本發(fā)明涉及核酸領(lǐng)域，具體涉及一種circrna及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：環(huán)形rna是一類單鏈、共價閉合環(huán)狀的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。真核生物中有一類源自于mrna前體反向剪接(back-splicing)(lasdaandparker,2014)的環(huán)形rna，被稱作circrna。據(jù)報道，早在20多年前，circrna就已經(jīng)被鑒定出(cocquerelleetal.,1993；nigroetal.,1991；pasmanetal.,1996)，但大多數(shù)被認為是異常剪接的產(chǎn)物，其存在和潛在功能均未被重視。近年來，隨著二代高通量測序技術(shù)以及生物信息技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)circrna在各類真核生物中廣泛存在(hansenetal.,2011；memczaketal.,2013；salzmanetal.,2013；salzmanetal.,2012；wangetal.,2014)。目前，在真核生物中發(fā)現(xiàn)的大部分circrna的豐度均非常低，說明其可能是一些rna剪接的副產(chǎn)物，具有重要生理功能的可能性較低(bachmayr-heydaetal.,2015；guoetal.,2014；salzmanetal.,2013；zhangetal.,2014)。然而，研究也發(fā)現(xiàn)了許多高豐度的circrna，暗示其具有重要的生理功能(hansenetal.,2011；jecketal.,2013；memczaketal.,2013；salzmanetal.,2013；salzmanetal.,2012)。circrna較線性rna穩(wěn)定，并多定位于細胞質(zhì)中(jecketal.,2013；memczaketal.,2013；salzmanetal.,2012)。此外，circrna的環(huán)化具有保守性，其表達模式往往具有時空特異性(jecketal.,2013；memczaketal.,2013；salzmanetal.,2013；szaboetal.,2015；venoetal.,2015)。circrna的生物合成受順式元件(cis-element)和反式因子(trans-actingfactor)調(diào)控(chen,2016；salzman,2016)。反向剪接位點(back-splicingsite)兩側(cè)內(nèi)含子中的互補序列或反向重復(fù)序列可通過形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)等二級結(jié)構(gòu)的方式促進circrna的生成(jecketal.,2013；krameretal.,2015；liangandwilusz,2014；zhangetal.,2014)。有些外顯子的側(cè)翼內(nèi)含子序列中含有多對互補序列，可通過形成不同的互補結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生多種circrna，該過程被稱作選擇性環(huán)化(alternativecircularization)(zhangetal.,2014)。然而，有許多circrna的側(cè)翼序列并不含互補序列，說明可能存在其他順式元件如一些rna結(jié)合蛋白(rna-bindingprotein,rbp)識別序列參與環(huán)化過程(ashwal-flussetal.,2014；connetal.,2015；wangandwang,2015)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生環(huán)化的外顯子可能有一定的長度要求，且其側(cè)翼內(nèi)含子序列也往往比普通內(nèi)含子序列長(krameretal.,2015；szaboetal.,2015；westholmetal.,2014；zhangetal.,2014)。外顯子環(huán)化可發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平(ashwal-flussetal.,2014；krameretal.,2015)，也可發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平(liangandwilusz,2014)。一些反式剪接因子如rbp可參與circrna的環(huán)化。剪接因子muscleblind(mbl)(ashwal-flussetal.,2014)和quaking(qki)(connetal.,2015)均可通過與rna結(jié)合而形成復(fù)合物的方式促進環(huán)化反應(yīng)。作用于rna的腺苷脫氨酶1(adenosinedeaminaseiactingonrna,adar1)也是一種rna結(jié)合蛋白，其可通過解開rna二級結(jié)構(gòu)的方式抑制circrna的生成(ivanovetal.,2015；rybak-wolfetal.,2015)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，不均一核糖核蛋白(heterogeneousnuclearribonucleoprotein,hnrnp)和精氨酸-絲氨酸富集蛋白(serine-arginineprotein,srprotein)可以共同參與circrna的生物合成調(diào)控(krameretal.,2015)。目前關(guān)于circrna的生物學(xué)功能的研究還非常少。近期的研究表明，該類rna可參與基因的表達調(diào)控。首先，一些circrna可通過結(jié)合mirna的方式參與基因表達調(diào)控(gengetal.,2016；hansenetal.,2013；memczaketal.,2013；wangetal.,2016；zhengetal.,2016)。然而，很多高豐度的circrna并不含有mirna結(jié)合位點，而且有些生物體甚至沒有sirna調(diào)控通路，這都說明通過抑制mirna的方式調(diào)控基因表達可能不是circrna的普遍功能(guoetal.,2014；jeckandsharpless,2014；luetal.,2015；wangetal.,2014)。第二，circrna可調(diào)控基因的剪接。例如，果蠅circrnacircmbl的合成可通過結(jié)合剪接因子mbl與其pre-mrna的剪接相競爭(ashwal-flussetal.,2014)。第三，circrna可直接調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程。