本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為硅柱快速再生方法。

背景技術(shù)：

傳統(tǒng)的分子克隆方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力；因此，許多實(shí)驗(yàn)方法或技術(shù)被商業(yè)試劑盒取代，如1)用于pcr產(chǎn)物(或dna)純化的pcr清潔試劑盒(pcr即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是基因或dna擴(kuò)增的主要手段)，2)用于dna酶切產(chǎn)物純化的瓊脂糖膠抽提試劑盒和3)質(zhì)粒提取試劑盒。利用這些試劑盒加快了分子克隆的進(jìn)程和研究的效率。由于試劑盒相對(duì)昂貴而且產(chǎn)品的設(shè)計(jì)主要是一次性使用，試劑盒的使用也耗費(fèi)了許多實(shí)驗(yàn)室的財(cái)力。

上述試劑盒主要由硅柱和實(shí)驗(yàn)試劑組成，其核心材料是硅柱。一次性使用的試劑盒，一方面，造成大量的垃圾和環(huán)境問(wèn)題，另一方面，也造成資金和資源的浪費(fèi)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種使硅柱快速再生的方法，并對(duì)再生的硅柱進(jìn)行了功能鑒定。

具體技術(shù)方案為：

硅柱快速再生方法，包括以下過(guò)程：

(1)取硅柱置于收集管中，加0.75ml蒸餾水，進(jìn)行離心分離，棄去收集管中廢液；

(2)向硅柱中加入硅柱再生液，靜置3分鐘進(jìn)行離心分離，棄去收集管中廢液；所述的硅柱再生液為磷酸溶液；

(3)重復(fù)步驟(2)五次；

(4)用0.75ml蒸餾水，離心分離、清洗硅柱，棄去收集管中廢液；

(5)將硅柱移至無(wú)菌離心管中，離心1分鐘，除盡硅柱中殘留水分即可得到快速再生的硅柱；

以上所述的離心分離過(guò)程為采用臺(tái)式離心機(jī)中，在室溫下，以12000rpm速度離心1分鐘。

所述的磷酸溶液濃度為1mol/l。

本發(fā)明提供的硅柱快速再生方法針對(duì)pcr清潔試劑盒中或瓊脂糖膠抽提試劑盒中的硅柱進(jìn)行再生和利用，可以為實(shí)驗(yàn)室節(jié)約資金，為社會(huì)節(jié)約資源，是更加環(huán)保的使用硅柱的方法。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例中的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖2為實(shí)施例中不同濃度的磷酸對(duì)硅柱dna污染清除效果分析；

圖3為實(shí)施例中再生硅柱與未使用過(guò)的硅柱對(duì)dna純化效果比較分析；

圖4為實(shí)施例中再生硅柱從瓊脂糖中回收、純化dna效果分析；

圖5為實(shí)施例中再生硅柱多次連續(xù)使用對(duì)dna純化效果分析；

圖6為實(shí)施例中再生硅柱與原始柱對(duì)tbox5基因克隆比較分析。

硅柱再生具體實(shí)施方式

以下結(jié)合多個(gè)實(shí)驗(yàn)和實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的具體技術(shù)方案。

實(shí)施步驟一、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

為了獲得再生硅柱，最為關(guān)鍵的技術(shù)問(wèn)題是清除一次性使用過(guò)的硅柱中dna污染。為了更好地評(píng)估所使用試劑去污染的效果，首先必須建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將人lif基因的dna以1:10方式連續(xù)稀釋，分別獲得濃度為1×10^-2,1×10^-3,1×10^-4,1×10^-5,1×10^-6納克/微升的dna。將這些不同濃度的dna進(jìn)行熒光定量pcr(qpcr)分析，將獲得qpcr結(jié)果與dna濃度的負(fù)對(duì)數(shù)(-log10)作圖，結(jié)果表明，qpcr的ct值與dna濃度的負(fù)對(duì)數(shù)成正相關(guān)，如圖1，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)曲線已經(jīng)建立，.標(biāo)準(zhǔn)曲線由ct平均值與dna濃度的負(fù)對(duì)數(shù)繪制而成。

實(shí)施步驟二、磷酸對(duì)使用過(guò)的硅柱進(jìn)行再生的方法

硅柱是由硅膜和塑料兩種材料制成的，對(duì)dna起結(jié)合作用的是硅膜中的二氧化硅(sio2)，室溫下，二氧化硅是比較耐酸堿的化學(xué)材料。另外，磷酸核糖骨架支撐dna分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)。dna中含有大量磷酸基團(tuán)，磷酸是否可用于清除dna污染并不清楚。本實(shí)施步驟將濃磷酸分別稀釋不同的濃度，如圖2，對(duì)使用過(guò)的硅柱進(jìn)行清洗。

