本發(fā)明專利申請是申請?zhí)枮椤?014104472590”的發(fā)明專利的分案申請，原申請的申請日為“2014.09.03”，申請?zhí)枮椤?014104472590”，發(fā)明名稱為“鞘氨醇單胞菌的蝦青素合成酶及其編碼基因和鞘氨醇單胞菌遺傳操作的方法”。本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種產(chǎn)蝦青素基因工程菌的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：蝦青素（astaxanthin，又稱變胞藻黃素或蝦紅素），屬于酮式類胡蘿卜素，是一種較強的天然抗氧化劑。其獨特的分子結(jié)構(gòu)不但使其具有超強的抗氧化活性，還具有抗衰老、抗輻射、抗腫瘤及預(yù)防心腦血管疾病的作用。目前，蝦青素已在食品、飼料、保健品市場等廣泛應(yīng)用。然而天然蝦青素的來源非常有限，目前，蝦青素大多采用傳統(tǒng)突變技術(shù)產(chǎn)生的pfaffia菌株和微藻生產(chǎn)，但是，pfaffia發(fā)酵存在發(fā)酵周期長的缺點，而從藻類中獲得產(chǎn)物的生產(chǎn)技術(shù)仍不成熟。因此，開發(fā)新的天然蝦青素資源具有重要意義。鞘氨醇單胞菌是革蘭氏陰性菌，1990年被鑒定，專性需氧，以單側(cè)生極性鞭毛運動，多呈黃色。其黃色菌落多是由于產(chǎn)生類胡蘿卜素導(dǎo)致。細胞膜與一般的革蘭氏陰性菌不同，為鞘糖脂，這也使得對其的遺傳操作還未成熟。目前，在sphingomonasatcc55669中尚無任何基因方面的信息報道，也未有相關(guān)遺傳操作的文獻，即使是該菌株所在的屬也鮮有報道。目前，鞘氨醇單胞菌多可降解多元化的芳環(huán)化合物，是環(huán)境微生物的研究熱點，其遺傳操作的建立為進一步利用其降解機制建立了基礎(chǔ)。蝦青素生物合成途徑已被廣泛研究并取得了巨大進展，大量關(guān)鍵酶基因得到克隆。目前已知的類胡蘿卜素均通過類異戊二烯化合物或萜類化合物途徑合成。其中，非甲羥戊酸途徑mep（nonmevalonatepathway）途徑廣泛存在于細菌中，它以糖酵解中間代謝物丙酮酸和3-磷酸甘油醛為前體，在脫氧木酮糖磷酸合酶作用下生成脫氧木酮糖磷酸，然后受脫氧木酮糖磷酸還原酶和異構(gòu)酶催化，通過還原和異構(gòu)反應(yīng)將脫氧木酮糖磷酸轉(zhuǎn)變成2-甲基赤蘚糖醇-4-磷酸（mep）。經(jīng)胞苷三磷酸活化，腺苷三磷酸磷酸化，從而形成甲基赤蘚糖醇環(huán)化焦磷酸，然后轉(zhuǎn)變成ipp（異戊烯焦磷酸），ipp異構(gòu)化形成dmapp（二甲基丙烯基二磷酸）。ipp和dmapp是合成蝦青素途徑的前體物質(zhì)。兩者在ipp異構(gòu)酶作用下相互轉(zhuǎn)換達到平衡，在crte（牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶）作用下，1個dmapp與3個ipp分子縮合生成ggpp（牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸）。2分子ggpp在crtb（八氫番茄紅素合成酶）作用下形成第一個無色的類胡蘿卜素——八氫番茄紅素。八氫番茄紅素經(jīng)過連續(xù)的脫氫步驟（crti）生成番茄紅素。番茄紅素在crty（番茄紅素β-環(huán)化酶）的作用下生成β-胡蘿卜素。β-胡蘿卜素在crtz（β-胡蘿卜素羥化酶）和crtw（β-胡蘿卜素酮酶）的一系列作用下生成蝦青素（如圖1）。通過豐富不同來源的蝦青素生物合成相關(guān)基因，經(jīng)重組dna技術(shù)篩選，從而增加蝦青素生物合成的生產(chǎn)能力，是縮短發(fā)酵周期，提高蝦青素生物合成產(chǎn)率的重要途徑，從而為蝦青素進一步工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)蝦青素基因工程菌的構(gòu)建方法以及通過該方法得到的基因工程菌。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種產(chǎn)蝦青素基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：將產(chǎn)蝦青素質(zhì)粒pfz153轉(zhuǎn)化內(nèi)含質(zhì)粒pmh1、pfz81的mg1655大腸桿菌感受態(tài)細胞，得到產(chǎn)蝦青素基因工程菌；其中，產(chǎn)蝦青素質(zhì)粒pfz153通過包括如下步驟的方法得到：（1）大腸桿菌來源的idi基因通過pcr擴增克隆到載體pet28a（+）上獲得質(zhì)粒pgzi，將idi基因片段從pgzi中用ndei和xhoi切下插入到petduet-1相應(yīng)位點獲得pfz87。（2）以pfz87為模板用引物pagcrty-idi-r和pagcrtw-petduet-f擴增質(zhì)粒骨架；從cgmcc1.2244基因組dna擴增crty和crtz，引物分別為idi-pagcrty-f、crtz-pagcrty-r，crty-pagcrtz-f、crtw-pagcrtz-r；合成seqidno.1所示的crtw，以其為模板用引物crtz-brecrtw-f和brecrtw-r擴增crtw；crty、crtz、crtw和質(zhì)粒骨架四個片段用giboson方法連接獲得pfz152。（3）將合成序列分別如seqidno.2、3、4所示的crte、crtb和crti，將crte、crtb和crti分別克隆到pet28a(+)的ndei和ecori位點獲得pfz21、pfz22和pfz23。