本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及naprt1基因及其編碼蛋白的用途。

背景技術(shù)：

結(jié)核病(tuberculosis,tb)是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染性疾病。結(jié)核病仍然是當(dāng)前危害人類健康最嚴(yán)重的傳染病之一。中國現(xiàn)有超過500萬名結(jié)核病活動(dòng)性患者，而感染結(jié)核病菌的人數(shù)則超過5億人，占全國總?cè)丝诘?5％。；全球約三分之一的人口感染結(jié)核分枝桿菌，在這些被稱為結(jié)核菌潛伏感染(ltbi)的人群中，有約10％最終將進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病。

造成結(jié)核病流行的現(xiàn)狀有多個(gè)方面的原因，其中缺乏特異、有效的結(jié)核感染診斷技術(shù)是重要的原因之一。由于不能早期發(fā)現(xiàn)和診斷結(jié)核菌感染/結(jié)核病，導(dǎo)致延誤病人治療機(jī)會，增加治療費(fèi)用和死亡率，而對于社區(qū)結(jié)核病的預(yù)防控制來說，沒有能夠有效的控制傳染源，造成結(jié)核病的擴(kuò)散。因此，研制特異有效的結(jié)核菌感染診斷試劑對結(jié)核病防治具有十分重要的意義。

目前國內(nèi)臨床采用的結(jié)核菌感染實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有兩類：微生物學(xué)檢查和免疫學(xué)檢測。前者包括痰或組織標(biāo)本找抗酸菌，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和pcr核酸檢測；后者有抗體和細(xì)胞免疫檢測，細(xì)胞免疫檢查包括ppd皮試和igra技術(shù)。細(xì)菌學(xué)檢查是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但臨床上相當(dāng)部分的病人沒有辦法留取痰標(biāo)本，在能獲得痰標(biāo)本的病例中，即便是水平最高的醫(yī)院，抗酸染色和細(xì)菌培養(yǎng)檢查的陽性率約為40％。采用pcr可以適當(dāng)提高敏感性至70％左右，但同樣受限于痰標(biāo)本的有無。使用血清抗體檢測簡便易行，陽性率在50％－80％，但特異性低，一般不超過70％。ppd皮試是目前檢測結(jié)核菌感染最常用的細(xì)胞免疫檢查方法，雖然操作簡單，但病人需要在皮試后72小時(shí)查驗(yàn)，最主要的是ppd皮試所用抗原與bcg有交叉反應(yīng)，無法區(qū)分bcg免疫反應(yīng)和現(xiàn)癥結(jié)核菌感染。利用免疫學(xué)檢測目前最好的檢測方法是igra技術(shù)，其敏感性是現(xiàn)有的診斷技術(shù)中最高的。然而，igra檢測無法有效區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核和結(jié)核菌潛伏感染。對于我國這樣的結(jié)核菌感染高發(fā)的地區(qū)，igra的診斷效率更為有限。

naprt1(nicotinatephosphoribosyltransferasedomaincontaining1，煙酸酯磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶域1)是細(xì)胞代謝中的重要酶，其底物煙酸(na)在nad生物合成中的重要前體。naprt1能增強(qiáng)胞內(nèi)nad水平以及抑制氧化應(yīng)激。目前發(fā)現(xiàn)結(jié)核病人可表達(dá)naprt1，然而其在結(jié)核中的作用機(jī)制并不清楚。尚沒有關(guān)于naprt1基因作為結(jié)核診斷標(biāo)志物的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種naprt1基因及其編碼蛋白的用途，naprt1基因及其編碼蛋白可作為判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的分子標(biāo)志物。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供naprt1基因及其編碼蛋白的用途，其特征在于，用于制備判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品的用途。

進(jìn)一步，所述判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品包括：用實(shí)時(shí)定量pcr或基因芯片檢測判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品。

進(jìn)一步，所述用實(shí)時(shí)定量pcr判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增naprt1基因的引物。

