本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種柑橘全爪螨響應(yīng)阿維菌素脅迫蛋白編碼基因的分子檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

柑橘全爪螨(panonchuscitrimcgregor)為蜱螨目，葉螨科，中國(guó)各柑桔產(chǎn)區(qū)均有分布。寄主于柑橘、胡頹子、桂花，以口器刺破寄主葉片表皮吸食汁液，被害葉面呈現(xiàn)無(wú)數(shù)灰白色小斑點(diǎn)，嚴(yán)重時(shí)全葉失綠變成灰白色，導(dǎo)致大量落葉；亦能為害果實(shí)及綠色枝梢，影響樹勢(shì)和產(chǎn)量，為我國(guó)柑桔生產(chǎn)的頭號(hào)害蟲。是一種世界性害螨，對(duì)柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大，目前化學(xué)防治仍是控制柑橘全爪螨的重要措施。

生物個(gè)體在受到藥劑刺激后，體內(nèi)的反應(yīng)變化是復(fù)雜多樣的，蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)最直接的體現(xiàn)者，其表達(dá)變化也最為直觀。害蟲(螨)對(duì)藥劑的脅迫發(fā)生作用的蛋白，除了起主要作用的解毒代謝酶外，還有許多行使其他功能的蛋白質(zhì)。對(duì)這些蛋白的研究對(duì)于弄清柑橘全爪螨響應(yīng)阿維菌素脅迫的機(jī)制十分重要，為抗柑橘全爪螨的藥物研究奠定基礎(chǔ)。差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的運(yùn)用，能全面了解蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)機(jī)制，為解釋機(jī)體應(yīng)激前后的蛋白質(zhì)組變化提供了重要方法。

參與能量代謝的蛋白：甘油醛‐3‐磷酸脫氫酶(glyceraldehyde3‐phosphatedehydrogenase，gadph)，是糖酵解途徑中的一種關(guān)鍵酶，它將3‐磷酸甘油醛轉(zhuǎn)催化為1，3‐二磷酸甘油醛。當(dāng)甘油醛‐3‐磷酸(glyceraldehyde3‐phosphate，gadp)穿過(guò)線粒體外膜后，被gapdh氧化，并釋放能量。此結(jié)果說(shuō)明細(xì)胞氧化代謝的增加與柑橘全爪螨對(duì)阿維菌素的抗性發(fā)生有關(guān)。同樣的結(jié)果在桔小實(shí)蠅對(duì)擬除蟲菊酯應(yīng)激的蛋白質(zhì)組研究中也有所報(bào)道。f型atp合酶(f0f1‐atpsynthase，atpsyn)廣泛存在于生命體的細(xì)胞內(nèi)，利用跨膜質(zhì)子的電化學(xué)勢(shì)進(jìn)行atp的合成，是一種重要的能量代謝相關(guān)酶。v型atp合酶(vacuolaratpsyn，v‐atpsyn)廣泛存在于幾乎所有真核細(xì)胞的生物膜結(jié)構(gòu)上，是由多個(gè)亞基組成的，它能利用atp分解產(chǎn)生的能量，將h+逆濃度梯度泵入或泵出細(xì)胞，維持細(xì)胞內(nèi)ph值在正常水平，從而促使細(xì)胞內(nèi)各生理反應(yīng)的正常進(jìn)行，對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖等生命過(guò)程發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，f型atp合酶與v型atp合酶的表達(dá)量均顯著上調(diào)，說(shuō)明柑橘全爪螨應(yīng)激阿維菌素過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列能量轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)化，來(lái)應(yīng)對(duì)藥劑造成的損傷。

參與解毒代謝的蛋白：羧酸酯酶(carboxylesterase，care)屬絲氨酸水解酶家族，廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中，具有多種生理功能，是節(jié)肢動(dòng)物抵御農(nóng)藥等外源化合物的重要防御酶系，其參與了害蟲(螨)對(duì)有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類等多種藥劑的解毒代謝。作為昆蟲(螨)類體內(nèi)4大解毒代謝酶之一，在對(duì)阿維菌素的代謝中也起到一定作用。酶活性測(cè)定結(jié)果顯示小菜蛾plutellaxylostella抗阿維菌素品系的care活性顯著高于敏感品系，且隨齡期的增長(zhǎng)，對(duì)抗性的貢獻(xiàn)逐漸變大，同時(shí)，he等推測(cè)care活性的升高是朱砂葉螨tetranychuscinnabarinus對(duì)阿維菌素產(chǎn)生抗性的原因之一。

