本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物活性成分技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種五味子酸性多糖及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

五味子系木蘭科植物五味子的成熟果實(shí)，是國(guó)家中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)基地的五大品種之一，特別是北五味子，是五味子中的極品，具有斂肺滋陰，生津止瀉，寧心安神等功效，已經(jīng)被列入國(guó)家藥典和保健食品可用原料的名單。

氧化還原反應(yīng)是機(jī)體應(yīng)答內(nèi)外環(huán)境的重要生命過(guò)程。自由基和自由基反應(yīng)遍及于所有的生命系統(tǒng),其產(chǎn)生、淬滅、利用和損傷作用是生命活動(dòng)過(guò)程中幾乎同時(shí)進(jìn)行的對(duì)立統(tǒng)一過(guò)程。機(jī)體的內(nèi)環(huán)境通過(guò)各種各樣的氧化性物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)及其有關(guān)酶系統(tǒng)的綜合作用,使氧化損傷-抗氧化防御間維持于一個(gè)相對(duì)恒定的氧化還原狀態(tài)。當(dāng)抗氧化防御系統(tǒng)處于不平衡狀態(tài)時(shí)，就不能將自由基清除干凈，自由基不斷在體內(nèi)堆積，過(guò)多的自由基將會(huì)攻擊體內(nèi)的生物大分子，對(duì)細(xì)胞、組織及器官造成永久性的損傷，使其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生老化，引起感染以及各種退行性疾病。而腦組織是高耗氧器官，腦細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生較多活性氧自由基，隨著時(shí)間的積累，氧化產(chǎn)物的增多，清除機(jī)制有限，導(dǎo)致腦老化，引起氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致大腦退行性改變。

近年來(lái)，我國(guó)逐漸步入老齡化社會(huì)，由機(jī)體氧化所致神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率亦呈逐年上升趨勢(shì)，但是雖然對(duì)該病的治療研究和臨床經(jīng)驗(yàn)逐漸增多，但目前尚無(wú)理想的防治藥物，因此尋找具有提高機(jī)體抗氧化能力的藥物意義重大。

人類記憶障礙是一個(gè)重要的醫(yī)學(xué)和心理學(xué)問(wèn)題。這種現(xiàn)象在人類各個(gè)年齡段均有發(fā)生，包括青少年記憶障礙以及老年人癡呆癥等。尤其值得注意的是我國(guó)已經(jīng)步入老齡化國(guó)家行列，老年人口大多承受著記憶減退的痛苦，以記憶障礙為重要特征的阿爾茨海默病已成為老年人群中繼心臟病、腫瘤和中風(fēng)之后的第四大致死疾病。因此，開發(fā)研制出安全、有效具有改善記憶功能的中藥保健食品具有重大意義。

并且，近年來(lái)，在社會(huì)經(jīng)濟(jì)迅速發(fā)展下，一方面人們生活水平不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，高脂肪高膽固醇飲食的攝入比例不斷增加；另一方面，人們生活節(jié)奏不斷變快，作息時(shí)間越來(lái)越不規(guī)律，疏于運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致我國(guó)糖尿病的患病率逐年提高。糖尿病作為一種慢性病，治療周期長(zhǎng)，容易引發(fā)多種并發(fā)癥和病情反復(fù)等特點(diǎn)。糖尿病分為ⅰ型糖尿病，ⅱ型糖尿病?，F(xiàn)有的降血糖藥物，比如羅格列酮，阿卡波糖，胰島素，格列本脲等，均具有不同程度的副作用，并且不能從根本上改善胰腺功能。