有一類circrna含有“保留內(nèi)含子(retainedintrons)”，主要定位于細胞核，該類circrna被稱作elcirna，可通過與u1snrnp互作促進其來源基因的轉(zhuǎn)錄(lietal.,2015b)。最后,研究表明，有些circrna可在體內(nèi)或體外翻譯成蛋白質(zhì)(abeetal.,2015；legninietal.,2017；pamudurtietal.,2017；yangetal.,2017)。此外，circrna可能在細胞通訊中起作用，也可能作為生物標記物(biomarker)(alhasanetal.,2016)(lasdaandparker,2016；lietal.,2015a)。當前，circrna的研究尚處于初始階段，近年來的主要工作仍是圍繞circrna的存在性鑒定，且主要集中在人和動物中，植物中很少，目前只有擬南芥、水稻和番茄中的circrna有鑒定(luetal.,2015；wangetal.,2014；yeetal.,2015；zuoetal.,2016)。circrna的主要生物學(xué)功能尚不明朗，該領(lǐng)域的研究非常少。類胡蘿卜素在生物體內(nèi)通過異戊二烯途徑合成，是呈現(xiàn)紅色、橙色和黃色等顏色的一大類色素物質(zhì)的總稱。類胡蘿卜素主要存在于植物的葉綠體以及許多花和果實的有色體中，不僅可以使植物器官顯示各種顏色，還可參與光合作用中的光吸收過程，并可清除光合作用產(chǎn)生的葉綠素三線態(tài)和單線態(tài)及超氧陰離子等自由基。類胡蘿卜素(番茄紅素)的生物合成途徑現(xiàn)在已有廣泛的研究，但是其各合成基因的表達調(diào)控機制還不甚清楚。八氫番茄紅素合成酶(phytoenesynthase，psy)是植物類胡蘿卜素(或番茄紅素)生物合成過程中的重要限速酶，其催化兩分子的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(ggpp)轉(zhuǎn)化為八氫番茄紅素。該轉(zhuǎn)化是異戊烯基二磷酸生物合成類胡蘿卜素的關(guān)鍵步驟之一。因此，八氫番茄紅素合成酶的編碼基因psy是植物基因工程調(diào)控轉(zhuǎn)基因植物花、果實顏色以及類胡蘿卜素含量的重要靶基因。鑒于上述類胡蘿卜素的各種有益效果，因此亟需找到以類胡蘿卜素生物合成中的關(guān)鍵基因例如八氫番茄紅素合成酶(phytoenesynthase，psy)基因為靶標的物質(zhì)，通過對該基因表達的調(diào)控實現(xiàn)對植物中類胡蘿卜素含量的調(diào)控以及對植物花、果實顏色發(fā)育的調(diào)控。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種circrna，其可以調(diào)控植物中八氫番茄紅素合成酶1基因(psy1)的表達，由此調(diào)控植物中類胡蘿卜素含量以及植物果實顏色發(fā)育。在第一方面，本發(fā)明提供了一種circrnapsy1-circ1，其序列示于seqidno:1。在第二方面，本發(fā)明提供了一種用于擴增本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1的引物對；優(yōu)選地，所述引物對為seqidno:2和seqidno:3，或者seqidno:4和seqidno:5。在第三方面，本發(fā)明提供了一種表達載體，其包含本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1。在第四方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)控植物八氫番茄紅素合成酶1基因(psy1)表達的方法，所述方法包括在所述植物中過表達本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1或者抑制本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1的表達。在第五方面，本發(fā)明提供一種調(diào)控植物類胡蘿卜素含量的方法，所述方法包括通過在所述植物中過表達本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1。在第六方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)控番茄果實顏色發(fā)育的方法，包括在番茄中過表達本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1。藉由本發(fā)明的circrnapsy1-circ1的過表達，可以實現(xiàn)對植物八氫番茄紅素合成酶1基因、植物類胡蘿卜素含量和番茄果實顏色發(fā)育的調(diào)控。具體地，circrnapsy1-circ1的過表達可以抑制植物八氫番茄紅素合成酶1基因的表達并且由此降低植物中的類胡蘿卜素含量；抑制circrnapsy1-circ1的表達可以提高植物八氫番茄紅素合成酶1基因的表達并且增加植物的類胡蘿卜素含量。另外，藉由circrnapsy1-circ1，可以實現(xiàn)對番茄果實顏色發(fā)育的調(diào)控：circrnapsy1-circ1的過表達可以使番茄結(jié)出黃色果實。還需要指出的是，circrna比較穩(wěn)定，相較于其他rna，更有利于遺傳調(diào)控。附圖說明下面對本發(fā)明的附圖進行簡單介紹。圖1是示出rt-pcr方法驗證circrna的引物設(shè)計示意圖，其中exon7和exon8為psy1-circ1的兩個外顯子，離散引物(標注在外顯子旁邊的箭頭)用于擴增circrnapsy1-circ1。圖2是示出采用rnaser耐受性實驗檢測circrna存在的流程圖，并且在流程圖示出了rnaser耐受性實驗可能出現(xiàn)的檢測結(jié)果，即若是circrna，則可以耐受rnaser的消化，若是線性rna，則會被rnaser消化掉。圖3示出對番茄果實中psy1-circ1的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果。圖4為用于實時pcr鑒定circrna表達量的引物設(shè)計示意圖，其中一個引物(如正向引物)需跨越反向剪接位點，且跨位點后的3’端序列為3-6bp，保證能準確擴增出相應(yīng)的circrna，且不能擴增線性rna和其他反向剪接位點位于相近區(qū)域的非特異circrna。圖5為不同成熟期番茄果實中的circrnapsy1-circ1及其來源基因的表達分析結(jié)果。圖6為構(gòu)建psy1-circ1過表達載體的示意圖。圖7為轉(zhuǎn)基因番茄(ac)中psy1-circ1及其來源基因psy1的相對表達量分析，其中oe3和oe28(黑色柱)表示過表達circrnapsy1-circ1的紅色果實株系，oe21和oe26(灰色柱)表示過表達circrnapsy1-circ1的黃色果實株系。圖8示出不同轉(zhuǎn)基因株系中psy1-circ1的表達模式，其中oe3和oe28(黑色柱)為紅色果實株系，oe21和oe26(灰色柱)為黃色果實株系。