與細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白：肌動(dòng)蛋白(actin)是細(xì)胞骨架的3個(gè)主要組分之一，種類眾多，它在細(xì)胞轉(zhuǎn)移，細(xì)胞分裂，胞囊運(yùn)動(dòng)等多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其表達(dá)水平依據(jù)細(xì)胞生理狀態(tài)的不同是不斷變化的。在多個(gè)差異蛋白質(zhì)組研究中，均檢測(cè)到激動(dòng)蛋白，如岡比亞按蚊anophelesgambiae經(jīng)細(xì)菌侵染后肌動(dòng)蛋白表達(dá)發(fā)生波動(dòng)，氨基甲酸酯類藥劑處理使褐飛虱肌動(dòng)蛋白表達(dá)升高。已有研究報(bào)道細(xì)胞骨架是神經(jīng)毒劑的重要靶標(biāo)之一。

與抗氧化相關(guān)的蛋白：硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶(thioredoxinperoxidase，tpx)屬抗氧化酶系，這種類型的過(guò)氧化物使用硫氧還蛋白作為唯一的供氫體，其廣泛存在于原核及真核生物中。tpx的主要功能有解毒，抗氧化，及調(diào)節(jié)由過(guò)氧化氫介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)。關(guān)于tpx抗氧化脅迫的報(bào)道已有很多，2005年lee等發(fā)現(xiàn)，對(duì)家蠶進(jìn)行高低溫脅迫或病毒侵染時(shí)，tpx對(duì)機(jī)體有重要的保護(hù)作用；此外，小菜蛾經(jīng)氟蟲腈處理后，tpx表達(dá)量顯著上調(diào)。鐵蛋白(ferritin，fer)是生物體鐵代謝過(guò)程中維持體內(nèi)鐵動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵蛋白，其通過(guò)吸收與儲(chǔ)存對(duì)鐵離子在細(xì)胞內(nèi)的含量進(jìn)行調(diào)控。除參與鐵代謝外，其在免疫與抗氧化脅迫中也發(fā)揮了關(guān)鍵作用。已有研究報(bào)道煙粉虱bemisiatabaci在受低濃度吡蟲啉處理后，成蟲體內(nèi)fer1基因表達(dá)量上調(diào)。

其它：卵黃原蛋白(vitellogenin,vg)作為卵黃磷蛋白(vitellogenin,vn)的前體，為幾乎所有卵生動(dòng)物的卵巢發(fā)育提供必須的碳水化合物，脂類和其他營(yíng)養(yǎng)成分，在昆蟲中，其主要在脂肪體中合成，通過(guò)卵黃原蛋白受體被卵巢攝取。關(guān)于阿維菌素對(duì)vg的影響未見報(bào)道，但阿維菌素對(duì)蜱螨的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)造成影響，長(zhǎng)角血蜱haemaphysalislongicornis注射阿維菌素后，發(fā)現(xiàn)其卵巢重量顯著降低；阿維菌素對(duì)土耳其斯坦葉螨的亞致死效應(yīng)研究表明，處理后成螨的產(chǎn)卵量、平均壽命和卵孵化率均顯著降低。熱激蛋白(heatshockprotein，hsp)是一個(gè)超基因家族，其中分子量在12‐43kda范圍內(nèi)的為小分子熱激蛋白(smallhsp，shsp)。熱激蛋白在機(jī)體的抗逆和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性中發(fā)揮重要作用，其不僅能夠調(diào)節(jié)生物體適應(yīng)極端溫度，也能夠參與適應(yīng)藥劑脅迫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)以上問(wèn)題，本發(fā)明提供一種柑橘全爪螨響應(yīng)阿維菌素脅迫蛋白編碼基因的分子檢測(cè)方法，包括如下步驟：