同時(shí)，隨著人們生活水平的不斷提高，國(guó)民人均攝入酒量也在增長(zhǎng)。長(zhǎng)期飲酒容易引起酒精性肝病，嚴(yán)重危害身體健康。酒精性肝損傷是由于大量飲酒所致的肝臟疾病，其發(fā)病率高，后果嚴(yán)重，加之酒精中毒對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)的影響，使酒精性肝損傷已經(jīng)成為一種嚴(yán)重危害人民健康的疾病。近年來(lái)我國(guó)隨著生活條件的改變，酗酒呈增多趨勢(shì)，由酒精所致肝損害的發(fā)病率亦呈逐年上升趨勢(shì)，但是雖然對(duì)該病的治療研究和臨床經(jīng)驗(yàn)逐漸增多，但目前除戒酒和支持治療外尚無(wú)理想的防治藥物，因此尋找對(duì)酒精性肝損傷有保護(hù)作用的藥物意義重大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，有必要針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種五味子酸性多糖，該五味子酸性多糖具有抗氧化損傷、改善學(xué)習(xí)記憶、降血糖及治療肝損傷的作用。

一種五味子酸性多糖的制備方法，包括以下步驟：

五味子多糖提取：取五味子，加入水作為提取溶劑，在80-100℃下提取1-8hr，得提取液，將所述提取液濃縮至加入量的1/3-1/7,去除沉淀，得上清液，于所述上清液中加入乙醇，使上清液中乙醇的體積百分濃度為70-80％，靜置，收集沉淀，即得五味子多糖；

五味子酸性多糖提?。喝∷鑫逦蹲佣嗵牵詃eae-纖維素為固定相，以濃度為0-1mol/l的氯化鈉水溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行洗脫，分離純化得到五味子酸性多糖。

通過(guò)上述方法制備得到的五味子酸性多糖具有抗氧化損傷、改善學(xué)習(xí)記憶、降血糖及治療肝損傷的作用。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述五味子酸性多糖提取步驟中，分離純化得到五味子酸性多糖的具體方法為：取所述五味子多糖，溶于水中，上樣于cl-型deae-纖維素離子交換層析柱，先用蒸餾水洗脫，棄去洗脫液，再用濃度為0.05-1mol/l的nacl水溶液梯度洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，即得五味子酸性多糖scp-a。以上述方法制備得到的五味子酸性多糖，具有較好的活性。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，該制備方法還包括五味子酸性多糖分離純化步驟，所述五味子酸性多糖分離純化步驟為：取所述五味子酸性多糖，以cl-型deae-纖維素為固定相，先用蒸餾水洗脫，棄去洗脫液，再分別用0.08-0.12mol/l、0.18-0.22mol/l、0.28-0.32mol/l、0.48-0.52mol/l的氯化鈉水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，分別制備得到五味子酸性多糖scp-a-1、五味子酸性多糖scp-a-2、五味子酸性多糖scp-a-3和五味子酸性多糖scp-a-4。采用上述方法對(duì)五味子酸性多糖進(jìn)行細(xì)分純化，針對(duì)不同的應(yīng)用，提高了所述五味子多糖的有效性。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述五味子酸性多糖分離純化步驟中，取5mg所述五味子酸性糖，溶于1ml蒸餾水中，上平衡好的柱體積為20ml的cl-型deae-纖維素離子交換層析柱，先用40ml蒸餾水洗脫，棄去洗脫液，再分別用用0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l、0.5mol/l的氯化鈉水溶液nacl水溶液各20ml進(jìn)行線形梯度洗脫，流速1ml/min，分別收集洗脫液，回收溶劑，即分別制備得到五味子酸性多糖scp-a-1、五味子酸性多糖scp-a-2、五味子酸性多糖scp-a-3和五味子酸性多糖scp-a-4。

一個(gè)實(shí)施例中，所述五味子多糖提取中，取五味子，按照每克五味子加入5-8ml水的量加入提取溶劑水，在90-100℃下提取4-6hr，得提取液，將所述提取液在70-90℃下濃縮至加入量的1/4-1/6,去除沉淀，得上清液，于所述上清液中加入體積百分濃度為90-95％的乙醇溶液，使上清液中乙醇的體積百分濃度為70-80％，靜置，收集沉淀，所述沉淀依次用體積百分濃度為95％、100％的乙醇溶液洗滌，干燥，即得五味子多糖；

