本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種采用分子生物學(xué)手段鑒定中藥的方法，具體為一種用于鑒定中藥材五加皮的引物對及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：五加皮來源為五加科植物細(xì)柱五加的干燥根皮。五加皮用藥歷史悠久，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。祛風(fēng)除濕，補益肝腎，強筋壯骨，利水消腫。以五加皮為主制成的五加皮酒，具有祛風(fēng)祛濕，舒筋活血的功能，常用來治療風(fēng)濕性疾病。根據(jù)現(xiàn)代研究表明，五加皮具有抗炎、抗腫瘤、抗應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝臟等作用。由于其臨床療效，五加皮的應(yīng)用越來越廣泛，越來越受到研究者的關(guān)注。然而，各地藥材市場中經(jīng)常有偽品做五加皮出售，容易引起安全問題。我國有五加屬18個種，分布在全國大部分地區(qū)，由于歷史和地理因素，細(xì)柱五加的近緣種常被用作五加皮在地方中使用，可能會影響臨床療效，例如，紅毛五加廣泛分布于四川、甘肅、青海、寧夏等地，在四川、廣東等地被作為五加皮應(yīng)用已有很長的歷史。無梗五加分布于黑龍江、吉林、遼寧等地，藥材在產(chǎn)區(qū)做五加皮使用。更為嚴(yán)重的是市場中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)香加皮作為五加皮出售的現(xiàn)象。香加皮來源于蘿摩科植物杠柳的干燥根皮。香加皮作五加皮混用的歷史很長，在藥材銷售渠道還習(xí)慣將五加皮成為“南五加皮”，把香加皮叫做“北五加皮”，二者形態(tài)和名字相似，但功效和化學(xué)成分不同，香加皮沒有補益肝腎的功效，且含有毒的杠柳毒苷等強心苷類化合物，誤用后輕者不達(dá)療效，重者導(dǎo)致毒性反應(yīng)，甚至發(fā)生可能發(fā)生因心肌收縮性停跳而死亡的嚴(yán)重事件。臨床上也曾有誤服香加皮致死的報道，因此準(zhǔn)確鑒定五加皮很有必要。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種能夠特異性鑒定中藥材五加皮的方法，避免誤服而產(chǎn)生身體傷害，保證五加皮臨床安全用藥，本發(fā)明提供了一種用于鑒定中藥材五加皮的引物對及其應(yīng)用。技術(shù)方案：一種用于鑒定中藥材五加皮的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。優(yōu)選的，所述引物對p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.7。表1引物對及發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列名稱序列(5，-3，)seqidno.p1-fggcatgcaatactagctagcagtcg1p1-rcatagtgactctgaatgctaactgtctac2p2-fcacgaccactgcacgacatcagtacg3p2-rctgcgtcgccaaacgagaggtagccac4p3-fcggacaactgcgagtatgctggcag5p3-rggcatggattcagcactagatgcacg6發(fā)卡結(jié)構(gòu)cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg7所述引物對在制備鑒定中藥材五加皮試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。優(yōu)選的，所述試劑盒鑒定中藥材五加皮的步驟包括：(1)提取五加皮樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋100～1000倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋10～100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。優(yōu)選的，所述五加皮樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。優(yōu)選的，所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。有益效果：(1)本發(fā)明所述引物對能夠特異性鑒定中藥材五加皮，避免誤服而產(chǎn)生身體傷害，保證五加皮臨床安全用藥；(2)所述引物對具有靈敏度高、穩(wěn)定性強的優(yōu)點。附圖說明圖1是實施例1～3pcr鑒定結(jié)果電泳圖；其中m為分子量為2000的maker；1為實施例1pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果；2為實施例2pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果；3為實施例3pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果。具體實施方式實施例1一種用于鑒定中藥材五加皮的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在制備鑒定中藥材五加皮試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。所述試劑盒鑒定中藥材五加皮的步驟包括：(1)提取五加皮樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述五加皮樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。實施例2一種用于鑒定中藥材五加皮的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在制備鑒定中藥材五加皮試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。所述試劑盒鑒定中藥材五加皮的步驟包括：(1)提取五加皮樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋1000倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋10倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述五加皮樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。實施例3一種用于鑒定中藥材五加皮的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述引物對p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.7。所述引物對在制備鑒定中藥材五加皮試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。所述試劑盒鑒定中藥材五加皮的步驟包括：(1)提取五加皮樣品的基因組dna；(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋200倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋20倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述五加皮樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。如圖1所示，將實施例1～3的擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，條帶清晰可見，產(chǎn)物單一。sequencelisting<110>蘇州市李良濟(jì)健康產(chǎn)業(yè)有限公司<120>一種用于鑒定中藥材五加皮的引物對及其應(yīng)用<130><160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>25<212>dna<213>人工序列<400>1ggcatgcaatactagctagcagtcg25<210>2<211>29<212>dna<213>人工序列<400>2catagtgactctgaatgctaactgtctac29<210>3<211>26<212>dna<213>人工序列<400>3cacgaccactgcacgacatcagtacg26<210>4<211>27<212>dna<213>人工序列<400>4ctgcgtcgccaaacgagaggtagccac27<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列<400>5cggacaactgcgagtatgctggcag25<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列<400>6ggcatggattcagcactagatgcacg26<210>7<211>40<212>dna<213>人工序列<400>7cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggg40當(dāng)前第1頁12