1)提取阿維菌素處理后的柑橘全爪螨的總rna，反轉(zhuǎn)錄為cdna；

2)用qpcr方法分別對(duì)rpsa、eef2、atpsyn‐α、fah、v‐atpsyn‐b、calr、shsp、care‐b、actin、cry、fer、vg、atpsyn‐d、tpx、tcp‐1‐η、gapdh基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，所述的16個(gè)基因的qpcr檢測(cè)引物對(duì)的上、下游序列依次如seqidno:1～32所示；

3)對(duì)qpcr結(jié)果進(jìn)行分析，即可得到不同濃度阿維菌素處理后不同時(shí)段上述16個(gè)基因的表達(dá)量結(jié)果。

所述qpcr的反應(yīng)體系為：每20μl反應(yīng)體系中含有：iqtmgreensupermix10μl、10μm的上游引物1μl、10μm的下游引物1μl、cdna模板1μl、ddh2o7μl。

pcr反應(yīng)條件為：95℃120s；95℃15s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)；60℃30s，95℃30s。

本發(fā)明的有益效果是：申請(qǐng)人利用差異雙向電泳技術(shù)，分析阿維菌素lc30濃度處理前后柑橘全爪螨雌成螨的蛋白圖譜，利用相關(guān)分析軟件解析差異表達(dá)蛋白及其變化趨勢(shì)，進(jìn)而通過(guò)質(zhì)譜鑒定這些蛋白的種類，為在蛋白水平探究柑橘全爪螨響應(yīng)阿維菌素脅迫的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。在解析了柑橘全爪螨在阿維菌素脅迫下蛋白水平的表達(dá)變化基礎(chǔ)上，采用基于質(zhì)譜鑒定的mrna水平表達(dá)模式研究對(duì)受阿維菌素脅迫影響的主要的16個(gè)基因進(jìn)行了qpcr實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，為進(jìn)一步揭示柑橘全爪螨應(yīng)答阿維菌素脅迫的分子機(jī)制奠定重要基礎(chǔ)。本發(fā)明設(shè)計(jì)的qpcr引物檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

附圖說(shuō)明

圖1是柑橘全爪螨雙蒸水對(duì)照處理24h后蛋白表達(dá)圖譜。

圖2是柑橘全爪螨經(jīng)阿維菌素lc30濃度處理24h后蛋白表達(dá)圖譜。

圖3是柑橘全爪螨經(jīng)阿維菌素lc30濃度處理24h后蛋白點(diǎn)表達(dá)分析結(jié)果。

圖4是阿維菌素對(duì)柑橘全爪螨差異表達(dá)基因作用的濃度效應(yīng)分析結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一、柑橘全爪螨響應(yīng)阿維菌素脅迫的差異蛋白分析

一、試螨處理

選擇阿維菌素lc30(0.091mg.l^-1)的濃度，對(duì)照用雙蒸水，采用葉碟浸漬法處理試螨(葉碟浸漬法參考專利申請(qǐng)cn201510038090.8)。處理后的試螨置于人工氣候箱中，設(shè)定溫度25±1℃，相對(duì)濕度為75±5％，光暗比l:d＝14:10h，24h后取出，鏡檢，挑除死亡的柑橘全爪螨，將存活的試螨收集至1.5ml離心管中，‐80℃保存?zhèn)溆?。處理和?duì)照各4次重復(fù)，每個(gè)處理500頭螨(實(shí)驗(yàn)共用螨：500頭×4×2＝4000頭)。

二、總蛋白提取

取出‐20℃分裝凍存的裂解液，室溫溶解，每毫升加0.009gdtt、0.0014gpmsf和5μlbio‐lyte，充分溶解。將收集好的柑橘全爪螨置于玻璃勻漿器中，加入適量裂解液，冰浴充分勻漿。收集勻漿液與1.5ml離心管中，4℃靜置15min，再于4℃、15000rpm離心60min，收集上清液，分裝，‐80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、蛋白樣品定量