本法明還公開了上述的五味子酸性多糖的制備方法制備得到的五味子酸性多糖。

該五味子酸性多糖具有抗氧化損傷、改善學(xué)習(xí)記憶、降血糖及治療肝損傷的作用。

本法明還公開了上述的五味子酸性多糖在制備用于抗氧化、改善記憶力、降血糖和/或抗肝損傷的藥物或保健品中的應(yīng)用。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，以上述的制備方法制備得到五味子酸性多糖scp-a-1、五味子酸性多糖scp-a-2、五味子酸性多糖scp-a-3和五味子酸性多糖scp-a-4；

其中，當(dāng)所述五味子酸性多糖在制備用于抗氧化的藥物或保健品時(shí)，所述五味子酸性多糖為酸性多糖scp-a-1；

當(dāng)所述五味子酸性多糖在制備用于改善記憶力的藥物或保健品時(shí)，所述五味子酸性多糖為酸性多糖scp-a-2；

當(dāng)所述五味子酸性多糖在制備用于降血糖的藥物或保健品時(shí)，所述五味子酸性多糖為酸性多糖scp-a-3；

當(dāng)所述五味子酸性多糖在制備用于抗肝損傷的藥物或保健品時(shí)，所述五味子酸性多糖為酸性多糖scp-a-1。

針對(duì)不用的應(yīng)用，選用不同細(xì)分成分的五味子酸性多糖，更具針對(duì)性，具有較好的效果。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述藥物或保健品的劑型為片劑、顆粒劑、硬膠囊、軟膠囊、口服液、粉劑、合劑、丸劑或滴丸。

上述劑型均可采用常規(guī)輔料和制劑工藝制備得到。

本法明還公開了一種藥物組合物，包括作為活性成分的上述的五味子酸性多糖，以及藥學(xué)上可接受的載體或輔料。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明的五味子酸性多糖的制備方法，具有步驟簡(jiǎn)化、工藝簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，可用作工業(yè)生產(chǎn)使用。且采用該制備方法制備得到的五味子酸性多糖，具有抗氧化損傷、改善學(xué)習(xí)記憶、降血糖及治療肝損傷的作用。

并且，該制備方法還進(jìn)行了進(jìn)一步的細(xì)化，將五味子酸性多糖分離純化得到五味子酸性多糖scp-a-1、五味子酸性多糖scp-a-2、五味子酸性多糖scp-a-3和五味子酸性多糖scp-a-4，針對(duì)不用的應(yīng)用，更有針對(duì)性，具有最佳的效果。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例2中不同五味子酸性多糖對(duì)亞油酸自氧化體系抑制結(jié)果示意圖；

圖2為實(shí)施例2中不同五味子酸性多糖的還原能力示意圖。

具體實(shí)施方式

為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實(shí)施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來(lái)實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。

除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說(shuō)明書中所使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。

實(shí)施例1

五味子酸性多糖，通過(guò)以下方法制備得到：

一、五味子多糖提取。

取五味子1.5kg，加入蒸餾水10l(即料液比為1:6.7)，浸泡過(guò)夜，煮沸(約100℃)5h，得提取液，提取液在80℃下濃縮至2l，離心(4500rpm，15min)，棄去沉淀，得上清液。向上清液加入體積百分濃度為95％的乙醇溶液，使上清液中乙醇終濃度為75％，靜置沉淀過(guò)夜，離心(4500rpm，15min)，收集沉淀。沉淀依次用95％乙醇和無(wú)水乙醇洗滌，常規(guī)干燥，得粉末狀五味子多糖。

二、五味子酸性多糖。

1、分離純化。

取所述五味子多糖，以deae-纖維素(購(gòu)自：whatman公司型號(hào)de-52)為固定相，以濃度為0-1mol/l的氯化鈉水溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行洗脫，具體方法如下：

取5mg五味子多糖，溶于1ml蒸餾水中，上平衡好的deae-纖維素離子交換層析柱(20ml，cl-型)，首先用40ml蒸餾水洗脫，即得五味子中性糖scp-n。再0.5mol/l的氯化鈉水溶液80ml進(jìn)行洗脫，流速1ml/min，收集洗脫液，回收溶劑，即制備得到五味子酸性多糖scp-a。以苯酚-硫酸法檢測(cè)洗脫液中糖含量，間羥基聯(lián)苯法測(cè)定洗脫液中糖醛酸含量。

