(chǎn)品進(jìn)行臨床試驗(yàn)，以考查產(chǎn)品的性能。1、試劑盒檢測的線性范圍和靈敏度測試將黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因人工構(gòu)建質(zhì)粒pblue-18s-ii用depc水稀釋液進(jìn)行20倍系列梯度稀釋至1280000000×，即靈敏度質(zhì)控品(取l1(20×稀釋度)、l2(400×稀釋度)、l3(8000×稀釋度)、l4(160000×稀釋度)、l5(3200000×稀釋度)、l6(64000000×稀釋度)、l7(1280000000×稀釋度)作為評價(jià)試劑盒靈敏度的質(zhì)控品，編號l1-l7，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆?。使用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測。pcr反應(yīng)體系：上游引物2.0μl(10pmol/μl)，下游引物2.0μl(10pmol/μl)，陽性對照質(zhì)粒dna5μl，taqdna聚合酶(5u)0.6μl，實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液(2×)12.5μl(用購自thermofisher公司的10×buffer2.5μl，2μl的10mmdntp以及的10000×sybrgreeni0.0025μl和8μldepc水的混合物配制而成)，補(bǔ)充無菌水至25μl。pcr反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s,讀板共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果(如表6所示)顯示，在l6(64000000×稀釋度)時(shí)試劑盒多數(shù)情況下可檢出，對不同批次的產(chǎn)品小樣進(jìn)行靈敏度及線性分析，結(jié)果顯示引物均可穩(wěn)定測出l6(64000000×稀釋度)的陽性對照質(zhì)粒dna樣品，對于l7(1280000000×稀釋度)樣品，本發(fā)明試劑盒不能檢出，所以本發(fā)明試劑盒最低可檢出含l6(64000000×稀釋度)的人工構(gòu)建質(zhì)粒，具有較高的靈敏度。故設(shè)l6(64000000×稀釋度)為最低檢出值。表6本發(fā)明試劑盒線性范圍的測試結(jié)果稀釋梯度l1l2l3l4l5l6l7ct值14.8319.1522.6927.1431.7236.03noct2、試劑盒檢測的特異性分析采用不同批次的產(chǎn)品小樣對六種主要魚類寄生蟲(n1：黃顙華指環(huán)蟲，n2：黃顙偽錨盤蟲，n3：月斧偽錨盤蟲，n4：河鱸錨首蟲，n5：東方車輪蟲，n6：鯉斜管蟲)進(jìn)行檢測。pcr反應(yīng)體系：上游引物2.0μl(10pmol/μl)，下游引物2.0μl(10pmol/μl)，寄生蟲樣品dna5μl，5utaqdna聚合酶0.6μl，2.9μldepc水，2×進(jìn)口實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液的12.5μl；12.5μl的2×進(jìn)口實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液是2.5μl的thermofisher公司的10×buffer，2μl的10mmdntp、10000×sybrgreeni0.0025μl以及8μldepc水的混合物配制而成。pcr反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，讀板共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果(表7)n1-n6均未檢出ct值，證明本發(fā)明的試劑盒具有良好的特異性。表7本發(fā)明試劑盒特異性的測試結(jié)果樣品n1n2n3n4n5n6ct值noctnoctnoctnoctnoctnoct3、試劑盒批內(nèi)檢測的精密性使用精密性質(zhì)控品(將人工構(gòu)建的pblue-18s-ii質(zhì)粒稀釋至8000×作為精密性質(zhì)控品用于對陽性對照質(zhì)粒dna檢測試劑盒的質(zhì)量控制。對反應(yīng)體系分別進(jìn)行10次重復(fù)檢測，pcr反應(yīng)體系：上游引物2.0μl(10pmol/μl)，下游引物2.0μl(10pmol/μl)，陽性對照質(zhì)粒dna5μl，taqdna聚合酶(5u)0.6μl，實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液(2×)12.5μl(用購自thermofisher公司的10×buffer2.5μl，2μl的10mmdntp以及的10000×sybrgreeni0.0025μl和8μldepc水的混合物配制而成)，補(bǔ)充無菌水至25μl。pcr反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s,讀板共40個(gè)循環(huán)。10個(gè)精密度質(zhì)控品ct值的cv％<10％(如表8所示，cv表示變異系數(shù))，證明本發(fā)明的試劑盒具有良好的精密性。表8本發(fā)明試劑盒的精密度測試結(jié)果樣品12345678910cv％ct值22.722.722.622.722.722.622.722.622.822.70.274、試劑盒的準(zhǔn)確性測定采用測序方法進(jìn)行確認(rèn)本發(fā)明試劑盒的準(zhǔn)確性。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，序列與預(yù)期結(jié)果完全一致，證明本發(fā)明試劑盒的檢測結(jié)果是準(zhǔn)確的。5、試劑盒的穩(wěn)定性測定5.1試劑盒的穩(wěn)定性產(chǎn)品的穩(wěn)定性取決于各個(gè)組成成份的穩(wěn)定性。