參照bradford的考馬斯亮藍(lán)g‐250法，首先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，3次重復(fù)，置于分光光度計(jì)中，25℃振蕩120sec，595nm下讀取od值，取平均值，蛋白含量作為橫坐標(biāo)，od值作為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

測(cè)定目的樣品蛋白濃度時(shí)，在96孔酶標(biāo)板上，每個(gè)孔加40μlmilliqh2o、10μl蛋白樣品，最后加入200μl考馬斯亮藍(lán)g‐250，對(duì)照組加裂解液，3次重復(fù)，置于分光光度計(jì)中，25℃振蕩120sec，595nm下讀取od值，取平均值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到樣品總蛋白含量。

四、雙向電泳

雙向電泳主要技術(shù)流程依次為：膠條水化、第一向等電聚焦(ief)、膠條平衡、第二向sds‐page電泳、凝膠agno3染色、圖譜掃描分析、pdquest軟件分析和質(zhì)譜鑒定等8個(gè)步驟。

經(jīng)pdquest^tm軟件分析，篩選出感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)，對(duì)應(yīng)凝膠上點(diǎn)的大小，用刀片削去塑料槍頭，垂直戳下，吹入1.5ml離心管中，‐20℃暫存。

蛋白膠點(diǎn)的質(zhì)譜分析鑒定由華大基因公司完成。所用數(shù)據(jù)庫(kù)為柑橘全爪螨轉(zhuǎn)錄組中的氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)。

蛋白質(zhì)點(diǎn)差異表達(dá)分析：

pdquest^tm軟件輸出定量數(shù)據(jù)表，相對(duì)變化倍數(shù)用處理/對(duì)照表示，用ibmspssstatistics19.0中獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析(p<0.05)。五、結(jié)果與分析

1、柑橘全爪螨在阿維菌素脅迫下蛋白表達(dá)圖譜

阿維菌素lc30濃度處理柑橘全爪螨24h后蛋白表達(dá)圖譜如圖2所示，圖1為雙蒸水處理的對(duì)照。圖中，水平方向?yàn)閜h梯度，垂直直方向?yàn)橄鄬?duì)分子量梯度。從圖譜中可以看出，分離得到較多數(shù)目的蛋白質(zhì)點(diǎn)，且絕大部分較單一，可備選作為后續(xù)分析。

2、蛋白質(zhì)點(diǎn)質(zhì)譜測(cè)序結(jié)果

經(jīng)蛋白質(zhì)檢索軟件mascot分析，得到26個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的對(duì)應(yīng)信息，共鑒定得到23種蛋白質(zhì)，其中3對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)為同一種蛋白，分別是spot1和spot12為卵黃原蛋白(vitellogenin)，spot8和spot18為翻譯延伸因子2(translationelongationfactor2)，spot17和spot19為醛‐酮還原酶(aldo‐ketoreductasefamilyb，member2)。cog(clusteroforthologousgroupsofproteins)蛋白功能分析顯示，這些蛋白共分為細(xì)胞加工和信號(hào)傳導(dǎo)(o、z)、信息儲(chǔ)存和加工(b、j)、新陳代謝(c、e、g、i、p、q)和特征不明顯(r)四大類。其中屬新陳代謝的有11個(gè)(spot3、spot4、spot5、spot6、spot7、spot9、spot15、spot16、spot21、spot22、spot25)、屬信息儲(chǔ)存和加工的有4個(gè)(spot2、spot8、spot18、spot26)、屬細(xì)胞加工和信號(hào)傳導(dǎo)(spot11、spot13、spot14)和特征不明顯(spot17、spot19、spot20)的各有3個(gè)。卵黃原蛋白(spot1、spot12)、小分子熱激蛋白(spot10)和鈣網(wǎng)織蛋白(spot24)在cog中無(wú)功能分類，spot23為一種病毒蛋白。