結(jié)果顯示，蒸餾水能將大部分五味子中性多糖scp-n從deae-纖維素柱上洗脫下來(lái)，0.5mnacl能將大部分五味子酸性多糖scp-a洗脫下來(lái)。

所以通過(guò)離子交換柱層析可以大量制備出五味子中性糖scp-n和酸性糖scp-a。

2、成分分析。

2.1、苯酚-硫酸法測(cè)定糖含量。

采用苯酚-硫酸法進(jìn)行糖含量測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：用移液管量取0.1g/l標(biāo)準(zhǔn)glc(葡萄糖)溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml轉(zhuǎn)于玻璃試管中，加蒸餾水補(bǔ)至1.0ml，每個(gè)濃度重復(fù)三次，分別向每支試管中加入6％的苯酚試劑0.5ml，濃硫酸2.5ml，迅速振蕩均勻，冷卻至室溫，在λ為490nm處測(cè)定吸光度a。以吸收度a為縱坐標(biāo)，糖含量c為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線a＝kc。

樣品中糖含量測(cè)定：取濃度0.1g/l左右的樣品溶液1ml，加入苯酚試劑0.5ml，濃硫酸2.5ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法之操作，測(cè)定吸收度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品吸光值計(jì)算含量。

2.2、間羥基聯(lián)苯法測(cè)定糖醛酸含量測(cè)定。

間羥基聯(lián)苯試劑：稱取30mg間羥基聯(lián)苯，溶于0.5％氫氧化鈉水溶液中，并定容至10ml，4℃避光保存。

飽和氫氧化鉀：稱取5g氫氧化鉀，加入2ml蒸餾水，充分?jǐn)嚢枞芙?，上部清液即為飽和氫氧化鉀?/p>

氨基磺酸試劑：稱取3.9g氨基磺酸，加蒸餾水5ml，滴加飽和氫氧化鉀水溶液，充分振蕩至氨基磺酸完全溶解，冷卻至室溫，再繼續(xù)滴加飽和氫氧化鉀水溶液至ph2.5，用蒸餾水將體積補(bǔ)充至10ml，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

0.1g/ld-gala標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取10mgd-gala(d-半乳糖醛)，溶解于蒸餾水中，并定容至100ml。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：移液器分別量取0.1g/ld-gala標(biāo)準(zhǔn)溶液0μl、50μl、100μl、200μl、300μl、400μl轉(zhuǎn)于玻璃試管中，加蒸餾水補(bǔ)至400μl，每個(gè)濃度重復(fù)三個(gè)樣品。向每支試管中加入氨基磺酸試劑40μl，搖勻，再向各管加入濃硫酸2.5ml，振蕩均勻，沸水浴煮沸20min。冷卻至室溫后，向各管中加入間羥基聯(lián)苯試劑40μl，搖勻，室溫放置15min。在λ525nm處測(cè)定吸光度a。以吸收度a為縱坐標(biāo)，d-半乳糖醛含量(μg)c為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線a＝kc。

樣品中糖醛酸含量測(cè)定：取樣品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法之操作，測(cè)定吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品濃度計(jì)算其中的糖醛酸含量。

2.3、考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)。

考馬斯亮藍(lán)試劑：稱取考馬斯亮藍(lán)10mg，溶解于5ml的95％乙醇中，加入10ml的85％磷酸，用蒸餾水稀釋至100ml，濾紙過(guò)濾備用。最終試劑中含0.01％考馬斯亮藍(lán)g-250(w/v)，4.7％乙醇(w/v)。

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：儲(chǔ)備液5mg/ml牛血清白蛋白，用時(shí)加水稀釋至50μg/ml。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：移液管分別量取50μg/ml蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml轉(zhuǎn)入玻璃試管中，加蒸餾水補(bǔ)至1.0ml，每個(gè)濃度三個(gè)重復(fù)，分別向每支試管中加入考馬斯亮藍(lán)試劑4ml，迅速振蕩均勻，靜置5min后在λ595nm處測(cè)定吸光度a。以吸收度a為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白含量c(μg)為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線a＝kc。

樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：取濃度0.1g/l左右的樣品溶液1ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法之操作，測(cè)定吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品濃度計(jì)算其中的蛋白質(zhì)含量。

2.4、單糖組成分析。

稱取多糖樣品2mg，加入含有1m鹽酸的無(wú)水甲醇溶液1ml，充n2封管，80℃水解16小時(shí)，空氣泵吹干后，加入2m三氟乙酸1ml，120℃水解1小時(shí)，加入少量乙醇，60℃水浴干燥，重復(fù)3～5次，完全蒸除三氟乙酸。

向完全酸水解后獲得的干燥樣品中加入pmp試劑(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)0.5ml和0.3m的naoh溶液0.5ml，待樣品充分溶解后取其中的0.1ml于小離心管中，70℃水浴30min。10000rpm離心5min后，加入0.3m鹽酸溶液0.05ml和蒸餾水0.05ml，充分混勻。加入1ml三氯甲烷，混勻后抽提剩余的pmp試劑，吸去三氯甲烷層，保留水層。用0.22μm濾膜過(guò)濾后，加入適量蒸餾水稀釋后，待hplc檢測(cè)。

采用shimadzuhplc系統(tǒng)(lc-10atvp泵和spd-10avd紫外光檢測(cè)器)，dikmainertsilods-3色譜柱(4.6×150mm)，流動(dòng)相為pbs(0.1m,ph7.0-乙腈82:18(v/v)，流速為1.0ml/min，進(jìn)樣量為20μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為245nm。

3、成分分析結(jié)果。

采用上述分析方法對(duì)制備得到的五味子酸性多糖進(jìn)行分析，經(jīng)過(guò)理化性質(zhì)分析和單糖組成分析，結(jié)果如下表所示。

表1.單糖組成分析

*得率是指所得scp-n或scp-a的質(zhì)量相對(duì)于層析上樣質(zhì)量的比值。

從上述結(jié)果中可以看出，從五味子多糖中可分離得到五味子中性多糖scp-n和五味子酸性多糖scp-a，其中五味子中性多糖scp-n的得率為47.00％,酸性糖scp-a的得率為27.00％；而中性糖主要由glc組成，酸性糖主要由gala和clc組成。

三、五味子酸性多糖分離純化。

取所述五味子酸性多糖scp-a，以deae-纖維素為固定相，分別以濃度為0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l和0.5mol/l的氯化鈉水溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行洗脫，具體方法如下：

取5mg五味子多糖，溶于1ml蒸餾水中，上平衡好的deae-纖維素離子交換層析柱(20ml，cl-型)，首先用40ml蒸餾水洗脫，再分別用0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l、0.5mol/l的氯化鈉水溶液nacl水溶液各20ml進(jìn)行梯度洗脫，流速1ml/min，分別收集洗脫液，回收溶劑，即分別制備得到五味子酸性多糖scp-a-1、五味子酸性多糖scp-a-2、五味子酸性多糖scp-a-3和五味子酸性多糖scp-a-4，苯酚-硫酸法檢測(cè)洗脫液中糖含量，間羥基聯(lián)苯法測(cè)定洗脫液中糖醛酸含量。

結(jié)果顯示，用0.1mnacl、0.2mnacl、0.3mnacl和0.5mnacl能將酸性糖scp-a分為四個(gè)級(jí)分洗脫下來(lái)。說(shuō)明可以通過(guò)離子交換柱層析，大量制備出五味子酸性糖scp-a-1、scp-a-2、scp-a-3和scp-a-4四個(gè)級(jí)分。即分別制備得到五味子酸性多糖scp-a-1、五味子酸性多糖scp-a-2、五味子酸性多糖scp-a-3和五味子酸性多糖scp-a-4。

2、成分分析。

采用上述分析方法對(duì)制備得到的四種五味子酸性多糖進(jìn)行分析，經(jīng)過(guò)理化性質(zhì)分析和單糖組成分析，結(jié)果如下表所示。