進(jìn)一步，所述特異擴(kuò)增naprt1基因的引物序列如seqidno:1和2所示。

seqidno:1為(5'—3')gcagtagtggctccacctg；記為naprt1f：

seqidno:2為(5'—3')tggacatgctgcagttagc；記為naprt1r。

進(jìn)一步，所述用基因芯片檢測判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的產(chǎn)品包括：與naprt1基因的核酸序列雜交的探針。

本發(fā)明的naprt1基因及其編碼蛋白的用途即可作為判別結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核的分子標(biāo)志物。

利用本發(fā)明可以檢測naprt1基因的表達(dá)情況，從而判別是否患有活動(dòng)性結(jié)核病。

在本發(fā)明中，術(shù)語“引物”是指一種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作為在一定條件下誘發(fā)dna合成的起始點(diǎn)，在合適條件下誘發(fā)合成與核酸鏈互補(bǔ)的引物擴(kuò)增產(chǎn)物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核苷及一種聚合試劑(即dna聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)存在下，在一種合適的緩沖液中并在合適的溫度下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。優(yōu)選的引物是單股寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長度取決于該引物的設(shè)計(jì)用途，但一般在15～25個(gè)核苷酸之間。

在本發(fā)明中，所述探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長度都可以。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明naprt1基因在結(jié)核病人血液中的表達(dá)明顯低于健康人群以及潛伏感染人群，因此naprt1基因可作為診斷結(jié)核的特異標(biāo)志基因，使結(jié)核診斷更加準(zhǔn)確、快速。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的naprt1基因在人外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)中差異表達(dá)的定量rt-pcr結(jié)果圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例2的naprt1基因在pbmc中差異表達(dá)的芯片結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：

將人群分為三組：結(jié)核病患者、潛伏感染人群和健康人群(各20例)，通過檢測每例外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)中naprt1基因mrna變化，發(fā)現(xiàn)其在治愈結(jié)核病人中呈明顯的下調(diào)表達(dá)趨勢。

本實(shí)施例用定量rt-pcr方法檢測每例naprt1基因的表達(dá)變化。具體步驟如下：

步驟一：外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)懸液的制備

在離心管中加入淋巴細(xì)胞分離液(freseniuskabinorgeas:lys3773)5ml；取上述確診的結(jié)核病患者，潛伏感染病人以及健康人群的肝素抗凝靜脈血各2ml與等體積量1m的磷酸緩沖液(pbs)充分混勻得到混合液，用移液器將混合液沿管壁緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液液面上，保持清晰的界面，2000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；用吸管吸取中間云霧層置入另一離心管后接著加入5倍體積的1mpbs，1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘洗滌細(xì)胞，棄上清，相同條件重復(fù)洗滌細(xì)胞一次，接著加入含小牛血清體積百分比為10％的的rpmi1640(thermoscientific：sh30807.01b)1ml，重懸細(xì)胞，得到三組人群的各20例pbmc懸液；每例取20μl的pbmc懸液于血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度。

步驟二：rna抽提

采用qiagene公司的rneasyminikit(貨號74106)對上述得到的三組人群的各20例pbmc懸液進(jìn)行rna抽提。具體操作是：取上述含1×106個(gè)細(xì)胞的pbmc懸液于去dna酶和rna酶的離心管中，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清；在細(xì)胞沉淀中加入350μlbufferrlt，充分混勻裂解；加入250μl無水乙醇，混勻，把液體轉(zhuǎn)移到rneasy柱子中，8,000g離心30秒，棄廢液；加入350μlbufferrw1以8,000g離心30秒，棄廢液；加入80μldnase溶液(10μldnase+70μlbufferrdd)，柱上消化15min，8,000g離心30秒，棄廢液；加入350μlbufferrw1，8,000g離心30秒，棄廢液；加入500μlbufferrpe，8,000g離心30秒，棄廢液；空甩，8,000g離心1分鐘；把柱子轉(zhuǎn)移到一個(gè)去dna酶和rna酶的1.5ml離心管，加入40μl無rnase的ddh2o，10,000g離心1分鐘，收集三組人群的各20例的rna于-80℃保存、待用。