3、阿維菌素處理前后蛋白點(diǎn)表達(dá)量分析

用pdquest軟件分析2‐de圖譜，人工除去軟件識(shí)別的非蛋白質(zhì)點(diǎn)或背景色過(guò)重的區(qū)域內(nèi)的點(diǎn)，并在不同圖譜上手動(dòng)標(biāo)界同一蛋白點(diǎn)的位置，使圖譜中蛋白點(diǎn)能準(zhǔn)確匹配。圖3為蛋白點(diǎn)表達(dá)分析報(bào)告，圖中藍(lán)線上方表示上調(diào)兩倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)，紅線下方表示下調(diào)兩倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)。結(jié)果顯示，共分離得到622個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，部分蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生了較大變化。根據(jù)表達(dá)變化情況，分別選取上調(diào)及下調(diào)共26個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)質(zhì)譜測(cè)序。

從結(jié)果分析表1中可見，相對(duì)變化倍數(shù)上調(diào)2倍以上的蛋白質(zhì)中，由高到低依次為：卵黃原蛋白3.32倍、atp合酶d鏈(atpsynthasedchain)3.01倍、λ‐晶狀體蛋白同源物(lambda‐crystallinhomolog)2.84倍、3‐磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde3‐phosphatedehydrogenase)2.59倍、b型酯酶(esterasecaretypeb)2.44倍、鐵蛋白(ferritin)2.39倍、v‐atp合酶b亞基(vacuolaratpasebsubunit)2.21倍、翻譯延伸因子2(translationelongationfactor2)2.15倍以及atp合酶α亞基(atpsynthasesubunitalpha)2.05倍；下調(diào)2倍的有鈣網(wǎng)織蛋白(calreticulin)0.44倍、延胡索酰乙酰乙酸酶(fumarylacetoacetase)0.43倍以及40s核糖體蛋白sa(40sribosomalproteinsa)0.42倍；其余蛋白的相對(duì)表達(dá)變化量均在0.5～2倍之間。

表1阿維菌素脅迫后發(fā)生顯著變化的蛋白質(zhì)點(diǎn)鑒定信息

注：b，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)；i，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；g，糖類轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；p，無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；c，能量產(chǎn)生于轉(zhuǎn)換；j，翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成；z，細(xì)胞骨架；o，翻譯后修飾，蛋白折疊，伴侶；e，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝；r，僅預(yù)測(cè)功能；q，次生代謝產(chǎn)物的生物合成，轉(zhuǎn)運(yùn)及分解。

表達(dá)量變化達(dá)到2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)顯著少于波動(dòng)不大的蛋白質(zhì)點(diǎn)，分析原因可能有以下幾方面：(1)生物體內(nèi)蛋白質(zhì)種類眾多，經(jīng)阿維菌素脅迫處理后，柑橘全爪螨發(fā)生作用的應(yīng)激蛋白相對(duì)于整體來(lái)說(shuō)只是很少一部分；(2)阿維菌素的作用機(jī)制決定其致死作用緩慢，24h短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)的應(yīng)激蛋白種類不多；(3)采用的處理濃度偏低，致使誘導(dǎo)蛋白變化倍數(shù)不大。其中處理濃度偏低可能是主要原因，這一原因在其他研究中也得到證實(shí)，如用生物毒素cry11aa飼喂埃及伊蚊aedesaegypti幼蟲5h，解剖其中腸進(jìn)行雙向電泳，發(fā)現(xiàn)飼喂?jié)舛葹閘c10時(shí)，僅有atp合酶β亞基(atpsynthasesubunitbeta)和絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶(serine‐typeendopeptidase)變化顯著，而飼喂?jié)舛忍岣咧羖c50時(shí)，有22個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)發(fā)生顯著反應(yīng)。申請(qǐng)人采用阿維菌素亞致死濃度lc30處理試螨，此濃度經(jīng)常應(yīng)用于害螨的藥劑研究中，從結(jié)果可以看出，雖然應(yīng)激蛋白表達(dá)倍數(shù)沒(méi)有很大波動(dòng)，但從蛋白量變化趨勢(shì)上也可以準(zhǔn)確反映柑橘全爪螨對(duì)阿維菌素的應(yīng)激調(diào)節(jié)機(jī)制。實(shí)施例二、柑橘全爪螨響應(yīng)阿維菌素脅迫蛋白編碼基因的表達(dá)檢測(cè)