圖9示出轉(zhuǎn)基因番茄果實的顏色變化表現(xiàn)在多個水平，其中a1、a2和a3為同一株系有多種顏色的果實；b為同一果穗中含不同顏色果實；c1和c2為同一個果實含不同顏色區(qū)域。圖10示出轉(zhuǎn)基因番茄果實的顏色，其中oe3、oe28為紅色果實株系；oe21、oe26為黃色果實株系。圖11示出psy1-circ1轉(zhuǎn)基因番茄中番茄紅素和β-胡蘿卜素的含量分析(初提物)，其中oe3、oe4和oe28(黑色柱)為紅色果實株系，oe5、oe21和oe26(灰色柱)為黃色果實株系。具體實施方式下面對本發(fā)明的具體實施方案作進一步清楚和完整的描述。需要理解的是，本文中具體描述的實施方案僅用于示例目的，無意于以任何方式對本發(fā)明的保護范圍進行限制。在不背離本發(fā)明的精神和宗旨的情況下，可以對本發(fā)明進行修改。本發(fā)明的保護范圍由隨附的權(quán)利要求書來進行限定。如上所述，當前對circrna的研究非常有限，基本都是對該類rna的生物信息學(xué)和分子生物學(xué)方面的鑒定，而且主要集中在人和動物中，植物中非常少，目前只有擬南芥、水稻和番茄中的circrna有相關(guān)鑒定。另外，circrna的功能研究目前剛起步，且植物領(lǐng)域內(nèi)基本無相關(guān)報道。因此，對植物circrna的鑒定和生物學(xué)功能進行研究意義非常重大。另外，如前文所述，類胡蘿卜素例如番茄紅素是植物花色素的重要組成部分，且具有重要的營養(yǎng)價值，對其合成調(diào)控的研究具有重要的應(yīng)用意義。綜上，植物中是否存在這樣的circrna，其對植物例如番茄中類胡蘿卜素生物合成過程中的關(guān)鍵酶例如八氫番茄紅素合成酶1(psy1)的基因表達會產(chǎn)生影響，成了本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的一個技術(shù)問題。本發(fā)明人以番茄(solanumlycopersicum)為研究對象，通過高通量測序?qū)Σ煌墒炱诘墓麑嵾M行了circrna檢測，結(jié)果在其中檢測到大量的來源于不同基因的circrna位點。在這些circrna當中，本發(fā)明人進一步對來源于psy1基因的circrna(psy1-circ1)的生物學(xué)功能進行了分析，意外地發(fā)現(xiàn)該circrna可調(diào)控例如抑制其來源基因psy1的表達，進而調(diào)控番茄紅素等類胡蘿卜素的生物合成?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種circrnapsy1-circ1，其序列示于seqidno:1。seqidno:1的序列為：agttctttgatgaggcagagaaaggcgtgacagaattgagctcagctagtagattccct^ccattcagagatatgattgaaggaatgcgtatggacttgagaaaatcgagatacaaaaacttcgacgaactatacctttattgttattatgttgctggtacggttgggttgatgagtgttccaattatgggtatcgcccctgaatcaaaggcaacaacagagagcgtatataatgctgctttggctctggggatcgcaaatcaattaactaacatactcagagatgttggagaagatgccagaagaggaagagtctacttgcctcaagatgaattagcacaggcaggtctatccgatgaagatatatttgctggaagggtgaccgataaatggagaatctttatgaagaaacaaatacatagggcaagaa。該circrnapsy1-circ1來源于psy1基因，共429個堿基，包含psy1的外顯子7和8，其第59-60位(即符號“^”所示位置)之間為反向剪接位點。過表達circrnapsy1-circ1能夠抑制八氫番茄紅素合成酶(psy1)的基因表達。由于psy1是類胡蘿卜素生物合成中的重要限速酶，因此該circrnapsy1-circ1的過表達可以影響類胡蘿卜素的生物合成，即影響植物中類胡蘿卜素的含量。另外，由于類胡蘿卜素是一種天然色素，因此在植物例如番茄中，對類胡蘿卜素例如番茄紅素的影響也會影響到果實的顏色發(fā)育。再者，相對而言，circrna更為穩(wěn)定，因此相比于其他rna，可以更好地實現(xiàn)遺傳調(diào)控。在第二方面，本發(fā)明提供了一種用于擴增本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1的引物對。在一個優(yōu)選實施方案中，所述引物對為seqidno:2和seqidno:3，或者seqidno：4和seqidno：5，其中seqidno:2的序列為：gttgggttgatgagtgttcc，seqidno:3的序列為：caagtccatacgcattcc，seqidno：4的序列為gttggagaagatgccagaag，seqidno：5的序列為ccatacgcattccttcaatc。在第三方面，本發(fā)明提供了一種表達載體，其包含本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1。在一個具體實施方案中，所述表達載體為pcambia1301載體。在第四方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)控植物八氫番茄紅素合成酶1基因(psy1)表達的方法，所述方法包括在所述植物中過表達本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1或者抑制本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1的表達。具體地，在植物中過表達circrnapsy1-circ1可以抑制或者下調(diào)八氫番茄紅素合成酶1基因的表達，抑制該circrnapsy1-circ1的表達則可以促進或者上調(diào)八氫番茄紅素1基因的表達。在一個具體實施方案中，所述植物可以是番茄。在一個具體實施方案中，所述類胡蘿卜素可以是番茄紅素和/或β-胡蘿卜素。在第五方面，本發(fā)明提供一種調(diào)控植物類胡蘿卜素含量的方法，所述方法包括通過在所述植物中過表達本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1。更具體地，在植物中過表達circrnapsy1-circ1可以抑制八氫番茄紅素合成酶1基因的表達，由此降低植物類胡蘿卜素含量。在一個具體實施方案中，所述植物可以是番茄。在一個具體實施方案中，所述類胡蘿卜素為番茄紅素和/或β-胡蘿卜素。在第六方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)控番茄果實顏色發(fā)育的方法，包括在番茄中過表達本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的那樣，番茄果實的色素成分主要是類胡蘿卜素。