步驟三：反轉(zhuǎn)錄

采用takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(drr047)，取步驟二得到的rna0.5μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，該試劑盒較傳統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒增加了去除基因組dna的步驟，可在最大程度上保證rna的純度和擴(kuò)增的特異性。

分步如下:

(1)基因組dna的去除反應(yīng)

42℃溫浴2min，于4℃下保存。

(2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

反應(yīng)體系配制均在冰上進(jìn)行，具體體系如下：

37℃溫浴15min，85℃放置5秒，反應(yīng)完放4℃保存。

步驟四：熒光定量pcr反應(yīng)

模板：上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為熒光定量pcr反應(yīng)的模板，模板用量為1μl。利用naprt1基因(nm_145201.4)和gadph基因(nm_002046.4)序列，設(shè)計(jì)兩對引物。由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，引物序列如下：

通過上述naprt1上下游引物，得到的pcr產(chǎn)物長度為120bp；通過gadph上下游引物，得到的pcr產(chǎn)物長度為243bp。

pcr反應(yīng)的體系：

pcr反應(yīng)采用takara公司的premixextaqtmii(貨號：drr081d)，此產(chǎn)品能夠抑制非特異性反應(yīng)，在寬廣的范圍內(nèi)進(jìn)行更加準(zhǔn)確的定量。本buffer和改良后的hotstart法用dna聚合酶takaraextaqhs組合使用，可以進(jìn)行再現(xiàn)性好、可信度高的realtimepcr解析。

使用儀器為abi7500實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr反應(yīng)。

實(shí)時(shí)定量pcr反應(yīng)采用兩步法pcr，擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：95℃30秒；95℃5秒，60℃30秒，40個(gè)循環(huán)。

根據(jù)實(shí)時(shí)定量pcr的結(jié)果，用abi7500softwarev2.0.6對結(jié)果進(jìn)行處理分析，以gadph基因?yàn)閮?nèi)參基因，利用2^-δδct的方法計(jì)算出結(jié)核患者和潛伏感染人群相對于健康人群的表達(dá)量，結(jié)果如圖1、2所示，其中橫坐標(biāo)表示不同的人群，縱坐標(biāo)表示相對表達(dá)量(rq)，縱坐標(biāo)越大表明其表達(dá)水平越高，結(jié)果表明，naprt1在結(jié)核病人中的表達(dá)水平明顯高于潛伏感染以及健康人群的表達(dá)水平(見圖1)，差異顯著(p＜0.05)。在圖1中，“tb”指活動(dòng)性結(jié)核感染者，“l(fā)tbi”指潛伏性結(jié)核感染者，“hc”指健康對照。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可通過定量rt-pcr診斷結(jié)核潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核：設(shè)計(jì)naprt1基因的pcr引物，檢測結(jié)核組織中naprt1基因的表達(dá)量，如果naprt1的表達(dá)量顯著升高，則說明患結(jié)核的可能性高，反之則低，以更好的區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核感染者與潛伏性結(jié)核感染者。

實(shí)施例2

本實(shí)施例將人群分為三組：結(jié)核病患者9例，潛伏感染人群和健康人群均6例，通過基因芯片檢測每例外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)中naprt1基因mrna變化，發(fā)現(xiàn)其在結(jié)核病患者中呈明顯的上調(diào)表達(dá)趨勢。

本實(shí)施例用基因芯片檢測結(jié)核樣本中naprt1基因在tb、ltbi、和hc中基因表達(dá)水平的差異，包括如下四個(gè)步驟：

步驟一：芯片制備

目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體，通過點(diǎn)樣法將靶基因作為探針按順序排列在載體上，靶基因可分為基因組dna、cdna(或人工合成dna)。

步驟二：樣品制備

待測樣品中總rna的抽提步驟如下：分別分離結(jié)核病患者、潛伏感染者以及健康人群的pbmc，再用qiagenerna提取試劑盒提取總rna(其具體方法參照實(shí)施例1)，提取的總rna進(jìn)一步用于樣品cdna探針制備，其過程包括熒光cy3和cy5探針的制備(cdna第一鏈標(biāo)記)、純化和定量，定量后的cy3和cy5標(biāo)記的探針吸回至1.5ml離心管中，加熱抽干，保存于-20℃，待雜交。