（4）以構(gòu)建pfz152同樣的方法分別以pfz87、pfz21、pfz22、pfz23為模板用引物petduet-ncoi-r、petduet-ecori-t7-f，duet-pancrte-f、pancrti-crte-r，pancrte-crti-f、pancrtb-crti-r，pancrti-crtb-f、duet-ecori-pancrtb-r擴增質(zhì)粒骨架、crte、crti和crtb，用giboson方法連接獲得質(zhì)粒pfz112。（5）將crte-crti-crtb用ndei和ecori從pfz112上切下插入到pfz152對應(yīng)的位點獲得產(chǎn)蝦青素質(zhì)粒pfz153。上述各引物序列如下：pagcrty-idi-r:cagatcataccgcggcatagtgtaatcctcctttatttaagctgggtaaatg，pagcrtw-petduet-f:cttatggcgtggtgagagctaactcgagtctggtaaagaaaccgc，idi-pagcrty-f:acccagcttaaataaaggaggattacactatgccgcggtatgatctgattc，crtz-pagcrty-r:gcattccaaatccacaacatatagtaatcctccttcattgcatcgcctgttgac，crty-pagcrtz-f:caggcgatgcaatgaaggaggattactatatgttgtggatttggaatgccctga，crtw-pagcrtz-r:ccactgcggcggtcattactcattcctcctttacttcccgggtggcgcgtc，crtz-brecrtw-f:cgccacccgggaagtaaaggaggaatgagtaatgaccgccgcagtggcagag，brecrtw-r:gcggtttctttaccagactcgagttagctctcaccacgccataag，petduet-ncoi-r:catggtatatctccttcttaaagttaaac，petduet-ecori-t7-f:taactagtgaattcgagctcggcgcgcctg，duet-pancrte-f:gaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgaccgtgtgtgcgaaaaaac，pancrti-crte-r:tcaccgtggtcggtttcatggttaattcctcctttacgacaccgctgccag，pancrte-crti-f:ctggcagcggtgtcgtaaaggaggaattaaccatgaaaccgaccacggtga，pancrtb-crti-r:tcagcagggacggattattcatgagtattacctcctttaaatcaggtcttccagcatc，pancrti-crtb-f:gatgctggaagacctgatttaaaggaggtaatactcatgaataatccgtccctgctga，duet-ecori-pancrtb-r:ttgtcgacctgcaggcgcgccgagctcgaattcactagttaaacggggcgctgccagag。一種產(chǎn)蝦青素基因工程菌，通過上述方法得到。本發(fā)明具有如下優(yōu)點和效果：本發(fā)明構(gòu)建的產(chǎn)蝦青素基因工程菌通過iptg誘導(dǎo)表達后蝦青素產(chǎn)量可達2.0mg/l左右（圖8）。附圖說明圖1是蝦青素合成路線圖。圖2是lc-ms檢測sphingomonasatcc55669中蝦青素結(jié)果。圖3是pfz153質(zhì)粒圖譜。圖4是ptm3518質(zhì)粒圖譜。圖5是ptm2930質(zhì)粒圖譜。圖6是ptm1181質(zhì)粒圖譜。圖7是hplc檢測轉(zhuǎn)化不同質(zhì)粒的mg1655菌株的蝦青素生成；2-5分別是轉(zhuǎn)化pfz153、ptm3518、ptm2930和ptm1181的菌株，1是蝦青素標準品（濃度為1ppm）。圖8是轉(zhuǎn)化不同質(zhì)粒的mg1655菌株的蝦青素產(chǎn)量對比。圖9是熒光顯微鏡檢測外源egfp蛋白在sphingomonasatcc55669中的表達，（a）和（b）分別是轉(zhuǎn)化pbbr1mcs2和ptmb2e質(zhì)粒的sphingomonasatcc55669。具體實施方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。除非有特殊說明，本發(fā)明中的寡核苷酸引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；dna序列測定由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；除非特殊說明，本發(fā)明所用限制性內(nèi)切酶、核酸外切酶、連接酶均購自neb，dna片段回收采用omegadna凝膠回收試劑盒，按說明書方法操作；pcr純化采用axygen試劑盒，按說明書方法操作。下述實施例中所用引物見下表。