本發(fā)明屬于生物檢測(cè)鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定長(zhǎng)臂猿性別的pcr引物、試劑盒及方法，該方法教傳統(tǒng)sry1作為引物進(jìn)行性別鑒定方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)。

背景技術(shù)：

長(zhǎng)臂猿(hylobatidae)是一類分布于東南亞地區(qū)的小型猿類，與黑猩猩、猩猩和大猩猩同屬于類人猿(ape)。通常營(yíng)一夫一妻制家庭生活，3至5年繁殖一次，每胎1子，8歲左右性成熟。人工飼養(yǎng)的長(zhǎng)臂猿會(huì)作為科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或者觀賞動(dòng)物，分別被引入到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室或動(dòng)物園。長(zhǎng)臂猿在性成熟之前，性征表現(xiàn)不明顯，通過(guò)外觀難以鑒定其性別。在長(zhǎng)臂猿的引種過(guò)程中，一般不直接引入成年長(zhǎng)臂猿，因?yàn)樯瞽h(huán)境與氣候的改變，容易引發(fā)長(zhǎng)臂猿的生理或心理健康疾病。故引種時(shí)，一般會(huì)選擇幼年的長(zhǎng)臂猿。為了長(zhǎng)臂猿繁殖和育種的需要，在引種時(shí)會(huì)同時(shí)引入雄性長(zhǎng)臂猿和雌性長(zhǎng)臂猿。因此，對(duì)性發(fā)育尚未成熟的幼年長(zhǎng)臂猿進(jìn)行性別鑒定，是具有必要性的。

長(zhǎng)臂猿基因組與人類基因組相近。在藥物研發(fā)過(guò)程中，以長(zhǎng)臂猿為對(duì)象對(duì)藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)及藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究具有重要意義。對(duì)幼年長(zhǎng)臂猿進(jìn)行性別鑒定，可根據(jù)性別進(jìn)行不同的針對(duì)性試驗(yàn)，有利于提高試驗(yàn)的效率和指向性。而現(xiàn)有鑒定幼年長(zhǎng)臂猿的方法，在靈敏度、特異性方面均較差，所以建立一種特異性和靈敏度較高，且成本較低的快速鑒定長(zhǎng)臂猿性別的方法具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種鑒定長(zhǎng)臂猿性別的pcr引物。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種鑒定長(zhǎng)臂猿性別的試劑盒。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種鑒定長(zhǎng)臂猿性別的方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種鑒定長(zhǎng)臂猿性別的pcr引物，其核苷酸序列如下所示：

sry233-f1：5’-gggtcgcttcactctatc-3’(seqidno：1)，

sry233-r1：5’-gctctggcacctttcaatt-3’(seqidno：2)。

一種鑒定長(zhǎng)臂猿性別的試劑盒，該試劑盒含有上述所述的引物。

進(jìn)一步的，上試劑盒還含有內(nèi)參引物，其核苷酸序列如下所示：

β-actin-f：5’-gtggggcgccccaggcacca-3’(seqidno：3)，

β-actin-r：5’-ctccttaatgtcacgcacgatttc-3’(seqidno：4)。

一種鑒定長(zhǎng)臂猿性別的方法，包括以下步驟：

1)長(zhǎng)臂猿基因組dna的提??；

2)以基因組dna為模板，以上述所述sry1-f2和sry1-r2為引物、β-actin-f和β-actin-r為內(nèi)參，進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

3)凝膠電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增效果，分析長(zhǎng)臂猿的性別。

進(jìn)一步的，步驟2)中，所述的pcr擴(kuò)增的體系為：

進(jìn)一步的，步驟2)中，所述的pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性5min，98℃變性10s，50℃退火15s，72℃延伸30s，72℃終延伸10min，共32個(gè)循環(huán)。

本發(fā)明的有益效果是：

1)本發(fā)明提供的方法可對(duì)長(zhǎng)臂猿性別進(jìn)行快速鑒定，鑒定結(jié)果不受年齡條件的限制。該方法為雌雄性征表現(xiàn)差異極小的幼齡長(zhǎng)臂猿性別鑒定提供了一種技術(shù)手段，較傳統(tǒng)使用sry1引物擴(kuò)增677bp片段的方法更為特異和靈敏，也為動(dòng)物園及實(shí)驗(yàn)室的引種程序進(jìn)行優(yōu)化，避免了引種性別錯(cuò)誤帶來(lái)的飼養(yǎng)成本浪費(fèi)。