所述定量后的cy3和cy5標(biāo)記的探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其它衍生物，探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長度都可以。

步驟三：芯片雜交

1)準(zhǔn)備：(1)洗滌蓋玻片，將蓋玻片依次放入ddh2o、95％乙醇、ddh2o，各3min，最后放入干燥的50ml離心管中1000轉(zhuǎn)/分，離心3min，去除殘留的水漬，放置待用；(2)配制0.1m的pbs溶液；(3)平衡雜交爐，用水平儀校準(zhǔn)雜交爐，保持水平；(4)配制如下洗片液：20×ssc溶液、10％(m/v)sds溶液、洗液i(2×ssc/0.5％(m/v)sds)、洗液ii(1×ssc/0.1％(m/v)sds)、洗片溶液iii(0.1×ssc)。

2)預(yù)雜交配制預(yù)雜交液30μl(由9μl的20×sspe緩沖液、3μl的50×denhandts緩沖液和18μlddh2o組成)，取出芯片，將30μl預(yù)雜交液滴加于芯片上，蓋上蓋玻片，然后將芯片放入加有0.1mpbs的雜交盒，置于42℃雜交爐中預(yù)雜交1小時(shí)，預(yù)雜交完成之后取出芯片用ddh2o浸洗片刻，待蓋玻片脫落后將芯片放入干燥的離心管中離心，去除殘留的水漬，即得到預(yù)雜交的芯片。

3)雜交取出經(jīng)定量的cy3和cy5標(biāo)記的探針1～5μl，各用9～15μlddh2o充分溶解混合于1.5ml離心管內(nèi)，然后在此離心管繼續(xù)加入cy3/cy5熒光標(biāo)記探針的雜交液(由9μl的20×sspe緩沖液、3μl的50×denhandts緩沖液和18μlddh2o組成)得到雜交混合液，接著取雜交混合液滴加在預(yù)雜交的芯片上，并蓋上蓋玻片得到雜交芯片，最后將該雜交芯片放入加有0.1mpbs的雜交盒，置于42℃雜交箱中雜交12～20小時(shí)。

步驟四：信號檢測

芯片雜交反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行芯片洗滌，再通過掃描儀如激光共聚焦掃描儀進(jìn)行掃描，掃描后將圖像轉(zhuǎn)化為基于熒光強(qiáng)度的數(shù)字信號，用genpixpro6.0軟件讀取芯片數(shù)據(jù)，genepixpro6.0通過芯片的背景噪音以及雜交點(diǎn)的光強(qiáng)度分析，對每個(gè)點(diǎn)的光強(qiáng)度值校準(zhǔn)，并將每個(gè)雜交點(diǎn)的光強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)值。

為了研究naprt1在三個(gè)不同人群中的變化情況，我們采取了onewayanova結(jié)合bonferroni相關(guān)系數(shù)的分析方法，閾值設(shè)置為p＜0.05，最終經(jīng)分析，由基因芯片檢測結(jié)核中naprt1基因的表達(dá)差異，紅色代表基因表達(dá)上調(diào)，綠色代表基因表達(dá)下調(diào)(圖2中標(biāo)識a代表紅色，標(biāo)識b代表綠色；“tb”指活動(dòng)性結(jié)核感染者，“l(fā)tbi”指潛伏性結(jié)核感染者，“hc”指健康對照)。結(jié)果顯示在結(jié)核病人中naprt1基因表達(dá)顯著上調(diào)，而在ltbi和hc中，naprt1的表達(dá)量都是下調(diào)的。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。

sequencelisting

<110>陳心春

<120>naprt1基因的用途

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

gcagtagtggctccacctg19

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

tggacatgctgcagttagc19

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

gacagtcagccgcatcttct20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

ttaaaagcagccctggtgac20