引物名稱序列（5'到3'）duet-pan3518-f2gaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgacgacgacgctcgatgcggpancrti-3518-rtcaccgtggtcggtttcatggttaattcctccttcagcgatcgcgttcgacgacgcrty-pag2930-fcaggcgatgcaatgaaggaggattactatatgccctggctccacggcatcccrtw-pag2930-rccactgcggcggtcattactcattcctcctttacttttctgccaacgtctgccrty-pag1181-f2caggcgatgcaatgaaggaggattactatatggcctggtacgagaagctggcrtw-pag1181-rccactgcggcggtcattactcattcctccttcatcgcccgacgcgatcggcgpagcrty-idi-rcagatcataccgcggcatagtgtaatcctcctttatttaagctgggtaaatgpagcrtw-petduet-fcttatggcgtggtgagagctaactcgagtctggtaaagaaaccgcidi-pagcrty-facccagcttaaataaaggaggattacactatgccgcggtatgatctgattccrtz-pagcrty-rgcattccaaatccacaacatatagtaatcctccttcattgcatcgcctgttgaccrty-pagcrtz-fcaggcgatgcaatgaaggaggattactatatgttgtggatttggaatgccctgacrtw-pagcrtz-rccactgcggcggtcattactcattcctcctttacttcccgggtggcgcgtccrtz-brecrtw-fcgccacccgggaagtaaaggaggaatgagtaatgaccgccgcagtggcagagbrecrtw-rgcggtttctttaccagactcgagttagctctcaccacgccataagpetduet-ncoi-rcatggtatatctccttcttaaagttaaacpetduet-ecori-t7-ftaactagtgaattcgagctcggcgcgcctgduet-pancrte-fgaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgaccgtgtgtgcgaaaaaacpancrti-crte-rtcaccgtggtcggtttcatggttaattcctcctttacgacaccgctgccagpancrte-crti-fctggcagcggtgtcgtaaaggaggaattaaccatgaaaccgaccacggtgapancrtb-crti-rtcagcagggacggattattcatgagtattacctcctttaaatcaggtcttccagcatcpancrti-crtb-fgatgctggaagacctgatttaaaggaggtaatactcatgaataatccgtccctgctgaduet-ecori-pancrtb-rttgtcgacctgcaggcgcgccgagctcgaattcactagttaaacggggcgctgccagagpan3518-crti-fcgtcgtcgaacgcgatcgctgaaggaggaattaaccatgaaaccgaccacggtga2930-brecrtw-fgcagacgttggcagaaaagtaaaggaggaatgagtaatgaccgccgcagtggcagag2930-pagcrty-rggatgccgtggagccagggcatatagtaatcctccttcattgcatcgcctgttgac1181-brecrtw-fcgccgatcgcgtcgggcgatgaaggaggaatgagtaatgaccgccgcagtggcagag1181-pagcrty-r2ccagcttctcgtaccaggccatatagtaatcctccttcattgcatcgcctgttgacegfpscagacatatggtgagcaagggcgaggagcegfpacgcagaattcttacttgtacagctcgtccatgccegfp-pbbrscggggtacctctagaaaaataattttgtttaacttegfp-pbbraccgctcgagtgcggccgcaagcttgtc實施例1鞘氨醇單胞菌中蝦青素產(chǎn)物的檢測提取鞘氨醇單胞菌sphingomonasatcc55669（從atcc購買）代謝產(chǎn)物，方法如下：將菌種在#272培養(yǎng)基平板（營養(yǎng)肉湯8g/l，葡萄糖5g/l，瓊脂1.6%）上活化，于26℃培養(yǎng)。挑菌落至5ml#272培養(yǎng)基（營養(yǎng)肉湯8g/l，葡萄糖5g/l）中26℃、220rpm培養(yǎng)，24h后轉(zhuǎn)接至100ml#272培養(yǎng)基中26℃、220rpm培養(yǎng)，od600至0.8時，轉(zhuǎn)接至300ml#272培養(yǎng)基中26℃、220rpm培養(yǎng)，60h后收菌。將菌液于8000rpm離心10min，收集菌體，加入10ml萃取劑（v丙酮:v甲醇=4:1），震蕩打散菌體后，萃取10min，8000rpm、4℃離心5min，移出上清，按上述步驟再萃取3次，收集上清，旋干，加入3ml丙酮溶解，13000rpm離心10min，取上清lc-ms檢測，提取過程避光。lc-ms檢測結(jié)果見圖2，蝦青素的分子量為596.39，經(jīng)過質(zhì)譜檢測器帶一個h+，為597.39，表明鞘氨醇單胞菌sphingomonasatcc55669可以產(chǎn)生蝦青素。實施例2鞘氨醇單胞菌中相關(guān)蝦青素生物合成基因的確定由實施例1可知，鞘氨醇單胞菌sphingomonasatcc55669可以產(chǎn)生蝦青素，該菌株中含有能夠產(chǎn)生蝦青素的生物合成途徑。