不同的類胡蘿卜素使番茄呈現(xiàn)不同的顏色，例如番茄紅素會使番茄果實呈現(xiàn)紅色。因此，影響類胡蘿卜素的合成途徑將導(dǎo)致番茄果實的顏色發(fā)生變化。如上所述，psy1-circ1的過表達會抑制psy1的表達，而psy1是植物類胡蘿卜素(或番茄紅素)生物合成過程中的重要限速酶。psy1的表達被抑制導(dǎo)致番茄果實中的番茄紅素含量降低，由此使番茄果實呈現(xiàn)例如黃色。簡言之，circrnapsy1-circ1的過表達可以使番茄結(jié)出黃色果實。下面參照附圖對本發(fā)明示例性實施方式進行詳細描述。對示例性實施方式的描述僅僅是出于示范目的，而絕不是對本發(fā)明及其應(yīng)用或用法的限制。實施例實施例1.circrnapsy1-circ1的生物信息學(xué)與分子生物學(xué)鑒定番茄果實中環(huán)形rna的深度測序：采用trizol(lifetechnologies)提取野生型番茄(solanumlycopersicum)品種(ailsacraig，下文簡稱ac)綠熟期(mg)、破色期(br)和紅熟期(br+6)果實的總rna，再利用dnasei(fermentas)消化，以去除殘留基因組dna。之后，利用ribo-zeromagnetickit-plantleaf(epicentre)去除核糖體rna，再利用rnaser(epicentre)于37℃處理1小時，以消化線性rna。circrna建庫用illumina公司的rnaltsampleprepkitv2，插入片段長度為120-250bp；雙向測序用hiseq2500測序儀(2*100bp)，采用100bp的雙末端讀段(晶能生物技術(shù)(上海)有限公司)，每個樣品有效數(shù)據(jù)量4gbase以上。circrna位點的提取與分析：深度測序數(shù)據(jù)去除接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，用segemehl(v.0.1.7)軟件提取反向剪接位點信息。利用rnaser耐受性實驗進行部分位點的分子生物學(xué)驗證。rnaser耐受性實驗具體如下：利用trizol(lifetechnologies)分離總rna，然后使用dnasei(fermentas)去除殘留基因組dna。在采用rnaclean&concentratorkit(zymoresearch)純化之后，將rna樣本分為兩等份，一份用rnaser(epicentre)于37℃消化1小時(r+)，另一部分做mock處理(r-，即利用水代替rnaser，其余與r+處理完全相同)。將r+rna和r-rna用隨機引物(randomhexamerprimer，fermentas)逆轉(zhuǎn)錄為cdna(m-mlvreverasetranscriptase，promega)，并用作rt-pcr鑒定的模板。利用聚合引物(用于擴增普通線性mrna)和離散引物(用于擴增circrna)分別對r+模板和r-模板(cdna)進行特異性pcr擴增(圖1)。還將基因組dna用作模板，以確保該位點不存在于基因組中。圖2示出了上述流程，以及可能的結(jié)果。從該圖中可以看出，若是circrna，則其將表現(xiàn)對rnaser的耐受性，若是線性rna，則其將表現(xiàn)出對rnaser的敏感性。結(jié)果：本發(fā)明人通過上述實驗鑒定出部分circrna，由此證明這些生物信息學(xué)方式檢測到的circrna位點的確存在。對circrnapsy1-circ1的鑒定結(jié)果示于圖3。circrnapsy1-circ1是采用離散引物seqidno:2(gttgggttgatgagtgttcc，正向引物)和seqidno:3(caagtccatacgcattcc，反向引物)進行特異性pcr擴增的，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)其序列為：agttctttgatgaggcagagaaaggcgtgacagaattgagctcagctagtagattccct^ccattcagagatatgattgaaggaatgcgtatggacttgagaaaatcgagatacaaaaacttcgacgaactatacctttattgttattatgttgctggtacggttgggttgatgagtgttccaattatgggtatcgcccctgaatcaaaggcaacaacagagagcgtatataatgctgctttggctctggggatcgcaaatcaattaactaacatactcagagatgttggagaagatgccagaagaggaagagtctacttgcctcaagatgaattagcacaggcaggtctatccgatgaagatatatttgctggaagggtgaccgataaatggagaatctttatgaagaaacaaatacatagggcaagaa。這段序列在本文中標注為seqidno:1，其中第59-60位(即符號“^”所示位置)之間為反向剪接位點。psy1-circ1共429個堿基，包含psy1的外顯子7和8。psy1是采用聚合引物seqidno:6(ttggtttgcctgtctgtg，正向引物)和seqidno:7(tgtatcggacaaagcacc，反向引物)進行特異性pcr擴增的。實施例2.circrnapsy1-circ1及其來源基因在不同成熟期番茄果實中的表達模式分析鑒定circrna的特殊引物設(shè)計(實時pcr方法)：由于選擇性環(huán)化現(xiàn)象的存在，同一個基因可產(chǎn)生多個有重疊區(qū)域的circrna，因此設(shè)計鑒定circrna的離散引物(正向引物或者反向引物)跨越反向剪接位點(引物跨過位點的3’端長度為3-6bp)，以保證擴增的特異性，具體見示意圖(圖4)。其余設(shè)計理念同普通實時pcr。由此設(shè)計理念獲得的用于實時pcr擴增circrnapsy1-circ1的引物為離散引物，其中正向引物為tcagctagtagattccctccattc(seqidno:8)，反向引物為cctttgattcaggggcgatac(seqidno:9)。另外，用于實時pcr擴增circrnapsy1-circ1的來源基因psy1的引物是聚合引物，其中正向引物為ggacaagtttcatggaatcagt(seqidno:10)，反向引物為tggagtagccaaaatagcagac(seqidno:11)。表達模式鑒定分析：提取野生型番茄(ac)綠熟期(mg)、破色期(br)和紅熟期(br+6)番茄果實的總rna，去除基因組dna殘留，之后用隨機引物(randomhexamerprimer，fermentas)將rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna，再利用實時pcr(sybrgreen)的方式分析各時期circrnapsy1-circ1及其來源基因psy1的相對表達量。該實時pcr所采用的引物如上所述。結(jié)果：對于circrnapsy1-circ1及其來源基因psy1在各時期的表達模式鑒定分析結(jié)果示于圖5中。