本發(fā)明中配制實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)液、taqdna聚合酶、陽性對照質(zhì)粒在-20℃保存，取出后一直保存至4℃冰箱，最長保存一周仍未見性能下降。在為臨床試驗(yàn)準(zhǔn)備的產(chǎn)品運(yùn)輸中，全套產(chǎn)品(包括實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)液、taqdna聚合酶、試劑盒對照品)，在先后經(jīng)歷為期3天的-20℃冷凍、4℃長途運(yùn)輸、-20℃冷凍、復(fù)融等一系列往返過程后，使用質(zhì)控品檢測，檢測結(jié)果未見有顯著差異。表明本發(fā)明試劑盒的各組份相當(dāng)穩(wěn)定。5.2對照品的穩(wěn)定性對照品的穩(wěn)定性對試驗(yàn)結(jié)果的分析判斷有很大影響，本試劑盒的對照品主要是對反應(yīng)體系進(jìn)行質(zhì)量控制。本試劑盒使用了一份強(qiáng)陽性對照(l2)、一份臨界陽性(l6)和一份陰性對照(h2o)，對其進(jìn)行凍融檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表9所示，結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒中的對照品也具有良好的穩(wěn)定性。表9陽性對照品的凍融試驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例6黃顙四錨蟲18s可變區(qū)基因熒光定量pcr檢測1、提取魚取樣組織的dna采集了3份患病及7份健康魚樣品，使用chelex-100(bio-rad)煮沸法快速提取dna。方法如下：取一小塊鰓組織塊，加入200μlmilliporeh2o，搗爛，取出沒有搗爛的組織塊，剩余渾濁液12000rpm離心1min，棄上清，加入200μlmilliporeh2o重懸。充分混勻后取50μl加入到200μl6％的chelex-100中，混勻，56℃保溫20min，劇烈震蕩混勻后于100℃保溫8min，劇烈震蕩，并于12000rpm離心3min，取上清作為pcr的模板，用建立的常規(guī)pcr檢測體系進(jìn)行檢測。剩余的模板于-20℃保存以備復(fù)檢。2、用實(shí)施例1、2中建立的方法檢測魚dna樣本檢測pcr反應(yīng)體系為：上游引物2.0μl(10pmol/μl)，下游引物2.0μl(10pmol/μl)，魚dna5μl，5utaqdna聚合酶0.6μl，2.9μldepc水，2×進(jìn)口實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液的12.5μl；12.5μl的2×進(jìn)口實(shí)時(shí)熒光pcr緩沖液是2.5μl的thermofisher公司的10×buffer，2μl的10mmdntp、10000×sybrgreeni0.0025μl以及8μldepc水的混合物配制而成。pcr反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，讀板共40個(gè)循環(huán)。標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增曲線如圖4所示(圖中橫坐標(biāo)為ct值，縱坐標(biāo)為熒光值)，圖中的橫線為熒光閾值，當(dāng)每個(gè)樣品pcr反應(yīng)管內(nèi)熒光信號達(dá)到此閾值時(shí)，所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為該樣品的ct值。各樣本的ct值與該樣本的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，ct值越小。強(qiáng)陽性對照的ct值為19.15，說明實(shí)驗(yàn)操作正確。10份樣本的熒光定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，只有3份患病魚樣本熒光信號達(dá)到閾值，ct分別為14.9,15.1,15.1，低于臨界對照(36.03)；而剩下7份健康魚樣本的熒光信號未達(dá)到閾值，因此無對應(yīng)的ct值(結(jié)果顯示為na)。sequencelisting<110>揚(yáng)州宏盛水產(chǎn)科技有限公司<120>一種黃顙四錨蟲的pcr檢測引物、熒光定量pcr檢測試劑盒及檢測方法<130>2017<160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1ctggtcatggctctgctgac20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2cgttaaaggagcatcagctg20<210>3<211>131<212>dna<213>人工序列<400>3ctggtcatggctctgctgacttgtcagtggggaaatggctagctggtatattcactcata60gcttcgcagctgtgtccatgtgtcctcggacgtatggatggcgttgggtgtcagctgatg120ctcctttaacg131<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4caaatcaaacgcttcggcgtg21<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<400>5tccccgttacccgtcataatc21<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6acctccatgtcgttaccttg20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7accaggcaaatcatgctcac20當(dāng)前第1頁12