將鞘氨醇單胞菌基因組信息在ncbi（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）blastp中進行比對，發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌中存在mep途徑，該途徑從丙酮酸經(jīng)dxs，dxr，ispe，ispdf，ispg，isph合成ipp和dmapp。ipp和dmapp經(jīng)類胡蘿卜素合成途徑通過crte，crtb，crti，crty，crtz，crtw生成蝦青素。在鞘氨醇單胞菌合成蝦青素的這條線性通路中，所得基因除crte、crtz，其他基因均為唯一。實施例3鞘氨醇單胞菌crte基因和crtz基因的擴增從鞘氨醇單胞菌sphingomonasatcc55669中提取基因組dna，提取方法如下：（1）取50ml新鮮菌液至尖底離心管，7000rpm×5min離心，棄上清。（2）加10ml的ddh2o，于振蕩器上打散，7000rpm×5min離心，棄上清。（3）加10ml的setbuffer（75mmnacl，25mmedta，20mmtris-cl），于振蕩器上打散，7000rpm×5min離心，棄上清。（4）加5ml的setbuffer，于振蕩器上打散，加150μl的溶菌酶（lysozyme，100mg/ml，-20℃），37℃水浴30-60min，每隔5-10min緩慢搖勻一次，至細胞壁完全裂解（鑒定細胞壁完全裂解：取少量菌液，加1滴10%sds，菌液清澈，拉絲）。（5）加10μlrnasea（10mg/ml），37℃水浴10min。加250μl的蛋白酶k（proteinasek，20mg/ml，-20℃），37℃水浴30min。（6）加5ml10%sds，55℃水浴2h，每隔15min輕輕搖勻一次。（7）加2ml5mnacl，輕輕搖勻，有白色沉淀析出。（8）將液體轉(zhuǎn)移至50ml圓底離心管（beckman），加10ml氯仿，緩慢搖勻30min（注意放氣），12000rpm×15min離心（轉(zhuǎn)子ja25.50，beckman），取上清液（大口槍頭），重復(fù)步驟（8）2次，最后一次將上清轉(zhuǎn)移至50ml尖底離心管。（9）加0.8倍體積的異丙醇，輕搖混勻至出現(xiàn)絲狀dna。將dna挑至ep管中，加70%的乙醇洗2次，倒掉乙醇，自然風干，室溫溶于一定量的ddh2o中。將提取的基因組dna作為pcr模板，利用引物duet-pan3518-f2和pancrti-3518-r擴增出鞘氨醇單胞菌的crte（gene3518）基因。pcr反應(yīng)體系為40μl：15.4μlh2o，8μl5×q5reactionbuffer，8μl5×highgcenhancer，3.2μl2.5mmdntps，2μl10mm正向引物，2μl10mm反向引物，1μl模板dna（1-100ng），0.4μlq5high-fidelitydnapolymerase。pcr反應(yīng)程序為：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)；最后以72℃延伸6min。利用引物crty-pag2930-f和crtw-pag2930-r擴增出鞘氨醇單胞菌的crtz（gene2930）基因，利用引物crty-pag1181-f2和crtw-pag1181-r擴增出鞘氨醇單胞菌的crtz（gene1181）基因，兩個反應(yīng)的pcr反應(yīng)體系均為40μl：23.4μlh2o，8μl5×q5reactionbuffer，3.2μl2.5mmdntps，2μl10mm正向引物，2μl10mm反向引物，1μl模板dna（1-100ng），0.4μlq5high-fidelitydnapolymerase。pcr反應(yīng)程序為：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)；最后以72℃延伸5min。實施例4crte基因和crtz基因的功能驗證本實施例通過gibsonmethod構(gòu)建有關(guān)克隆質(zhì)粒，驗證crte基因和crtz基因的功能。圖3所示為已知蝦青素生物合成相關(guān)基因的克隆質(zhì)粒pfz153，其構(gòu)建方法見下。圖4所示為將pfz153中crte基因替換為gene3518后構(gòu)建的質(zhì)粒ptm3518。圖5所示為將pfz153中crtz基因替換為gene2930后構(gòu)建的質(zhì)粒ptm2930。圖6所示為將pfz153中crtz基因替換為gene1181后構(gòu)建的質(zhì)粒ptm1181。1、產(chǎn)蝦青素的陽性克隆質(zhì)粒pfz153的構(gòu)建：質(zhì)粒pfz153以petduet-1為骨架載體，插入片段crteib-idi-crtyzw完成，具體構(gòu)建方法如下：大腸桿菌來源的idi基因通過pcr擴增克隆到載體pet28a（+）上獲得質(zhì)粒pgzi（fayinzhu,invitroreconstitutionofmevalonatepathwayandtargetedengineeringoffarneseneoverproductioninescherichiacoli.biotechnol.bioeng.2014;111:1396–1405.），將idi基因片段從pgzi中用ndei和xhoi切下插入到petduet-1相應(yīng)位點獲得pfz87。以pfz87為模板用引物pagcrty-idi-r和pagcrtw-petduet-f擴增質(zhì)粒骨架。