一、試螨處理

分別采用阿維菌素不同濃度處理害螨24h及l(fā)c30濃度處理害螨不同時(shí)間，做進(jìn)一步表達(dá)模式研究，處理方法同實(shí)施例一。

不同濃度處理：分別以阿維菌素lc10(0.044mg.l^-1)、lc30(0.091mg.l^-1)和lc50(0.148mg.l^-1)的濃度，處理試螨24h，用雙蒸水處理作為對(duì)照，每個(gè)處理4次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)300頭螨(300頭×4×4＝4800頭)；

不同時(shí)間梯度：以阿維菌素lc10(0.044mg.l^-1)的濃度，分別處理害螨12h、24h和36h，用雙蒸水處理作為對(duì)照，每個(gè)處理4次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)300頭螨(300頭×4×4＝4800頭)。

二、總rna提取

采用rnaeasyplusmicrokit試劑盒(qiagen公司，德國(guó))提取總rna，具體操作步驟參照說(shuō)明書。利用核酸濃度測(cè)定儀及凝膠電泳檢測(cè)rna質(zhì)量，測(cè)定的od260/280值在1.8～2.2之間，且電泳檢測(cè)完整性良好的rna于‐80℃超低溫冰箱保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

三、第一鏈cdna合成

利用onestepprimescript^tmrt‐pcrkit(takara公司，日本)盒進(jìn)行，具體操作步驟見說(shuō)明書。

四、轉(zhuǎn)錄組中相關(guān)基因片段篩選

根據(jù)測(cè)序報(bào)告中的比對(duì)結(jié)果，找到轉(zhuǎn)錄組中的unigene片段，用primerpremier5.0軟件進(jìn)行分析，截取能連續(xù)編碼的堿基序列，翻譯成氨基酸序列，在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，再去除序列兩端不可信的氨基酸序列，基于余下的堿基序列開展后續(xù)研究。

五、定量pcr引物設(shè)計(jì)

利用在線軟件primer3.0(http://frofo.wi.mit.edu/)設(shè)計(jì)了16個(gè)基因的定量pcr引物，基因及其引物序列信息見表1。

六、定量引物溶解曲線及擴(kuò)增效率分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀，用系統(tǒng)配套的分軟件分析擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線及擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出的擴(kuò)增效率，篩選特異且穩(wěn)定的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)，引物擴(kuò)增效率見表2，其中sdha基因作為內(nèi)參基因。

表2定量pcr引物信息

七、實(shí)時(shí)定量pcr

定量用內(nèi)參基因采用課題組前期工作篩選的gapdh。對(duì)表2中的16個(gè)基因分別進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。

qpcr反應(yīng)體系：

反應(yīng)條件采用兩步法：

八、數(shù)據(jù)分析

利用儀器配套軟件輸出ct值至excel表格，采用比較ct值法進(jìn)行計(jì)算。再利用ibmspssstatistics19.0中單因素方差分析(one‐wayanova)處理數(shù)據(jù)，多重比較采用least‐significantdifference(lsd，p<0.05)。

九、結(jié)果與分析

(1)差異表達(dá)基因響應(yīng)阿維菌素脅迫的濃度效應(yīng)

柑橘全爪螨經(jīng)阿維菌素不同濃度(lc10、lc30和lc50)脅迫處理24h后，這11個(gè)基因的表達(dá)量均發(fā)生變化，部分基因的表達(dá)量變化如圖4所示。其中，rpsa、calr和tpx三個(gè)基因在脅迫處理后顯著下調(diào)，且calr的表達(dá)隨處理濃度的增大有逐漸降低的趨勢(shì)，分別為對(duì)照的0.47倍、0.32倍和0.24倍。rpsa在lc10濃度處理時(shí)為對(duì)照的0.41倍左右，在lc50濃度處理時(shí)升高至1.08倍，且與對(duì)照無(wú)顯著差異。此外，其余8個(gè)基因在阿維菌素脅迫處理后發(fā)生不同程度的上調(diào)，在lc10濃度脅迫處理后表達(dá)量最高的有atpsyn‐α、v‐atpsyn‐b、eef、actin和fer基因，分別為對(duì)照的1.35倍、2.74倍、3.17倍、4.94倍和56.45倍。在lc30濃度脅迫處理后表達(dá)量最高的有vg、fah、cry、tcp、care‐b和gapdh基因，分別為對(duì)照的26.36倍、1.71倍、23.82倍、1.40倍、75.71倍和1.55倍。在表達(dá)上調(diào)的基因中，在以lc50的濃度脅迫處理后表達(dá)量較低濃度時(shí)均發(fā)生下調(diào)。

