本發(fā)明屬于臨床體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測試劑盒。

背景技術(shù)：
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天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)也稱為谷草轉(zhuǎn)氨酶，主要存在于心肌細胞中，肝細胞次之。在心肌細胞內(nèi)含量較多，當(dāng)心肌梗死時，血清中AST活力增高，在發(fā)病后6-12h之內(nèi)顯著增高，在48h達到高峰，約在3-5天恢復(fù)正常。血清中AST也可來源于肝細胞，各種肝病可引起血清中AST的升高，中毒性肝炎還可更高。肌炎癥、胸膜炎、腎炎等也可引起血清AST的輕度增高，還可能存在心肌細胞、肝細胞及骨骼肌損傷。臨床上主要用于病毒性肝炎、阻塞性黃疸、心肌梗死的輔助診斷。

目前體外檢測天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的方法主要有賴氏法、酶偶聯(lián)比色法及連續(xù)監(jiān)測法(速率法)。賴氏法的缺點是標(biāo)本AST活性高時，草酰乙酸對AST顯示的反饋抑制，使測定結(jié)果偏低；酶偶聯(lián)比色法所用的氯化硝基四氮唑藍(NBT)有毒，可能有致癌性，不滿足綠色原則；連續(xù)監(jiān)測法的優(yōu)點是可以確定線性期并計算每分鐘吸光度的變化(ΔA/min)，根據(jù)此值再準(zhǔn)確地計算酶活性，可以利用全自動生化分析儀進行檢測；酶和底物反應(yīng)的特異性好，檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高。以上三種方法相比較，采用連續(xù)監(jiān)測法較佳。

本發(fā)明的試劑盒主要采用連續(xù)監(jiān)測法進行檢測，該方法是國際臨床化學(xué)和實驗室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟(IFCC)推薦方法。其檢測原理為：AST催化L-天門冬氨酸的氨基轉(zhuǎn)移至α-酮戊二酸，生成草酰乙酸和L-谷氨酸。蘋果酸脫氫酶(MDH)催化草酰乙酸還原的同時將還原型輔酶(NADH)氧化成氧化型輔酶(NAD⁺)，由于NADH在340nm處有特征吸收，所以NADH的下降速率和AST的活力成正比。反應(yīng)式如下：

本發(fā)明涉及的天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測試劑盒，無需樣本前處理，可直接利用全自動生化分析儀進行大批量樣本檢測，操作簡單、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好，適合臨床應(yīng)用推廣。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測試劑盒供臨床應(yīng)用，主要解決現(xiàn)有AST檢測領(lǐng)域存在的準(zhǔn)確度低、操作繁瑣、污染環(huán)境、試劑不穩(wěn)定等問題。

為了解決本發(fā)明內(nèi)源性α-酮戊二酸對天門冬氨酸(AST)測定的干擾，采用如下技術(shù)方案：采用兩步法檢測，血清與(缺少α-酮戊二酸)的底物溶液混合，37℃保溫5min，使樣品中所含內(nèi)源性α-酮戊二酸引起的副反應(yīng)進行完畢。然后加入α-酮戊二酸啟動AST的催化反應(yīng)，在主波長340nm處連續(xù)監(jiān)測吸光度下降速率，根據(jù)線性反應(yīng)期吸光度下降速率(-ΔA/min)，計算出AST活力。

本發(fā)明提供的試劑盒由試劑1和試劑2組成，其中試劑1的組成和成份如下：

Tris-HCl緩沖液120mmol/L-180mmol/L，PH＝8.2

L-天門冬氨酸400mmol/L-600mmol/L

還原型輔酶(NADH)0.2mmol/L-0.4mmol/L

蘋果酸脫氫酶(MDH)800U/L-1200U/L

酶保護劑

穩(wěn)定劑

防腐劑

試劑2的組成和成份如下：

Tris-HCl緩沖液60mmol/L-100mmol/L，PH＝7.4

α-酮戊二酸60mmol/L-80mmol/L

穩(wěn)定劑

防腐劑

所述酶保護劑選自牛血清白蛋白(BSA)或甘油與糖類中的一種或多種組合物，其用量為BSA0.1％-2％，甘油5％-20％，優(yōu)選為BSA 0.5％-1.5％，甘油10％-15％。

以上所述糖類可選自葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖中的一種或多種，其用量為1g/L-15g/L，優(yōu)選為5g/L-10g/L。

所述試劑1和試劑2的穩(wěn)定劑均選自KCl及表面活性劑組合物，其用量為KCl 1g/L-15g/L，優(yōu)選為5g/L-10g/L。

以上所述表面活性劑可選自吐溫-20(Tween-20)、吐溫-80(Tween-80)、曲拉通X-100(Triton X-100)、聚乙二醇6000(PEG 6000)及聚乙二醇8000(PEG 8000)中的一種或多種，其用量為0.1％-2％，優(yōu)選為0.5％-1.5％。

所述試劑1和試劑2的防腐劑均可選自NaN₃或Proclin-300，其用量為NaN₃0.1g/L-2g/L，Proclin-300 0.1％-2％，優(yōu)選為NaN₃0.6g/L-1g/L，Proclin-300 0.5％-1％。

本發(fā)明天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)檢測試劑盒適用于各類全自動生化分析儀，現(xiàn)于全自動生化分析儀BS-420上的應(yīng)用，其具體使用方法如下：

表1樣本檢測操作程序

計算方法：樣品中的AST含量(U/L)＝ΔAT/min×F

ΔAT/min：測定管平均每分鐘相對空白管吸光度變化

注：TV：試劑樣品總體積，SV為樣品體積； 6.22：NADH在340nm處的毫摩爾分子吸光系數(shù)；

1.0：比色皿光徑(cm)；1000：U/mL到U/L的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