2)本發(fā)明的引物對(duì)sry233-f1和sry233-r1對(duì)長(zhǎng)臂猿性別鑒定具有很好的檢測(cè)效果，pcr擴(kuò)增效率高，檢測(cè)靈敏度高，特異性強(qiáng)。本發(fā)明較傳統(tǒng)sry1為引物的pcr反應(yīng)擴(kuò)增的靈敏性高10倍，能對(duì)幼齡長(zhǎng)臂猿快速且準(zhǔn)確地進(jìn)行性別鑒定。

3)本發(fā)明方法對(duì)樣品的采集簡(jiǎn)易，樣品采集過(guò)程對(duì)長(zhǎng)臂猿的損傷性小，只需采集長(zhǎng)臂猿的血液便可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，簡(jiǎn)便快速。

附圖說(shuō)明

圖1為現(xiàn)有傳統(tǒng)引物sry1用于pcr擴(kuò)增鑒定長(zhǎng)臂猿性別的結(jié)果，標(biāo)號(hào)219042和大的長(zhǎng)臂猿為雌性，標(biāo)號(hào)218663和小的長(zhǎng)臂猿為雄性；

圖2為sry233和sry1為引物的pcr擴(kuò)增結(jié)果，圖中marker為dl2000(2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp)；泳道1和2為本發(fā)明引物sry233(sry233-f1和sry233-r1)擴(kuò)增結(jié)果；泳道3和4為現(xiàn)有引物sry1(sry1-f2和sry1-r2)的擴(kuò)增結(jié)果；

圖3是以sry1為引物、質(zhì)粒pvax-sry1為模板的pcr擴(kuò)增結(jié)果；m為dl2000(2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp)；1為10⁴copies/ml的pvax-sry1質(zhì)粒，2為10³copies/mlpvax-sry1質(zhì)粒，3為10²copies/mlpvax-sry1質(zhì)粒，4為10¹copies/mlpvax-sry1質(zhì)粒，5為10⁰copies/mlpvax-sry1質(zhì)粒；

圖4是以sry233為引物、質(zhì)粒pvax-sry233為模板的pcr擴(kuò)增結(jié)果；m為dl2000(2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp)；1為10⁴copies/ml(copies/ml？請(qǐng)?zhí)峁┚唧w的單位)的pvax-sry233質(zhì)粒，2為10³copies/mlpvax-sry233質(zhì)粒，3為10²copies/ml的pvax-sry233質(zhì)粒，4為10¹copies/mlpvax-sry233質(zhì)粒，5為10⁰copies/mlpvax-sry233質(zhì)粒。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1一種鑒定長(zhǎng)臂猿性別的pcr引物

本發(fā)明經(jīng)過(guò)對(duì)所設(shè)計(jì)的大量引物進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)引物對(duì)sry233-f1和sry233-r1區(qū)分長(zhǎng)臂猿性別的效果最好，其堿基序列如下所示。

sry233-f1：5’-gggtcgcttcactctatc-3’(seqidno：1)，

sry233-r1：5’-gctctggcacctttcaatt-3’(seqidno：2)。

實(shí)施例2一種鑒定長(zhǎng)臂猿性別的方法

1)提取長(zhǎng)臂猿基因組dna；

2)以基因組dna為模板，以sry233-f1和sry233-r1為引物、β-actin-f和β-actin-r為內(nèi)參，進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

其中，β-actin-f和β-actin-r的序列為：

β-actin-f：5’-gtggggcgccccaggcacca-3’(seqidno：3)，

β-actin-r：5’-ctccttaatgtcacgcacgatttc-3’(seqidno：4)。

其中，pcr擴(kuò)增體系為：

pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃，5min；98℃，10sec；50℃、15sec，72℃、30sec(32個(gè)循環(huán))；72℃、10min。

3)用凝膠電泳方法檢測(cè)pcr擴(kuò)增效果，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，不同性別有明顯的條帶區(qū)別(見(jiàn)圖2)。