從cgmcc1.2244基因組dna擴增crty和crtz，引物分別為idi-pagcrty-f，crtz-pagcrty-r；crty-pagcrtz-f，crtw-pagcrtz-r。來源于brevundimonassp.sd212的crtw經(jīng)密碼子優(yōu)化后合成，以優(yōu)化的crtw（seqidno.1）為模板，用引物crtz-brecrtw-f和brecrtw-r擴增crtw。crty、crtz、crtw和質(zhì)粒骨架四個片段用giboson方法連接（danielg.gibson,enzymaticassemblyofoverlappingdnafragments,methodsinenzymology,volume498,2011,pages349-361.）獲得pfz152。將經(jīng)密碼子優(yōu)化的pantoeaananatis的crte（seqidno.2）、crtb（seqidno.3）和crti（seqidno.4）基因合成后（基因合成時在序列兩端加ndei和ecori酶切位點）克隆到pet28a(+)的ndei和ecori位點獲得pfz21、pfz22和pfz23。以構(gòu)建pfz152同樣的方法分別以pfz87，pfz21，pfz22，pfz23為模板用引物petduet-ncoi-r，petduet-ecori-t7-f；duet-pancrte-f，pancrti-crte-r；pancrte-crti-f，pancrtb-crti-r；pancrti-crtb-f，duet-ecori-pancrtb-r擴增質(zhì)粒骨架，crte，crti和crtb，用giboson方法連接獲得質(zhì)粒pfz112。將crte-crti-crtb用ndei和ecori從pfz112上切下插入到pfz152對應(yīng)的位點獲得pfz153。2、含有目的片段的ptm3518，ptm2930，ptm1181質(zhì)粒構(gòu)建：該步pcr擴增模板均為質(zhì)粒pfz153。（1）質(zhì)粒構(gòu)建所需片段的擴增質(zhì)粒ptm3518由片段gene3518，petduet-1（3518），crtib-idi-crtyzw（3518）構(gòu)成。其中，gene3518片段的擴增見實施例3。petduet-1（3518）和crtib-idi-crtyzw（3518）片段的擴增如下：利用引物pagcrtw-petduet-f和petduet-ncoi-r擴增出petduet-1（3518）片段，利用引物pan3518-crti-f和brecrtw-r擴增出crtib-idi-crtyzw（3518）片段，兩個反應(yīng)的pcr反應(yīng)體系均為40μl：23.4μlh2o，8μl5×q5reactionbuffer，3.2μl2.5mmdntps，2μl10mm正向引物，2μl10mm反向引物，1μl模板dna（1-100ng），0.4μlq5high-fidelitydnapolymerase。pcr反應(yīng)程序為：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30個循環(huán)；最后以72℃延伸7min。質(zhì)粒ptm2930由片段gene2930，crtw-petduet-1（2930），crteib-idi-crty（2930）構(gòu)成。其中，gene2930片段的擴增見實施例3。crtw-petduet-1（2930）和crteib-idi-crty（2930）片段的擴增如下：利用引物2930-brecrtw-f和petduet-ncoi-r擴增出crtw-petduet-1（2930）片段，利用引物duet-pancrte-f和2930-pagcrty-r擴增出crteib-idi-crty（2930）片段，兩個反應(yīng)的pcr反應(yīng)體系均為40μl：23.4μlh2o，8μl5×q5reactionbuffer，3.2μl2.5mmdntps，2μl10mm正向引物，2μl10mm反向引物，1μl模板dna（1-100ng），0.4μlq5high-fidelitydnapolymerase。pcr反應(yīng)程序為：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30個循環(huán)；最后以72℃延伸7min。質(zhì)粒ptm1181由片段gene1181，crtw-petduet-1（1181），crteib-idi-crty（1181）構(gòu)成。其中，gene1181片段的擴增見實施例3。crtw-petduet-1（1181）和crteib-idi-crty（1181）片段的擴增如下：利用引物1181-brecrtw-f和petduet-ncoi-r擴增出crtw-petduet-1（1181）片段，利用引物duet-pancrte-f和1181-pagcrty-r2擴增出crteib-idi-crty（1181）片段，兩個反應(yīng)的pcr反應(yīng)體系均為40μl：23.4μlh2o，8μl5×q5reactionbuffer，3.2μl2.5mmdntps，2μl10mm正向引物，2μl10mm反向引物，1μl模板dna（1-100ng），0.4μlq5high-fidelitydnapolymerase。pcr反應(yīng)程序為：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30個循環(huán)；最后以72℃延伸7min。（2）克隆質(zhì)粒的獲得電泳鑒定pcr擴增產(chǎn)物正確后，經(jīng)過膠回收各pcr擴增產(chǎn)物，用nanodrop測定各pcr產(chǎn)物濃度。