本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，具體涉及復(fù)合水凝膠的制備技術(shù)。

背景技術(shù)：

水凝膠因獨(dú)特的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，類似于生命組織材料，表面粘附蛋白質(zhì)及細(xì)胞能力較弱，與血液、體液及人體組織相接觸時(shí)，表現(xiàn)出良好的生物相容性，在細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)及醫(yī)療方面受到極大關(guān)注。目前醫(yī)用合成水凝膠的高分子材料主要有丙烯酰胺、丙烯酸羥基酯，甲基丙烯酸羥基酯、聚乙烯醇、聚氧乙烯等。但常見醫(yī)用水凝膠主要有自由基引發(fā)劑和交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)的，在這類交聯(lián)反應(yīng)中，交聯(lián)劑分解產(chǎn)生自由基，這些自由基引發(fā)高分子自由基鏈反應(yīng)，從而導(dǎo)致高分子化合物鏈交聯(lián)，在這里交聯(lián)劑實(shí)際上起的是引發(fā)劑的作用，或者是利用交聯(lián)劑分子中的官能團(tuán)，與高分子化合物進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)交聯(lián)劑作為橋基把聚合大分子交聯(lián)起來(lái)。而應(yīng)用自由基引發(fā)劑及交聯(lián)劑尚有缺點(diǎn)，即單體殘留，交聯(lián)劑或引發(fā)劑殘留都會(huì)引起炎癥或者細(xì)胞毒性，且沒(méi)有生物活性。如何改進(jìn)制備材料、方法及條件克服傳統(tǒng)醫(yī)用水凝膠制備的缺點(diǎn)以及開發(fā)出更廣泛的用途是現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)。本發(fā)明通過(guò)天然中藥多糖制備具有促細(xì)胞生長(zhǎng)和抗凝血活性多糖水凝膠的方法可以實(shí)現(xiàn)上述目的，并且目前尚未見到兼具有促細(xì)胞生長(zhǎng)和抗凝血活性的復(fù)合中藥多功能多糖水凝膠的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種朵功能多糖水凝膠的制備方法及用途。

本發(fā)明是一種多功能多糖水凝膠的制備方法，其步驟為：

（1）將川芎、紅花、海帶的原材料以質(zhì)量比為1∶1∶1混合，粉碎后用水提醇沉的方法提取多糖；用sevage法除多糖蛋白2次，50℃下干燥，即得紅川海粗多糖；

（2）取多糖粉末，加入到干燥的反應(yīng)釜中，然后加入按體積比為10ml/50ml的無(wú)水乙醇/蒸餾水混合溶液中，在25℃下進(jìn)行攪拌2小時(shí)；

（3）取摩爾量相當(dāng)于多糖單體摩爾量的naio4，溶于水后加入反應(yīng)體系，在避光的狀態(tài)下反應(yīng)10小時(shí)；

（4）然后向反應(yīng)體系中在加入與naio4等摩爾量的乙二醇，攪拌30分鐘；加入體積相當(dāng)于反應(yīng)體系三倍量的無(wú)水乙醇，攪拌10分鐘，抽濾，然后用截留分子量為3500的透析袋透析72小時(shí)，50℃下干燥12h，即得氧化的紅花多糖/川穹多糖/海帶多糖；

（5）將紅花、川穹、海帶氧化多糖，溶于蒸餾水中配成4%的溶液，攪拌使其完全溶解；取n-o羧甲基殼聚糖，溶于蒸餾水中配成8%的溶液，攪拌使其完全溶解；

（6）分別將紅花、川穹、海帶氧化多糖和n-o羧甲基殼聚糖兩種溶液按體積比為1:1進(jìn)行混合，200r/min攪拌均勻，得到多糖水凝膠。

以上所述的方法制得的多糖水凝膠具有促細(xì)胞生長(zhǎng)和抗凝血作用，其用途為：應(yīng)用于組織工程材料，即小直徑血管組織工程血管支架，能夠有效促進(jìn)血管形成并抑制支架移植后的血栓形成。

以上所述的方法制得的多糖水凝膠具有促細(xì)胞生長(zhǎng)和抗凝血作用，其用途為：應(yīng)用于抗凝血活性藥物輔料，能夠利用3d打印制備緩釋制劑。

本發(fā)明的有益之處在于：產(chǎn)品原料來(lái)源廣泛，制備工藝簡(jiǎn)單，成本較低；紅花多糖/川穹多糖/海帶多糖復(fù)合水凝膠本身具有促細(xì)胞生長(zhǎng)活性，比其它任何合成生物材料都接近活體組織，具有良好的材料生物相容性、可降解性，以及良好的材料——細(xì)胞界面及一定的空間三維結(jié)構(gòu)；且具有優(yōu)良的抗凝血作用，可以抑制移植血管后的凝血現(xiàn)象。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明制備的具有促細(xì)胞生長(zhǎng)和抗凝血作用的多功能復(fù)合多糖水凝膠（未成膠）；圖2是本發(fā)明制備的具有促細(xì)胞生長(zhǎng)和抗凝血作用的多功能復(fù)合多糖水凝膠（已成膠）；