從該圖中可以看出，circrnapsy1-circ1的表達趨勢與其來源基因psy1的表達趨勢是相類似的。具體地，從綠熟期(mg)到破色期(br)再到紅熟期(br+6)，psy1-circ1和psy1的表達量均逐漸上升。psy1-circ1的表達量在熟化期間增加表明psy1-circ1可能參與果實熟化。實施例3.circrnapsy1-circ1過表達載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化circrna過表達載體的構(gòu)建：以野生型番茄(ac)的基因組dna為模板，擴增包含待環(huán)化外顯子和側(cè)翼序列(上游281bp和下游681bp)的片段(片段a)，擴增部分下游序列(517bp，片段b)。然后將片段a和片段b以相反的方向連接并構(gòu)建到pcambia1301載體的表達框中(圖6)。該載體中片段a和片段b因部分序列互補而形成二級結(jié)構(gòu)，是促進circrna大量生成的關(guān)鍵。此外，該載體保留了待環(huán)化外顯子兩側(cè)的剪接位點和部分側(cè)翼序列，保證了精確剪接的進行。遺傳轉(zhuǎn)化：將上文制備獲得的載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(a.tumefaciens)eha105中，隨后將此經(jīng)轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌用于轉(zhuǎn)化野生型番茄(ac)，轉(zhuǎn)化方法按照子葉穿刺轉(zhuǎn)化法(rai,g.k.etal.,2012)。結(jié)果：從圖7和圖8可以看出，與對照即野生型ac相比，在轉(zhuǎn)基因番茄果實的不同時期，psy1-circ1均高度表達，這表明本發(fā)明人成功地構(gòu)建了circrnapsy1-circ1過表達載體，且成功地在番茄中過表達了circrnapsy1-circ1，說明了circrna過表達系統(tǒng)的高效性。實施例4.轉(zhuǎn)基因番茄(ac)中circrnapsy1-circ1及其來源基因psy1的表達如實施例3所述來制備本實施例所需轉(zhuǎn)基因番茄，并對處于不同時期(綠熟期(mg)、破色期(br)和紅熟期(br+6))的野生型和轉(zhuǎn)基因番茄中的circrnapsy1-circ1及其來源基因psy1的表達量進行檢測，采用實時pcr(sybrgreen)，其中所用引物如實施例2所述。不同時期的番茄果實中psy1-circ1及psy1的相對表達量結(jié)果示于圖7。圖7中的左列圖示出psy1-circ1在不同時期番茄果實中的表達情況，右列圖示出psy1在不同時期番茄果實中的表達情況。從圖中可見，在綠熟期、破色期和紅熟期，psy1在黃色果實株系(oe21和oe26)中的表達下調(diào)，但其在紅色果實株系(oe3和oe28)中的表達更高。psy-circ1在紅色果實株系和黃色果實株系之間的表達模式不同。從綠熟期到破色期再到紅熟期，psy1-circ1在黃色果實株系中的表達呈上升趨勢，并且在紅熟期，其在黃色果實株系中的表達較其在紅色果實株系中的表達豐度更高。相反，從破色期到紅熟期，psy1-circ1在紅色果實株系中的表達下降。這些結(jié)果提示，psy-circ1的高表達可能在抑制其來源mrna累積方面發(fā)揮作用。不同果實株系中的psy1-circ1及psy1的相對表達量結(jié)果示于圖8。從該圖中可以看出，從綠熟期到破色期再到紅熟期，psy1-circ1和psy1在黃色果實株系(oe21和oe26)中均呈上升的趨勢，而在兩個紅色果實株系(oe3和oe28)中，psy1-circ1在破色期后表現(xiàn)下調(diào)趨勢，psy1呈增加的趨勢。由以上結(jié)果可知，在番茄中過表達circrnapsy1-circ1影響到了其來源基因psy1的表達。更具體地，果實成熟期連續(xù)高表達circrnapsy1-circ1可抑制其來源基因psy1的表達。考慮到psy1基因是類胡蘿卜素生物合成中的關(guān)鍵酶，因此發(fā)明人進一步研究了轉(zhuǎn)基因番茄中與番茄果實顏色發(fā)育緊密相關(guān)的類胡蘿卜素番茄紅素和β-胡蘿卜素的含量是否會發(fā)生變化，參見實施例5。實施例5.轉(zhuǎn)基因番茄(ac)中番茄紅素和β-類胡蘿卜素含量分析如實施例3所述來制備本實施例所需轉(zhuǎn)基因番茄。切下番茄果實組織樣本(br+10時期)，液氮冷凍并保存在-80℃。將冷凍樣本用液氮研磨成粉末，稱取約0.2克用1.8ml提取液(丙酮：正己烷＝2：3)于室溫下提取1小時。3000rpm離心10min，取上清液置于新的離心管中。使用uv-1800分光光度計(shimadzu)測定上清液在663nm、645nm、505nm及453nm處的光密度。使用以下公式計算番茄紅素和β-胡蘿卜素的含量：番茄紅素(100mg/100ml)＝-0.0458a663+0.204a645+0.372a505-0.0806a453，β-胡蘿卜素(100mg/100ml)＝0.216a663-1.22a645-0.304a505+0.452a453(參見nagataandyamashita,1992)。psy1-circ1過表達ac番茄表現(xiàn)出不同的表型。具體地，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因ac番茄果實的顏色變化表現(xiàn)在多個水平，例如同一株系結(jié)出多種顏色的果實(參見圖9中的a1、a2和a3)，同一果穗中含不同顏色的果實(參見圖9中的b)，同一個果實含不同的顏色區(qū)域(參見圖9中的c1和c2)。此外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因ac番茄單一株系可以結(jié)出單獨的紅色或者黃色的果實。在我們的實驗中，有八個株系結(jié)出紅色果實，七個株系結(jié)出黃色果實(表1和圖10)。與果實顏色相一致，黃色轉(zhuǎn)基因果實(oe5、oe21和oe26)中的番茄紅素和β-胡蘿卜素相對于對照ac顯著下降(p<0.01)，在一些紅色轉(zhuǎn)基因果實中的含量略有下降(參見圖11)。β-胡蘿卜素含量的下降稍遜于番茄紅素含量的下降，這一結(jié)果可能是由于β-胡蘿卜素在熟化啟動之前就開始累積。簡言之，circrnapsy1-circ1在類胡蘿卜素番茄紅素和β-類胡蘿卜素的生物合成中起到負調(diào)節(jié)的作用。表1.psy1-circ1過表達株系的果實顏色(ac,t0代)果實顏色oe株系總計黃色oe5、oe8、oe11、oe19、oe21、oe23、oe267紅色oe3、oe4、oe7、oe12、oe13、oe14、oe15、oe288小結(jié)：本發(fā)明人在番茄中首次發(fā)現(xiàn)了一種來源于psy1的circrna，其被命名為psy1-circ1，該circrna可以負調(diào)控其來源基因psy1的表達。