片段petduet-1（3518），crtib-idi-crtyzw（3518），gene3518；crtw-petduet-1（2930），crteib-idi-crty（2930），gene2930；crtw-petduet-1（1181），crteib-idi-crty（1181），gene1181分別用giboson方法連接獲得質(zhì)粒ptm3518、ptm2930、ptm1181。3、將質(zhì)粒ptm3518、ptm2930、ptm1181、pfz153分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞mg1655（內(nèi)含質(zhì)粒pmh1、pfz81（fayinzhu,invitroreconstitutionofmevalonatepathwayandtargetedengineeringoffarneseneoverproductioninescherichiacoli,biotechnol.bioeng.2014;111:1396–1405.）。挑轉(zhuǎn)化子于含有34μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素、100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中于37℃、220rpm培養(yǎng)過夜。以1%接種量轉(zhuǎn)接200ml含有34μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素、100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基30℃、200rpm培養(yǎng)，陰性對照為內(nèi)含質(zhì)粒pmh1和質(zhì)粒pfz81的mg1655菌株。od600達到0.7-0.9時加終濃度0.1mmiptg（異丙基-β-d-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)，培養(yǎng)15h后取樣2ml，12000rpm離心3min，去上清，加1ml萃取劑（v丙酮:v甲醇=4:1），震蕩打散菌體后，超聲10min，13000rpm、4℃離心10min，取上清hplc檢測，提取過程避光。4、產(chǎn)物高效液相色譜（hplc）檢測hplc分析條件：色譜柱：4.6×250mm5μmdionexacclaim120c18。流動相：a：水，b：乙腈（0.1%甲酸）；0min：50%b，5min：100%b，20min：100%b，25min：50%b，27min：50%b。流速1ml/min。上樣量：20μl。柱溫：25℃。檢測器：紫外多波長（vwd）檢測器。標準品為1mg/l蝦青素。經(jīng)hplc檢測結(jié)果（圖7）可知，分別轉(zhuǎn)化了pfz153、ptm3518、ptm2930、ptm1181質(zhì)粒的mg1655（內(nèi)含質(zhì)粒pmh1、pfz81）的各個菌株的提取產(chǎn)物，在與蝦青素標準品的同一保留時間下，均可檢測到蝦青素的生成，但含量有高低差別。其中，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒ptm3518的mg1655菌株（內(nèi)含質(zhì)粒pmh1、pfz81）蝦青素產(chǎn)量可達2.5mg/l（如圖8）。上述結(jié)果說明鞘氨醇單胞菌的crte（gene3518）基因、crtz（gene2930）基因和crtz（gene1181）基因具有相應(yīng)的功能。實施例5鞘氨醇單胞菌中遺傳操作的建立本發(fā)明在sphingomonasatcc55669中建立了遺傳操作方法，所用載體為質(zhì)粒pbbr1mcs2，啟動子為lac，復(fù)制子為pbbr1mcs2，本發(fā)明以外源基因egfp（enhancedgreenfluorescentprotein）是否表達作為該菌株遺傳操作系統(tǒng)建立成功與否的依據(jù)。將含有egfp基因的商業(yè)質(zhì)粒經(jīng)引物egfpa和egfps將egfp基因克隆到pet28a(+)的ndei和ecori位點，獲得質(zhì)粒pet28a-egfp，以此作為pcr模板，利用引物egfp-pbbrs和egfp-pbbra擴增出egfp基因。pcr反應(yīng)體系為20μl：13.6μlh2o，2μl10×buffer（pfu），1μl2.5mmdntps，1μl10mm正向引物，1μl10mm反向引物，1μl模板dna（1-100ng），0.4μlpfudnapolymerase。pcr反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3.5min；95℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸2min，30個循環(huán)；最后以72℃延伸5min。將該片段經(jīng)kpni和saci雙酶切回收后，插入到經(jīng)kpni和saci雙酶切處理的載體pbbr1mcs2上，該重組質(zhì)粒被命名為ptmb2e。將質(zhì)粒ptmb2e經(jīng)電轉(zhuǎn)化操作轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞sphingomonasatcc55669，于含30μg/ml卡那霉素#272培養(yǎng)基平板（營養(yǎng)肉湯8g/l，葡萄糖5g/l，瓊脂1.6%）26℃培養(yǎng)。