圖3是通過(guò)實(shí)施例1制備的紅花/川穹/海帶多糖水凝膠的促細(xì)胞生長(zhǎng)活性。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明是一種多功能多糖水凝膠的制備方法，其步驟為：

（1）將川芎、紅花、海帶的原材料以質(zhì)量比為1∶1∶1混合，粉碎后用水提醇沉的方法提取多糖；用sevage法除多糖蛋白2次，50℃下干燥，即得紅川海粗多糖；

（2）取多糖粉末，加入到干燥的反應(yīng)釜中，然后加入按體積比為10ml/50ml的無(wú)水乙醇/蒸餾水混合溶液中，在25℃下進(jìn)行攪拌2小時(shí)；

（3）取摩爾量相當(dāng)于多糖單體摩爾量的naio4，溶于水后加入反應(yīng)體系，在避光的狀態(tài)下反應(yīng)10小時(shí)；

（4）然后向反應(yīng)體系中在加入與naio4等摩爾量的乙二醇，攪拌30分鐘；加入體積相當(dāng)于反應(yīng)體系三倍量的無(wú)水乙醇，攪拌10分鐘，抽濾，然后用截留分子量為3500的透析袋透析72小時(shí)，50℃下干燥12h，即得氧化的紅花多糖/川穹多糖/海帶多糖；

（5）將紅花、川穹、海帶氧化多糖，溶于蒸餾水中配成4%的溶液，攪拌使其完全溶解；取n-o羧甲基殼聚糖，溶于蒸餾水中配成8%的溶液，攪拌使其完全溶解；

（6）分別將紅花、川穹、海帶氧化多糖和n-o羧甲基殼聚糖兩種溶液按體積比為1:1進(jìn)行混合，200r/min攪拌均勻，得到多糖水凝膠。

以上所述步驟（5）中氧化紅川海多糖和n,o-羧甲基殼聚糖的質(zhì)量比為1:2。

以上所述的方法制得的多糖水凝膠具有促細(xì)胞生長(zhǎng)和抗凝血作用，其用途為：應(yīng)用于組織工程材料，即小直徑血管組織工程血管支架，能夠有效促進(jìn)血管形成并抑制支架移植后的血栓形成。

以上所述的方法制得的多糖水凝膠具有促細(xì)胞生長(zhǎng)和抗凝血作用，其用途為：應(yīng)用于抗凝血活性藥物輔料，能夠利用3d打印制備緩釋制劑。

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實(shí)施例1：

（1）取川芎紅花海帶各250g，適當(dāng)粉碎，加適量乙醇60℃下攪拌4h，進(jìn)行脫脂處理，再用自來(lái)水沖洗一次，在80℃下蒸餾水浸提三次，濃縮浸提液至適量體積，用sevage（氯仿/正丁醇=5：1）法除多糖蛋白，加三倍量無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉，抽濾，50℃下干燥，稱量，待用；

（2）取5.0g多糖粉末，加入到干燥的單口瓶中，然后加入無(wú)水乙醇/蒸餾（10ml/50ml）在25℃下進(jìn)行攪拌2h，取摩爾量相當(dāng)于多糖單體摩爾量（以180計(jì)算）的naio4，溶于10ml水后加入反應(yīng)體系，在避光的狀態(tài)下反應(yīng)一定時(shí)間,然后向反應(yīng)體系中在加入與naio4等摩爾量的乙二醇，攪拌30min后，加入體積相當(dāng)于反應(yīng)體系三倍量的無(wú)水乙醇，攪拌10min，抽濾，50℃下干燥即得氧化的多糖；

（3）向反應(yīng)體系中加入體積約2倍于前述反應(yīng)體系的無(wú)水乙醇，攪拌10min后抽濾，然后用截留分子量為3500的透析袋透析72h，50℃下干燥12小時(shí)，即得氧化的紅川海多糖；

（4）取16g氫氧化鈉固體配制成40%(25ml)氫氧化鈉溶液，加5g殼聚糖粉末，混均，在-20℃下過(guò)夜保存。取20g氯乙酸溶解于100ml異丙醇，緩慢滴入上述殼聚糖溶液，約0.5h滴完。氯乙酸殼聚糖混合溶液25℃攪拌2h，然后60℃繼續(xù)攪拌2h，抽濾混合液，濾餅在50℃下干燥保存，待用；