由于psy1是類胡蘿卜素生物合成中的關(guān)鍵酶基因，因此該circrna可以間接地調(diào)控番茄中類胡蘿卜素如番茄紅素和β-胡蘿卜素的含量，進而調(diào)控番茄果實的顏色發(fā)育。在本說明書中，每當提及“示例性實施方式”、“優(yōu)選實施方式”、“一個實施方式”等時意味著針對該實施方式描述的具體的特征、結(jié)構(gòu)或特點包括在本發(fā)明的至少一個實施方式中。這些用詞在本說明書中不同地方的出現(xiàn)不一定都指代同一實施方式。此外，當針對任一實施方式/實施方式描述具體的特征、結(jié)構(gòu)或特點時，應(yīng)當認為本領(lǐng)域技術(shù)人員也能夠在所有所述實施方式中的其它實施方式中實現(xiàn)這種特征、結(jié)構(gòu)或特點。以上詳細描述了本發(fā)明的實施方式。然而，本發(fā)明的方面不限于上述實施方式。在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下，各種改型和替換均可以應(yīng)用到上述實施方式中。參考文獻abe,n.,matsumoto,k.,nishihara,m.,nakano,y.,shibata,a.,maruyama,h.,shuto,s.,matsuda,a.,yoshida,m.,ito,y.,etal.(2015).rollingcircletranslationofcircularrnainlivinghumancells.scirep5,16435.alhasan,a.a.,izuogu,o.g.,al-balool,h.h.,steyn,j.s.,evans,a.,colzani,m.,ghevaert,c.,mountford,j.c.,marenah,l.,elliott,d.j.,etal.(2016).circularrnaenrichmentinplateletsisasignatureoftranscriptomedegradation.blood127,e1-e11.ashwal-fluss,r.,meyer,m.,pamudurti,n.r.,ivanov,a.,bartok,o.,hanan,m.,evantal,n.,memczak,s.,rajewsky,n.,andkadener,s.(2014).circrnabiogenesiscompeteswithpre-mrnasplicing.molecularcell56,55-56.bachmayr-heyda,a.,reiner,a.t.,auer,k.,sukhbaatar,n.,aust,s.,bachleitner-hofmann,t.,mesteri,i.,grunt,t.w.,zeillinger,r.,andpils,d.(2015).correlationofcircularrnaabundancewithproliferation-exemplifiedwithcolorectalandovariancancer,idiopathiclungfibrosis,andnormalhumantissues.scientificreports5.chen,l.-l.(2016).thebiogenesisandemergingrolesofcircularrnas.naturereviewsmolecularcellbiology.cocquerelle,c.,mascrez,b.,hetuin,d.,andbailleul,b.(1993).mis-splicingyieldscircularrnamolecules.fasebjournal:officialpublicationofthefederationofamericansocietiesforexperimentalbiology7,155-160.conn,s.j.,pillman,k.a.,toubia,j.,conn,v.m.,salmanidis,m.,phillips,c.a.,roslan,s.,schreiber,a.w.,gregory,p.a.,andgoodall,g.j.(2015).thernabindingproteinquakingregulatesformationofcircrnas.cell160,1125-1134.geng,h.h.,li,r.,su,y.m.,xiao,j.,pan,m.,cai,x.x.,andji,x.p.(2016).thecircularrnacdr1aspromotesmyocardialinfarctionbymediatingtheregulationofmir-7aonitstargetgenesexpression.plosone11,e0151753.guo,j.u.,agarwal,v.,guo,h.,andbartel,d.p.(2014).expandedidentificationandcharacterizationofmammaliancircularrnas.genomebiology15,409(401-414).hansen,t.b.,jensen,t.i.,clausen,b.h.,bramsen,j.b.,finsen,b.,damgaard,c.k.,andkjems,j.(2013).naturalrnacirclesfunctionasefficientmicrornasponges.nature495,384-388.hansen,t.b.,wiklund,e.d.,bramsen,j.b.,villadsen,s.b.,statham,a.l.,clark,s.j.,andkjems,j.(2011).mirna-dependentgenesilencinginvolvingago2-mediatedcleavageofacircularantisenserna.theembojournal30,4414-4422.ivanov,a.,memczak,s.,wyler,e.,torti,f.,porath,h.t.,orejuela,m.r.,piechotta,m.,levanon,e.y.,landthaler,m.,anddieterich,c.(2015).analysisofintronsequencesrevealshallmarksofcircularrnabiogenesisinanimals.cellreports10,170-177.jeck,w.r.,andsharpless,n.e.(2014).detectingandcharacterizingcircularrnas.naturebiotechnology32,453-461.jeck,w.r.,sorrentino,j.a.,wang,k.,slevin,m.k.,burd,c.e.,liu,j.,marzluff,w.f.,andsharpless,n.e.(2013).circularrnasareabundant,conserved,andassociatedwithalurepeats.rna(newyork,ny)19,141-157.kramer,m.c.,liang,d.,tatomer,d.c.,gold,b.,march,z.m.,cherry,s.,andwilusz,j.e.