挑轉(zhuǎn)化子至添加30μg/ml卡那霉素的5ml#272培養(yǎng)基中26℃、220rpm培養(yǎng)，陰性對照為轉(zhuǎn)化pbbr1mcs2質(zhì)粒的sphingomonasatcc55669菌株。od600達到0.7時加終濃度0.1mmiptg誘導(dǎo)，24h后取樣，采用熒光顯微鏡檢測egfp的表達（圖9）。如圖9a為陰性對照，在光學(xué)顯微鏡下有細胞團，但在熒光顯微鏡下沒有發(fā)現(xiàn)該視野下有熒光；9b為樣品，在光學(xué)顯微鏡下觀測到的細胞團在熒光顯微鏡下可見熒光。說明，外源基因egfp在宿主sphingomonasatcc55669中成功表達。sequencelisting<110>武漢生物技術(shù)研究院，武漢大學(xué)<120>一種產(chǎn)蝦青素基因工程菌的構(gòu)建方法<130>1<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>735<212>dna<213>brevundimonassp.sd212<400>1atgaccgccgcagtggcagagccgcgtatcgttccgcgtcagacctggattggcctgacc60ctggccggcatgattgttgccggctggggcagcctgcatgtttacggcgtgtacttccac120cgctggggcaccagtagcctggtgatcgtgccggccatcgtggcagtgcagacctggctg180agcgtgggcctgttcatcgtggcacacgacgcaatgcacggtagtttagccccgggtcgt240cctcgtttaaacgccgccgtgggtcgtctgaccttaggcctgtacgccggctttcgcttc300gaccgcctgaagaccgcccatcacgcacaccatgcagcacctggtaccgccgacgacccg360gatttctatgcaccggcacctcgcgccttcttaccgtggttcctgaacttcttccgcacc420tacttcggctggcgcgagatggccgtgttaaccgccctggtgctgatcgccttattcggt480ctgggtgcacgccctgccaacctgctgaccttctgggcagcccctgcactgctgagcgcc540ttacagctgttcaccttcggcacatggctgccgcaccgccataccgatcagccgtttgcc600gacgcccaccatgcacgtagcagtggctacggccctgtgctgagcctgctgacctgcttc660cattttggccgccaccatgagcaccacctgacaccttggcgtccgtggtggcgcttatgg720cgtggtgagagctaa735<210>2<211>909<212>dna<213>pantoeaananatis<400>2atgaccgtgtgtgcgaaaaaacatgtgcatctgacccgtgacgccgccgaacaactgctg60gccgacatcgaccgccgcctggatcaactgctgccggttgaaggcgaacgtgatgtggtt120ggtgcagcaatgcgtgaaggcgcgctggcaccgggtaaacgtattcgcccgatgctgctg180ctgctgaccgcgcgtgatctgggttgcgcagtcagtcacgatggtctgctggacctggca240tgtgctgtcgaaatggttcatgcggctagcctgatcctggatgacatgccgtgcatggat300gacgcaaaactgcgtcgcggtcgtccgaccattcatagccactatggtgaacacgttgca360atcctggcagcagtcgcactgctgtctaaagcctttggcgtgattgcagatgcagacggt420ctgacgccgctggcaaaaaaccgtgctgtcagtgaactgtccaatgcgatcggtatgcag480ggtctggtgcagggccaattcaaagacctgagtgaaggtgacaaaccgcgctccgcagaa540gctattctgatgaccaaccactttaaaacctctacgctgttctgcgcatctatgcagatg600gcttctatcgttgcgaatgccagctctgaagcccgtgattgtctgcatcgctttagcctg660gatctgggccaggcattccaactgctggatgacctgaccgatggcatgaccgacacgggt720aaagattcaaaccaggacgcgggcaaatcgacgctggtgaatctgctgggtccgcgtgca780gttgaagaacgtctgcgccagcatctgcaactggcttcagaacacctgtcggcagcttgt840caacatggtcacgcaacgcagcacttcatccaagcctggttcgataaaaaactggcagcg900gtgtcgtaa909<210>3<211>930<212>dna<213>pantoeaananatis<400>3atgaataatccgtccctgctgaatcacgctgttgaaacgatggctgtcggctctaaatca60tttgctaccgcttctaaactgttcgacgcaaaaacccgtcgctccgttctgatgctgtat120gcgtggtgccgtcattgtgatgacgtcattgatgaccagacgctgggttttcaggcacgt180caaccggcactgcagaccccggaacaacgtctgatgcagctggaaatgaaaacgcgccaa240gcatacgctggtagccagatgcacgaaccggcctttgcggccttccaggaagtcgcgatg300gcccatgatattgcaccggcttatgcgtttgaccacctggaaggcttcgcgatggatgtg360cgtgaagcacagtactctcaactggatgacaccctgcgctattgctaccatgtggcgggc420gtggttggtctgatgatggcccagatcatgggcgttcgtgataacgcaaccctggatcgt480gcgtgcgacctgggtctggctttccagctgacgaatattgcacgtgatatcgtggatgac540gcccatgcaggccgctgttatctgccggcgtcatggctggaacacgaaggtctgaacaaa600gaaaattacgcagctccggaaaaccgtcaagctctgtcgcgcatcgcgcgtcgcctggtt660caggaagccgaaccgtattacctgagcgctaccgcaggtctggcaggtctgccgctgcgt720tctgcctgggcaattgctacggcgaaacaagtctatcgcaaaatcggcgtcaaagtggaa780caggctggtcagcaagcgtgggatcagcgtcaaagtaccacgaccccggaaaaactgacc840ctgctgctggcggcctccggtcaggcgctgacctcccgtatgcgtgctcatccgccgcgt900ccggcccatctgtggcaacgtccgctgtaa930<210>4<211>1479<212>dna<213>pantoeaananatis<400>4atgaaaccgaccacggtgattggtgctggctttggcggcctggctctggcgattcgtctg60caagcggctggcattccggtgctgctgctggaacagcgtgataaaccgggcggtcgcgcc120tatgtttacgaagatcaaggctttaccttcgacgctggtccgaccgtcattacggacccg180agtgcgatcgaagaactgtttgcgctggccggcaaacagctgaaagaatatgttgaactg240ctgccggtcaccccgttttaccgtctgtgctgggaatctggtaaagtgttcaactatgat300aatgaccagacgcgcctggaagctcaaattcagcaattcaacccgcgtgatgttgaaggc360tatcgccagtttctggactacagtcgtgccgtgttcaaagaaggctatctgaaactgggt420accgttccgtttctgtccttccgtgatatgctgcgtgcagccccgcagctggcaaaactg480caagcctggcgtagcgtgtattctaaagttgctagctacatcgaagatgaacacctgcgc540caggcgtttagtttccattccctgctggttggcggcaatccgtttgccaccagctctatt600tatacgctgatccatgcactggaacgtgaatggggtgtctggtttccgcgcggcggtacc660ggcgcgctggtgcagggtatgattaaactgttccaggatctgggcggcgaagtggttctg720aacgcccgcgttagccacatggaaaccacgggcaataaaatcgaagcagtccatctggaa780gatggtcgtcgctttctgacccaggcagtggcttctaacgcagatgtcgtgcacacgtat840cgtgacctgctgagccagcatccggcagctgtgaaacagtctaacaaactgcaaaccaaa900cgcatgtcaaattcgctgtttgttctgtacttcggcctgaaccatcaccatgatcagctg960gcgcaccatacggtctgttttggcccgcgttatcgcgaactgattgacgaaatctttaat1020cacgatggtctggcggaagacttctcactgtacctgcacgcgccgtgcgtgaccgatagt1080tccctggcaccggaaggctgtggttcgtattacgtcctggcaccggtgccgcacctgggt1140accgctaacctggattggacggtggaaggtccgaaactgcgtgaccgcatttttgcctat1200ctggaacagcactacatgccgggcctgcgtagccaactggttacccatcgcatgttcacg1260ccgtttgatttccgtgaccagctgaatgcatatcatggttcagctttttcggttgaaccg1320gtcctgacccaatccgcatggttccgtccgcacaaccgcgataaaaccattacgaatctg1380tacctggttggcgcgggtacgcatccgggcgccggtatcccgggtgtgattggctcggcg1440aaagcgacggctggcctgatgctggaagacctgatttaa1479當前第1頁12