表2四種酸性多糖的成分分析

*得率是指所得不同成分的質(zhì)量相對(duì)于層析上樣質(zhì)量的比值。

實(shí)施例2

體外抗氧化實(shí)驗(yàn)。

1、五味子多糖對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制能力的研究。

1.1、方法。

依據(jù)亞油酸-硫氰酸鐵法，對(duì)五味子酸性多糖scp-a-1、scp-a-2和scp-a-3進(jìn)行抗氧化活性的研究，具體如下：

配置50ml亞油酸乳狀液(310μl亞油酸、350mg吐溫20與0.04mol.l-1.ph＝7.0的磷酸鹽緩沖液配置成50ml)。往200μl配置好的5mm的不同五味子多糖(scp-a-1、scp-a-2和scp-a-3)以及同等濃度的陽(yáng)性對(duì)照ve(維生素e)，空白對(duì)照蒸餾水中，加入2.5ml亞油酸乳狀液混合。

之后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。每隔12h對(duì)培養(yǎng)的所有組的供試液進(jìn)行取樣，每次200μl，加入2.5ml的乙醇中(75％)，之后加入300μl的硫氰酸銨(30％)，充分混勻后，加入300μl的氯化亞鐵溶液(2g氯化亞鐵溶于50ml的3.5％hcl中)。之反應(yīng)3min后在500nm處測(cè)量其吸光度值。

1.2、結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1和表3所示。

表3五味子多糖對(duì)亞油酸自氧化體系抑制結(jié)果(n＝3)

通過(guò)上述空白對(duì)照組的吸光度曲線可以得知，亞油酸體系的自氧化十分迅速，在體系中添加了3種五味子多糖及維生素e可以有效抑制亞油酸的自氧化。wscpa-1對(duì)亞油酸氧化體系的抑制顯著強(qiáng)于維生素e，而陽(yáng)性對(duì)照維生素e的吸光值小于wscpa-1，說(shuō)明wscpa-1對(duì)亞油酸體系的氧化抑制率強(qiáng)于維生素e。

2、五味子多糖還原活性實(shí)驗(yàn)。

2.1、方法。

采用oyaizu法進(jìn)行五味子酸性多糖scp-a-1、scp-a-2和scp-a-3的還原活性的測(cè)定，取上步配置好的不同五味子多糖(scp-a-1、scp-a-2和scp-a-3)待測(cè)液，加入0.2mol.l^-1、ph值6.6的磷酸鈉緩沖液1.0ml及1％的鐵氰化鉀1.0ml，于50℃水浴中反應(yīng)20min后急速冷卻；加入10％的三氯乙酸1.0ml,3000r.min-1離心10min；取上清液2ml,加入蒸餾水2ml，0.1％三氯化鐵溶液0.5ml；10min后于700nm測(cè)定其吸光值。

2.2、結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2和表4所示。

表4五味子酸性多糖的還原能力(n＝3)

從上述結(jié)果中可以看出，3種多糖都具有還原能力，吸光度隨著多糖濃度的增加有顯著的增加，而wscpa-1的還原能力要強(qiáng)于維生素e，表明wscpa-1具有最佳的抗氧化能力。

實(shí)施例3

改善學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)。

1、避暗實(shí)驗(yàn)。

1.1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

健康icr雄性小鼠，體重20±2g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)為scxk-(吉)2016-0005，分籠后放于安靜、溫濕度適宜、通風(fēng)良好的環(huán)境中，自由飲水，合理攝食，適應(yīng)所處環(huán)境7天后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2、實(shí)驗(yàn)方法。

將icr雄性小鼠隨機(jī)分組，正常對(duì)照組(con,灌胃給予蒸餾水)、模型組(mod,灌胃給予蒸餾水，腹腔注射東莨菪堿5mg/kg)、五味子酸性多糖組(scp-a,10mg/kg)、五味子酸性多糖scp-a-1組(scp-a-1,10mg/kg)、五味子酸性多糖scp-a-2組(scp-a-2,10mg/kg)、五味子酸性多糖scp-a-3組(scp-a-3,10mg/kg)，每組15只。給藥劑量為0.1ml/10g，每日一次。小鼠進(jìn)行為期30天的連續(xù)灌胃給藥，于末次給藥30min后進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