(2)差異表達(dá)基因響應(yīng)阿維菌素脅迫的時(shí)間效應(yīng)

柑橘全爪螨經(jīng)阿維菌素lc10濃度分別脅迫處理12h、24h和36h后，care‐b、actin、fer、eef、cry和vg基因在3個(gè)脅迫處理時(shí)間段表達(dá)量均顯著高于對(duì)照。care‐b基因在3個(gè)時(shí)間梯度的上調(diào)倍數(shù)分別為對(duì)照的29.77倍、22.24倍和22.62倍；actin基因的上調(diào)程度分別為對(duì)照的5.62倍、22.65倍和1.42倍；fer基因的上調(diào)程度分別為對(duì)照的40.05倍、56.45倍和22.90倍；eef基因的上調(diào)程度分別為對(duì)照的2.10倍、3.17倍和1.90倍；cry基因的上調(diào)程度分別為對(duì)照的9.21倍、13.11倍和13.11倍；vg基因的上調(diào)程度分別為對(duì)照的26.58倍、21.11倍和29.83倍。與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的核糖體蛋白(rpsa)在受到阿維菌素脅迫后，蛋白與基因水平都發(fā)生了一致的下調(diào)現(xiàn)象，這說(shuō)明阿維菌素對(duì)這些蛋白質(zhì)的正常生理功能產(chǎn)生了干擾。與能量代謝相關(guān)的v型atp合酶b亞基(v‐atpsyn‐b)、與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝相關(guān)的精脒合成酶(srm)、與脂質(zhì)代謝相關(guān)的b型羧酸酯酶(care‐b)和λ晶體同源物(cry)、與細(xì)胞骨架相關(guān)的肌動(dòng)蛋白(actin)、與無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的鐵蛋白(fer)及卵巢發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)蛋白卵黃原蛋白(vg)在經(jīng)阿維菌素脅迫處理后，在蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄水平均呈現(xiàn)出不同程度的上調(diào)趨勢(shì)，說(shuō)明這些蛋白可能直接參與對(duì)阿維菌素的解毒代謝，或是通過(guò)它們參與的代謝通路，間接的對(duì)阿維菌素造成的損傷提供修復(fù)作用。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)熱激蛋白基因(shsp)在蛋白質(zhì)水平與mrna水平的表達(dá)變化情況相反。其中，eef2在蛋白水平上調(diào)表達(dá)，而在mrna水平短時(shí)間內(nèi)呈下調(diào)趨勢(shì)；類似的情況也發(fā)生在calr中，其在蛋白水平下調(diào)表達(dá)，但在阿維菌素處理后12h在mrna水平上調(diào)顯著。其主要原因可能有以下幾點(diǎn)：(1)基因?qū)τ谀婢趁{迫，通常會(huì)發(fā)生短時(shí)間內(nèi)的應(yīng)激表達(dá)，待機(jī)體適應(yīng)環(huán)境后，會(huì)在蛋白水平體現(xiàn)其調(diào)節(jié)作用；(2)從基因轉(zhuǎn)錄成為蛋白質(zhì)，需經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，一些基因存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的現(xiàn)象；(3)提取蛋白樣品的過(guò)程中，需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行人為修飾，這可能會(huì)對(duì)蛋白定量造成影響。

序列表

<110>西南大學(xué)