（5）分別以n,o-羧甲基殼聚糖和氧化的多糖質(zhì)量比為1:1、1:2、1:3分別溶于一定量的蒸餾水中，在室溫下以體積比為1:1進(jìn)行混合，總體積定為4ml，并觀察凝膠的形成；

（6）在37℃條件下，將粗提復(fù)方紅花/川穹/海帶多糖水凝膠樣品cslph-1、cslph-2和cslph-3分別在α-mem培養(yǎng)基（5ml）中，浸泡48h，獲得各樣品凝膠提取物。將wi-38細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中。此后，向體系中加入0.1ml一系列水凝膠提取液。加入新鮮培養(yǎng)基的孔作為陽(yáng)性對(duì)照。然后放置在37℃co2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，采用mtt法測(cè)定細(xì)胞存活率。使用酶標(biāo)儀（dnm9606，北京）在570nm處測(cè)定并記錄吸光度值。細(xì)胞存活率（%）根據(jù)下列公式計(jì)算：

細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組吸光度/陽(yáng)性對(duì)照吸光度×100%

如圖3所示，顯示了紅花多糖/川穹多糖/海帶多糖水凝膠有較好的促細(xì)胞生長(zhǎng)作用。

實(shí)施例2：

（1）取5.0g多糖粉末，加入到干燥的反應(yīng)釜中，然后加入無(wú)水乙醇/蒸餾（10ml/50ml）在25℃下進(jìn)行攪拌2h；

（2）取摩爾量相當(dāng)于多糖單體摩爾量（以180計(jì)算）的naio4，溶于10ml水后加入反應(yīng)體系，在避光的狀態(tài)下反應(yīng)10h；

（3）然后向反應(yīng)體系中在加入與naio4等摩爾量的乙二醇，攪拌30min；

加入體積相當(dāng)于反應(yīng)體系三倍量的無(wú)水乙醇,攪拌10min，抽濾，然后用截留分子量為3500的透析袋透析72h，50℃下干燥12h，即得氧化的紅花多糖/川穹多糖/海帶多糖；

（4）取4g紅花、川穹、海帶氧化多糖，溶于100ml蒸餾水，攪拌使其完全溶解；

（5）稱取8gn-o羧甲基殼聚糖，溶于100蒸餾水中，攪拌使其完全溶解；

（6）分別將紅花/川穹/海帶氧化多糖和n-o羧甲基殼聚糖兩種溶液按體積比為1:2進(jìn)行混合，200r/min攪拌均勻（時(shí)間較短），制備成多糖凝膠；

（7）將小鼠36只，隨機(jī)分為三組，以25ml/kg容量灌胃，分別給予生理鹽水為模型對(duì)照組，法華令7mg/kg為陽(yáng)性對(duì)照組，紅花/川穹/海帶多糖水凝膠1000mg/kg為實(shí)驗(yàn)組。1h后用直徑為10mm的玻璃毛細(xì)管插入小鼠內(nèi)眥球后靜脈叢取血至出現(xiàn)血凝絲的時(shí)間，即為凝血時(shí)間。如表1顯示，紅花/川穹/海帶多糖凝膠可顯著延長(zhǎng)小鼠凝血時(shí)間，與生理鹽水對(duì)照組有顯著差異。

表1紅花/川穹/海帶多糖水凝膠對(duì)小鼠凝血時(shí)間（ct）的影響

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實(shí)施例3：

（1）取5.0g多糖粉末，加入到干燥的反應(yīng)釜中，然后加入無(wú)水乙醇/蒸餾（10ml/50ml）在25℃下進(jìn)行攪拌2h；

（2）取摩爾量相當(dāng)于多糖單體摩爾量（以180計(jì)算）的naio4,溶于10ml水后加入反應(yīng)體系，在避光的狀態(tài)下反應(yīng)10h；

（3）然后向反應(yīng)體系中在加入與naio4等摩爾量的乙二醇，攪拌30min；

加入體積相當(dāng)于反應(yīng)體系三倍量的無(wú)水乙醇，攪拌10min，抽濾，然后用截留分子量為3500的透析袋透析72h，50℃下干燥12h，即得氧化的紅花多糖/川穹多糖/海帶多糖；

（4）取4g紅花、川穹、海帶氧化多糖，溶于100ml蒸餾水，攪拌使其完全溶解；

（5）稱取8gn-o羧甲基殼聚糖，溶于100ml蒸餾水中，攪拌使其完全溶解；

（6）分別將紅花/川穹/海帶氧化多糖和n-o羧甲基殼聚糖兩種溶液按體積比為1:2進(jìn)行混合，200r/min攪拌均勻（時(shí)間較短），將攪拌均勻的溶液以20ml/h的速度通過(guò)3d打印機(jī)打印組織工程血管支架。