于灌胃第29天及第30天開始進(jìn)行避暗試驗(yàn)。第29天開始訓(xùn)練，在訓(xùn)練前30min進(jìn)行灌胃給藥，灌胃給藥20min后，空白對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水，模型組和其它各組小鼠腹腔注射5mg/kg氫溴酸東莨菪堿。腹腔注射10min后，將小鼠放入避暗儀中面部背向洞口放入明室，同時(shí)啟動(dòng)計(jì)時(shí)器。以小鼠進(jìn)入洞口到達(dá)暗室受到錯(cuò)誤時(shí)計(jì)時(shí)器記錄的時(shí)間即為潛伏期。本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠訓(xùn)練5min，并記錄在5min內(nèi)小鼠的錯(cuò)誤次數(shù)。于灌胃給藥第30天進(jìn)行第二次試驗(yàn)，給藥方法同第29天。記錄每只鼠的潛伏期以及在5min內(nèi)出現(xiàn)的錯(cuò)誤次數(shù)。

1.3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示。

表5.各組小鼠避暗試驗(yàn)結(jié)果(n＝15)

注：與空白組比較，*p<0.05，**p<0.01；與模型組比較，#p<0.05，##p<0.01；

從上述結(jié)果中可以看出，與空白組比較，模型組小鼠潛伏期明顯縮短(p<0.01)，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加(p<0.05)，表明造模成功。與模型組相比，scp-a-2組小鼠避暗潛伏期明顯延長(zhǎng)(p<0.01)，scp-a-2組的小鼠錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(p<0.05)，提示scp-a-2組具有最佳的改善小鼠記憶作用。

2、水迷宮實(shí)驗(yàn)。

2.1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

健康icr雄性小鼠，體重20±2g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)為scxk-(吉)2016-0005，分籠后放于安靜、溫濕度適宜、通風(fēng)良好的環(huán)境中，自由飲水，合理攝食，適應(yīng)所處環(huán)境7天后開始實(shí)驗(yàn)。

2.2、實(shí)驗(yàn)方法。

將icr雄性小鼠隨機(jī)分為5組，正常對(duì)照組(con,灌胃給予蒸餾水)、模型組(mod,灌胃給予蒸餾水，腹腔注射東莨菪堿5mg/kg)、五味子酸性多糖組(scp-a,10mg/kg)、五味子酸性多糖scp-a-1組(scp-a-1,10mg/kg)、五味子酸性多糖scp-a-2組(scp-a-2,10mg/kg)、五味子酸性多糖scp-a-3組(scp-a-3,10mg/kg)，每組15只。給藥劑量為0.1ml/10g，每日一次。小鼠進(jìn)行為期30天的連續(xù)灌胃給藥，于末次給藥30min后進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

于灌胃給藥第25天進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)，在訓(xùn)練前30min進(jìn)行灌胃給藥,灌胃給藥20min后，空白對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水，對(duì)模型組和其它各組小鼠進(jìn)行腹腔注射東莨菪堿5mg/kg。腹腔注射10min后，將小鼠放在morris水迷宮視頻跟蹤測(cè)試系統(tǒng)wmt-100中，設(shè)置小鼠的訓(xùn)練時(shí)間設(shè)定為120s，在120s內(nèi)未達(dá)到終點(diǎn)的小鼠按120s記錄。第一次實(shí)驗(yàn)之前將小鼠放在平臺(tái)附近，使其自動(dòng)爬上3次。以后每次訓(xùn)練前將小鼠放在平臺(tái)附近，使其自主爬上到平臺(tái)一次。每隔24h訓(xùn)練1次，訓(xùn)練期間繼續(xù)給藥，給藥方法同第25天。采集給藥第29天的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。給藥第30天把平臺(tái)去掉統(tǒng)計(jì)小鼠空間搜索能力，給藥方法同第25天。并記錄小鼠穿越平臺(tái)次的數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示。

表6.各組小鼠水迷宮試驗(yàn)結(jié)果(n＝15)

注：與空白組比較，**p<0.01；與模型組比較，#p<0.05，##p<0.01；

從上述結(jié)果中可以看出，與空白組相比，模型組小鼠找到平臺(tái)時(shí)間延長(zhǎng)(p<0.01)，經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)減少(p<0.01)，提示造模成功。與模型組相比，scp-a-2組小鼠找到平臺(tái)時(shí)間明顯縮短(p<0.05)，經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)明顯增加(p<0.01)，提示scp-a-2組具有改善小鼠記憶作用。

實(shí)施例4

降糖實(shí)驗(yàn)。

1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

同實(shí)施例3。

2、方法。

取小鼠，隨機(jī)取10只作為空白對(duì)照組，其余小鼠空腹12h，腹腔注射40mg/kg的鏈脲佐菌素(stz)溶液(0.1mol的枸櫞酸緩沖液)，連續(xù)注射5d，每次注射之前需要禁食12h。1周后，眼內(nèi)眥取血，測(cè)定禁食12h后的空腹血糖值，取血糖值大于8mmol/l的小鼠既為造模成功。

將造模成功的小鼠隨機(jī)分組，每組10只，一組作為模型對(duì)照組，其余組分別為五味子酸性多糖組(scp-a,40mg/kg)、五味子酸性多糖scp-a-1組(scp-a-1,40mg/kg)、五味子酸性多糖scp-a-2組(scp-a-2,40mg/kg)、五味子酸性多糖scp-a-3組(scp-a-3,40mg/kg)，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃給予蒸餾水，其余給藥組每天灌胃給藥1次，連續(xù)15d，末次給藥后將各組小鼠空腹12h，眼球取血，分離血清，葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖含量。

2、結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示。

表7.各組小鼠空腹血糖含量(n＝6)

注：與空白組比較，***p<0.001；與模型組比較，#p<0.05，###p<0.001；

從上述結(jié)果中可以看出，與空白組相比，模型組小鼠血糖明顯增加，提示造模成功。

與模型組相比，scp-a-2和scp-a-3組小鼠血糖水平均顯著下降(p<0.05或p<0.001)，而scp-a-3能夠極顯著降低小鼠的高血糖，并能夠達(dá)到正常值；說(shuō)明scp-a-3具有降糖的作用。

實(shí)施例5

抗肝損傷實(shí)驗(yàn)。

1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

同實(shí)施例3。

2、方法。

取小鼠，隨機(jī)分組，每組10只，分別為正常對(duì)照組(control)、模型組(model)、五味子酸性多糖組(scp-a，20mg/kg)、五味子酸性多糖scp-a-1組(scp-a-1，20mg/kg)、五味子酸性多糖scp-a-2組(scp-a-2，20mg/kg)、五味子酸性多糖scp-a-3組(scp-a-3，20mg/kg)。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。給藥組給予五味子酸性多糖進(jìn)行灌胃，正常對(duì)照組和模型組給予同體積蒸餾水灌胃，每日一次，連續(xù)15天。末次給藥1小時(shí)后，模型組及給藥組小鼠給予50％乙醇12ml/kg灌胃，正常對(duì)照組小鼠給予同體積蒸餾水灌胃，12h后禁食不禁水。處死，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

所述模型組的造模方法為：給予小鼠50％乙醇，按照12ml/kg劑量灌胃，采用酶法以南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定血清中的ast、alt。

2、結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示。

表8.各組小鼠血清中alt和ast含量(n＝7)

注：與空白組比較，**p<0.01；與模型組比較，#p<0.05，##p<0.01；

從上述結(jié)果中可以看出，與空白組相比，模型組小鼠血清ast和alt水平均顯著增高(p<0.01)，說(shuō)明小鼠一次性灌胃50％酒精可引起小鼠肝細(xì)胞損傷，提示造模成功。

與模型組相比，scp-a-1和scp-a-2組小鼠血清中alt、ast水平均顯著下降(p<0.05或p<0.01)，提示scp-a-1和scp-a-2提示其對(duì)酒精誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有一定的保護(hù)作用。而scp-a和scp-a-3對(duì)小鼠血清中alt和ast水平均無(wú)明顯影響；說(shuō)明scp-a-1的護(hù)肝作用最好。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說(shuō)明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。