<120>柑橘全爪螨響應(yīng)阿維菌素脅迫蛋白編碼基因的分子檢測(cè)方法

<130>1

<160>34

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>rpsa基因qpcr擴(kuò)增上游引物

<400>1

caaacgacgaaatgatggtg20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>rpsa基因qpcr擴(kuò)增下游引物

<400>2

atctaccggcaattggagtg20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>eef2基因qpcr擴(kuò)增上游引物

<400>3

ggtggtggacaaatcattcc20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>eef2基因qpcr擴(kuò)增下游引物

<400>4

cgggtacttgagcttcttcg20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>atpsyn-α基因qpcr擴(kuò)增上游引物

<400>5

acccaacaattgctttccag20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>atpsyn-α基因qpcr擴(kuò)增下游引物

<400>6

gggctaaaaattgtcgctca20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>fah基因qpcr擴(kuò)增上游引物

<400>7

ttgaaaccacaaaacggtga20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>fah基因qpcr擴(kuò)增下游引物

<400>8

tccactaatcgttcccgaag20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>v-atpsyn-b基因qpcr擴(kuò)增上游引物

<400>9

atgacccgaaaagatcatgc20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>v-atpsyn-b基因qpcr擴(kuò)增下游引物

<400>10

ataactgccaaccgatgtcc20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>calr基因qpcr擴(kuò)增上游引物

<400>11

ggcaagttaaggctggaacc20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>calr基因qpcr擴(kuò)增下游引物

<400>12

tcagcggcttttctttcctc20

<210>13

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>shsp基因qpcr擴(kuò)增上游引物

<400>13

tgatttcgtccctttcatcgc21

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>shsp基因qpcr擴(kuò)增下游引物

<400>14

gtgtttcgcttcaaccacca20

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>care-b基因qpcr擴(kuò)增上游引物

<400>15

ttcggttgcagcattagttg20

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>care-b基因qpcr擴(kuò)增下游引物

<400>16

ttcggttgcagcattagttg20

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>actin基因qpcr擴(kuò)增上游引物

<400>17

cagccatgtatgttgccatc20

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>actin基因qpcr擴(kuò)增下游引物

<400>18

gttcagcggtggttacgaat20

<210>19

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>cry基因qpcr擴(kuò)增上游引物

<400>19

gtccgaaggtcttggaatga20

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>cry基因qpcr擴(kuò)增下游引物

<400>20

tatcttcttggccgttggtc20

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>fer基因qpcr擴(kuò)增上游引物

<400>21

cctgatggtaaaaccgcact20

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>fer基因qpcr擴(kuò)增下游引物

<400>22

ccctgagtccattttggaga20

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>vg基因qpcr擴(kuò)增上游引物

<400>23

gcctcaaacgaagctcaatc20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>vg基因qpcr擴(kuò)增下游引物

<400>24

agccaaagcgtcgagtaaaa20

<210>25

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>atpsyn-d基因qpcr擴(kuò)增上游引物

<400>25

taccaagtcagccaccgatt20

<210>26

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>atpsyn-d基因qpcr擴(kuò)增下游引物

<400>26

cggtggcttttaatgcattcc21

<210>27

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<223>tpx基因qpcr擴(kuò)增上游引物

<400>27

aggtgttcttcgtcaaataacca23

<210>28

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>tpx基因qpcr擴(kuò)增下游引物

<400>28

gcaacatcgggaacaatggt20

<210>29

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>tcp-1-η基因qpcr擴(kuò)增上游引物

<400>29

aatttcttcaccggttgccc20

<210>30

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>tcp-1-η基因qpcr擴(kuò)增下游引物

<400>30

ccggcgatggttcttgaaaa20

<210>31

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>gapdh基因qpcr擴(kuò)增上游引物

<400>31

ctttggccaaggtcatcaat20

<210>32

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>gapdh基因qpcr擴(kuò)增下游引物

<400>32

cggtagcggcaggtataatg20

<210>33

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>sdha基因qpcr擴(kuò)增上游引物

<400>33

agcgatatgctccagttgct20

<210>34

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>sdha基因qpcr擴(kuò)增下游引物

<400>34

tcgagttgccaattgttcag20