(2015).combinatorialcontrolofdrosophilacircularrnaexpressionbyintronicrepeats,hnrnps,andsrproteins.genes&development29,2168-2182.lasda,e.,andparker,r.(2014).circularrnas:diversityofformandfunction.rna(newyork,ny)20,1829-1842.lasda,e.,andparker,r.(2016).circularrnasco-precipitatewithextracellularvesicles:apossiblemechanismforcircrnaclearance.plosone11,e0148407.legnini,i.,ditimoteo,g.,rossi,f.,morlando,m.,briganti,f.,sthandier,o.,fatica,a.,santini,t.,andronache,a.,wade,m.,etal.(2017).circ-znf609isacircularrnathatcanbetranslatedandfunctionsinmyogenesis.molcell66.li,y.,zheng,q.,bao,c.,li,s.,guo,w.,zhao,j.,chen,d.,gu,j.,he,x.,andhuang,s.(2015a).circularrnaisenrichedandstableinexosomes:apromisingbiomarkerforcancerdiagnosis.cellres25,981-984.li,z.,huang,c.,bao,c.,chen,l.,lin,m.,wang,x.,zhong,g.,yu,b.,hu,w.,anddai,l.(2015b).exon-introncircularrnasregulatetranscriptioninthenucleus.naturestructural&molecularbiology22,256-264.liang,d.,andwilusz,j.e.(2014).shortintronicrepeatsequencesfacilitatecircularrnaproduction.genes&development28,2233-2247.lu,t.,cui,l.,zhou,y.,zhu,c.,fan,d.,gong,h.,zhao,q.,zhou,c.,zhao,y.,lu,d.,etal.(2015).transcriptome-wideinvestigationofcircularrnasinrice.rna(newyork,ny).memczak,s.,jens,m.,elefsinioti,a.,torti,f.,krueger,j.,rybak,a.,maier,l.,mackowiak,s.d.,gregersen,l.h.,munschauer,m.,etal.(2013).circularrnasarealargeclassofanimalrnaswithregulatorypotency.nature495,333-338.nagata,m.,andyamashita,i.(1992).simplemethodforsimultaneousdeterminationofchlorophyllandcarotenoidsintomatofruit.japanesesocietyforfoodscienceandtechnology39,925-928.nigro,j.m.,cho,k.r.,fearon,e.r.,kern,s.e.,ruppert,j.m.,oliner,j.d.,kinzler,k.w.,andvogelstein,b.(1991).scrambledexons.cell64,607-613.pamudurti,n.r.,bartok,o.,jens,m.,ashwal-fluss,r.,stottmeister,c.,ruhe,l.,hanan,m.,wyler,e.,perez-hernandez,d.,ramberger,e.,etal.(2017).translationofcircrnas.molcell66,9-21.pasman,z.,been,m.d.,andgarcia-blanco,m.a.(1996).exoncircularizationinmammaliannuclearextracts.rna(newyork,ny)2,603-610.rai,g.k.etal.effectsofexplantage,germinationmedium,pre-cultureparameters,inoculationmedium,ph,washingmedium,andselectionregimeonagrobacterium-mediatedtransformationoftomato.invitrocell.dev.biol.plant48,565-578(2012).rybak-wolf,a.,stottmeister,c.,glazar,p.,jens,m.,pino,n.,giusti,s.,hanan,m.,behm,m.,bartok,o.,ashwal-fluss,r.,etal.(2015).circularrnasinthemammalianbrainarehighlyabundant,conserved,anddynamicallyexpressed.molecularcell58,870-885.salzman,j.(2016).circularrnaexpression:itspotentialregulationandfunction.trendsgenet32,309-316.salzman,j.,chen,r.e.,olsen,m.n.,wang,p.l.,andbrown,p.o.(2013).cell-typespecificfeaturesofcircularrnaexpression.plosgenetics9,e1003777.salzman,j.,gawad,c.,wang,p.l.,lacayo,n.,andbrown,p.o.(2012).circularrnasarethepredominanttranscriptisoformfromhundredsofhumangenesindiversecelltypes.plosone7,e30733.szabo,l.,morey,r.,palpant,n.j.,wang,p.l.,afari,n.,jiang,c.,parast,m.m.,murry,c.e.,laurent,l.c.,andsalzman,j.(2015).statisticallybasedsplicingdetectionrevealsneuralenrichmentandtissue-specificinductionofcircularrnaduringhumanfetaldevelopment.genomebiology16,126.veno,m.t.,hansen,t.b.,veno,s.t.,clausen,b.h.,grebing,m.,finsen,b.,holm,i.e.,andkjems,j.