對(duì)比例：

本對(duì)比例除了使用的引物為現(xiàn)有引物sry1-f2和sry1-r2，其他操作方法均與實(shí)施例2類似，具體操作步驟如下：

1)提取長(zhǎng)臂猿基因組dna；

2)以基因組dna為模板，以現(xiàn)有引物sry1-f2和sry1-r2為引物、β-actin-f和β-actin-r為內(nèi)參，進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

其中，sry1-f2和sry1-r2的序列為：

sry1-f2：5’-cgaactctggcacctttcaa-3’(seqidno：5)，

sry1-r2：5’-gttacccgattgtcctacagct-3’(seqidno：6)。

其中，pcr擴(kuò)增體系為：

pcr反應(yīng)程序?yàn)椋簊ry1：98℃，5min；98℃，10sec；55℃、15sec，72℃、30sec(32個(gè)循環(huán))；72℃、10min。

3)用凝膠電泳方法檢測(cè)pcr擴(kuò)增效果，如圖1和2所示。

圖1結(jié)果表明，使用現(xiàn)有傳統(tǒng)引物sry1(sry1-f2和sry1-r2)擴(kuò)增后，當(dāng)在677bp同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶和內(nèi)參基因條帶時(shí)判定為雄性長(zhǎng)臂猿，當(dāng)在677bp只出現(xiàn)內(nèi)參基因條帶時(shí)判定為雌性長(zhǎng)臂猿。然而，在100bp以下出現(xiàn)的模糊條帶為引物帶，250bp和500bp之前出現(xiàn)的條帶為雜帶，雜帶的出現(xiàn)說(shuō)明該引物特異性不高，發(fā)生了非特異性擴(kuò)增。并且圖2中使用傳統(tǒng)引物sry1(sry1-f2和sry1-r2)擴(kuò)增鑒定長(zhǎng)臂猿雄性和雌性的樣品中，擴(kuò)增片段明顯出現(xiàn)了非特異條帶，經(jīng)過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化也不能消除非特異性。而使用本發(fā)明引物sry233(sry233-f1和sry233-r1)為引物的pcr擴(kuò)增鑒定結(jié)果顯示，在233bp處雄性長(zhǎng)臂猿擴(kuò)增出一條特異帶，而雌雄長(zhǎng)臂猿在233bp處未擴(kuò)增出特異條帶，且電泳圖中無(wú)雜帶(見(jiàn)圖2中的泳道1和2)，說(shuō)明本發(fā)明引物sry233(sry233-f1和sry233-r1)的特異非常好，明顯優(yōu)于現(xiàn)有引物sry1(sry1-f2和sry1-r2)。

實(shí)施例4本發(fā)明引物sry233和現(xiàn)有引物sry1的pcr靈敏性對(duì)比

分別通過(guò)構(gòu)建質(zhì)粒pvax-sry233和pvax-sry1，提取質(zhì)粒pvax-sry233和pvax-sry1，并分別將這種質(zhì)粒濃度逐漸稀釋為10⁴copies/ml、10³copies/ml、10²copies/ml、10¹copies/ml、10⁰copies/ml作為模板，分別以引物sry233(sry233-f1和sry233-r1)和sry1(sry1-f2和sry1-r2)為進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序同上述實(shí)施例2和對(duì)比例。

如圖3可知，以sry1引物擴(kuò)增，最低檢測(cè)線為10個(gè)拷貝的基因，而圖4所示，以sry233引物擴(kuò)增，最低可以檢測(cè)到1個(gè)拷貝的基因。相比之下，本發(fā)明sry233為引物進(jìn)行長(zhǎng)臂猿性別鑒定檢測(cè)的靈敏度較傳統(tǒng)引物sry1的靈敏性高10倍。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>廣州動(dòng)物園

<120>一種鑒定長(zhǎng)臂猿性別的pcr引物、試劑盒及方法

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gggtcgcttcactctatc18

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gctctggcacctttcaatt19

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gtggggcgccccaggcacca20

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<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ctccttaatgtcacgcacgatttc24

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

cgaactctggcacctttcaa20

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gttacccgattgtcctacagct22