本發(fā)明所使用的質(zhì)控品為羅氏高、低值質(zhì)控品；所測樣品為不溶血血清。

有益效果：本發(fā)明天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測試劑盒為液體雙試劑，采用兩步法，有效消除內(nèi)源性α-酮戊二酸干擾，提高了AST測定的準(zhǔn)確度；本發(fā)明試劑盒中加入酶保護劑和穩(wěn)定劑，提高了AST試劑盒的穩(wěn)定性，于37℃水浴可穩(wěn)定至少一周，說明2-8℃保存可以至少穩(wěn)定一年。

以下結(jié)合具體實施例進一步說明本發(fā)明，應(yīng)理解，具體實施方式僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。

附圖說明：

圖1是本發(fā)明實施例1-3及對比實施例2-8℃保存一周的空白吸光度變化對比試驗結(jié)果圖；

圖2是本發(fā)明實施例1-3及對比實施例37℃水浴一周的空白吸光度變化對比試驗結(jié)果圖。

具體實施方式

實施例1

天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測試劑盒，由試劑1和試劑2組成，具體成分及含量如下：

試劑1的組成：

Tris-HCl緩沖液120mmol/L，PH＝8.2

L-天門冬氨酸400mmol/L

NADH 0.2mmol/L

蘋果酸脫氫酶800U/L

KCl 5g/L

吐溫-20 0.5％

BSA 1％

蔗糖5g/L

Proclin-300 0.5％

試劑2的組成：

Tris-HCl緩沖液100mmol/L，PH＝7.4

α-酮戊二酸60mmol/L

KCl 6g/L

PEG 6000 0.5％

Proclin-300 0.5％

實施例2

天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測試劑盒，由試劑1和試劑2組成，具體成分及含量如下：

試劑1的組成：

Tris-HCl緩沖液150mmol/L，PH＝8.2

L-天門冬氨酸500mmol/L

NADH 0.3mmol/L

蘋果酸脫氫酶1000U/L

KCl 8g/L

曲拉通X-100 1％

甘油10％

麥芽糖6g/L

Proclin-300 1％

試劑2的組成：

Tris-HCl緩沖液80mmol/L，PH＝7.4

α-酮戊二酸70mmol/L

KCl 8g/L

PEG 8000 1％

Proclin-300 1％

實施例3

天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測試劑盒，由試劑1和試劑2組成，具體成分及含量如下：

試劑1的組成：

Tris-HCl緩沖液180mmol/L，PH＝8.2

L-天門冬氨酸600mmol/L

NADH 0.4mmol/L

蘋果酸脫氫酶1200U/L

KCl 10g/L

曲拉通X-100 1.5％

PEG 8000 1.5％

甘油15％

果糖6g/L

葡糖糖6g/L

NaN₃ 1g/L

試劑2的組成：

Tris-HCl緩沖液60mmol/L，PH＝7.4

α-酮戊二酸80mmol/L

KCl 10g/L

吐溫-80 1％

PEG 6000 1％

NaN₃ 0.6g/L

對比實施例

不加穩(wěn)定劑和酶保護劑的天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測試劑盒，由試劑1和試劑2組成，具體成分及含量如下：

試劑1的組成：

Tris-HCl緩沖液180mmol/L，PH＝8.2

L-天門冬氨酸600mmol/L

NADH 0.4mmol/L

蘋果酸脫氫酶1200U/L

NaN₃ 1g/L

試劑2的組成：

Tris-HCl緩沖液60mmol/L，PH＝7.4

α-酮戊二酸80mmol/L

NaN₃ 0.6g/L

將本發(fā)明實施例1-3及對比實施例進行準(zhǔn)確度驗證試驗。質(zhì)控品選用羅氏高值質(zhì)控(AST靶值：102U/L，靶值范圍(±10％)：91.8U/L-112.2U/L)；羅氏低值質(zhì)控(AST靶值：38U/L，靶值范圍(±10％)：34.2U/L-41.8U/L)。采用BS-420全自動生化分析儀進行檢測，具體操作方法如表一所述，采用單點定標(biāo)法定標(biāo)后，AST測定值及空白吸光度值可從儀器上直接讀取，為了減少偶然誤差，重復(fù)測定三次取均值。

實施例1-3及對比實施例準(zhǔn)確度結(jié)果如下：

表2實施例1-3及對比實施例準(zhǔn)確度比較

將本發(fā)明實施例1-3及對比實施例進行穩(wěn)定性驗證試驗。將以上四種試劑盒每種平均分成兩份，一份至于2-8℃保存，另一份至于37℃水浴中保存，每隔一天測定一次，連續(xù)監(jiān)測一周，觀察空白吸光度變化及血清測定值(血清定值52.3U/L，允許誤差范圍(±10％)：47.07U/L-57.53U/L)，通過空白吸光度的變化和準(zhǔn)確度的測定比較試劑穩(wěn)定性。

表3實施例1試劑盒穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

表4實施例2試劑盒穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

表5實施例3試劑盒穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

表6對比實施例試劑盒穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

由表2可知實施例1-3制得的試劑盒準(zhǔn)確度均在允許的誤差范圍(±10％)內(nèi)，而對比實施例制得的試劑盒準(zhǔn)確度超出了誤差允許范圍；由圖1和圖2可以看出，實施例1-3制得的試劑盒的穩(wěn)定性明顯強于對比實施例制得的試劑盒。實施例1-3制得的試劑盒雖然試劑空白有一定程度的下降，但是下降的幅度不大，在允許范圍內(nèi)，說明加入合適的穩(wěn)定劑和酶保護劑可以減緩NADH的衰減、保護酶的活性，進而提高試劑盒的穩(wěn)定性，延長試劑盒的保存期。