(2015).spatio-temporalregulationofcircularrnaexpressionduringporcineembryonicbraindevelopment.genomebiology16,245.wang,k.,long,b.,liu,f.,wang,j.-x.,liu,c.-y.,zhao,b.,zhou,l.-y.,sun,t.,wang,m.,andyu,t.(2016).acircularrnaprotectstheheartfrompathologicalhypertrophyandheartfailurebytargetingmir-223.europeanheartjournal,ehv713.wang,p.l.,bao,y.,yee,m.c.,barrett,s.p.,hogan,g.j.,olsen,m.n.,dinneny,j.r.,brown,p.o.,andsalzman,j.(2014).circularrnaisexpressedacrosstheeukaryotictreeoflife.plosone9,e90859.wang,y.,andwang,z.(2015).efficientbacksplicingproducestranslatablecircularmrnas.rna(newyork,ny)21,172-179.westholm,j.o.,miura,p.,olson,s.,shenker,s.,joseph,b.,sanfilippo,p.,celniker,s.e.,graveley,b.r.,andlai,e.c.(2014).genome-wideanalysisof<i>drosophila</i>circularrnasrevealstheirstructuralandsequencepropertiesandage-dependentneuralaccumulation.cellreports9,1966-1980.yang,y.,fan,x.,mao,m.,song,x.,wu,p.,zhang,y.,jin,y.,yang,y.,chen,l.,wang,y.,etal.(2017).extensivetranslationofcircularrnasdrivenbyn6-methyladenosine.cellres27,626-641.ye,c.y.,chen,l.,liu,c.,zhu,q.h.,andfan,l.(2015).widespreadnoncodingcircularrnasinplants.newphytologist208,88-95.zhang,x.o.,wang,h.b.,zhang,y.,lu,x.,chen,l.l.,andyang,l.(2014).complementarysequence-mediatedexoncircularization.cell159,134-147.zheng,q.,bao,c.,guo,w.,li,s.,chen,j.,chen,b.,luo,y.,lyu,d.,li,y.,shi,g.,etal.(2016).circularrnaprofilingrevealsanabundantcirchipk3thatregulatescellgrowthbyspongingmultiplemirnas.natcommun7,11215.zuo,j.,wang,q.,zhu,b.,luo,y.,andgao,l.(2016).decipheringtherolesofcircrnasonchillinginjuryintomato.biochemicalandbiophysicalresearchcommunications。序列表<110>浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所<120>一個參與番茄紅素生物合成的circrnapsy1-circ1<130>cp20170505<160>11<170>patentinversion3.5<210>1<211>429<212>dna<213>番茄（solanumlycopersicum）<400>1agttctttgatgaggcagagaaaggcgtgacagaattgagctcagctagtagattccctc60cattcagagatatgattgaaggaatgcgtatggacttgagaaaatcgagatacaaaaact120tcgacgaactatacctttattgttattatgttgctggtacggttgggttgatgagtgttc180caattatgggtatcgcccctgaatcaaaggcaacaacagagagcgtatataatgctgctt240tggctctggggatcgcaaatcaattaactaacatactcagagatgttggagaagatgcca300gaagaggaagagtctacttgcctcaagatgaattagcacaggcaggtctatccgatgaag360atatatttgctggaagggtgaccgataaatggagaatctttatgaagaaacaaatacata420gggcaagaa429<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2gttgggttgatgagtgttcc20<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3caagtccatacgcattcc18<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4gttggagaagatgccagaag20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5ccatacgcattccttcaatc20<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列<400>6ttggtttgcctgtctgtg18<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列<400>7tgtatcggacaaagcacc18<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列<400>8tcagctagtagattccctccattc24<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9cctttgattcaggggcgatac21<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列<400>10ggacaagtttcatggaatcagt22<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列<400>11tggagtagccaaaatagcagac22當前第1頁12當前第1頁12