具體方法是：1)取5支一次性使用過(guò)的硅柱(即5支硅柱已被用于純化過(guò)人類的lif基因的dna片段)并置于2ml收集管中，分別向硅柱中加0.75ml蒸餾水，將硅柱置于臺(tái)式離心機(jī)中，在室溫下，以12000rpm速度離心1分鐘。2)除去收集管的廢液，向硅柱中分別加入0.5ml不同濃度磷酸的硅柱再生液(如圖2)，靜置3分鐘，將硅柱置于臺(tái)式離心機(jī)中，在室溫下以12000rpm速度離心1分鐘后除去收集管中的廢液。3)重復(fù)步驟2)五次。4)待磷酸試劑清洗完成，用0.75ml蒸餾水再次清洗一次，棄去收集管中廢液。5)最后，將清洗過(guò)的硅柱與收集管置于離心機(jī)中以12000rpm速度離心1分鐘，除盡硅柱中殘留水分；至此，硅柱再生步驟完成。

上述步驟完成后，將再生硅柱移至1.5ml無(wú)菌離心管中，向硅柱中加入30微升去離子水，以12000rpm的速度離心1分鐘并收集、保存洗脫液。為確定何種濃度的磷酸可以更好地再生硅柱，本實(shí)施例利用上述洗脫液中dna殘留量來(lái)分析不同濃度試劑對(duì)硅柱中dna污染的清除效果。因此，利用定量pcr(qpcr)方法和實(shí)施步驟一中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，本實(shí)施例分析了各洗脫液中dna殘留濃度。結(jié)果表明，在所測(cè)試的試劑中，1mol/l磷酸溶液表現(xiàn)出很好的dna清除效果，洗脫液中dna殘留濃度為0.0031pg/μl，如圖2；但隨著磷酸溶液濃度增加，洗脫液中dna殘留濃度下降不是特別明顯。可見(jiàn)，1mol/l磷酸足夠讓使用過(guò)的硅柱進(jìn)行再生。

對(duì)再生硅柱的功能鑒定：

實(shí)施步驟三、再生硅柱能有效結(jié)合與純化pcr產(chǎn)物(dna)

以上實(shí)驗(yàn)證明1mol/l磷酸具有很好地除去硅柱中dna污染的效果；但是，經(jīng)磷酸清洗過(guò)的硅柱是否能與dna結(jié)合并有效純化pcr產(chǎn)物并不清楚，因此，本實(shí)施例有必要對(duì)再生硅柱的這一功能進(jìn)行鑒定。本實(shí)施例利用再生硅柱以及未使用過(guò)的硅柱如axygen和qiagen的原硅柱對(duì)pcr產(chǎn)物純化效果進(jìn)行分析。這里分析pcr產(chǎn)物t-box5基因的純化效果。實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：1)利用pcr在50微升反應(yīng)體系中擴(kuò)增t-box5基因，并設(shè)置3個(gè)重復(fù)。2)分別將50微升pcr產(chǎn)物按1:5體積加入dna結(jié)合液(250微升)。2)分別將300微升的dna混合液加入三種不同的硅柱中，以12000rpm速度離心1分鐘。3)除去管中廢液，分別向硅柱中加入600微升硅柱清洗緩沖液，以12000rpm速度離心1分鐘。4)除去管中廢液后，以12000rpm速度離心1分鐘，用1.5ml無(wú)菌離心管置換2ml廢液收集管，向硅柱中加30微升去離子水，離心收集洗脫液。5)取3微升用于瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行成像分析。

tbox5基因(1557bp)pcr擴(kuò)增后，用不同硅柱進(jìn)行純化并對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖3所示，qiagen再生硅柱與未使用過(guò)的硅柱表現(xiàn)出相似的產(chǎn)量。而再生硅柱比axygen硅柱表現(xiàn)出更高的產(chǎn)量。說(shuō)明再生硅柱能與pcr產(chǎn)物(dna)結(jié)合并能夠有效純化dna。

本實(shí)施步驟使用的dna結(jié)合液，硅柱清洗緩沖液為qiagen試劑盒中提供的試劑。

實(shí)施步驟四、再生硅柱能夠有效地于從瓊脂糖膠中回收與純化dna

再生硅柱是否能夠從瓊脂糖膠回收和純化dna還不清楚，因此有必要對(duì)此功能進(jìn)行鑒定。dna酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，利用再生硅柱從瓊脂糖凝膠中進(jìn)行回收和純化，具體方法如下：

1)分別取1微克純化的pcr產(chǎn)物，利用限制性酶bamhi和ecori進(jìn)行酶切2小時(shí)。2)酶切完成后，將酶切后的樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳30分鐘。3)將瓊脂糖凝膠置于紫外燈下，用手術(shù)刀片將dna目的帶位置的凝膠切出，置于稱量過(guò)的1.5ml離心管中。4)將膠和離心管于電子天平中稱量每塊膠的重量，向離心管中加入3倍膠重量的膠溶解液并置于55℃的水浴鍋中溶解。5)待膠溶解后，向離心管中加入1倍膠重量的異丙醇并徹底混合。6)分別將膠混合液移至三個(gè)不同的硅柱中(兩個(gè)新硅柱(axygen,qiagen)和一個(gè)再生柱)，以12000rpm速度離心1分鐘。7)除去廢液，向硅柱中加600微升硅柱清洗液，以12000rpm速度離心1分鐘。8)除去廢液，將硅柱再次離心1分鐘。9)用1.5ml無(wú)菌離心管置換2ml廢液收集管，向硅柱加30微升去離子水，以12000rpm速度離心1分鐘，收集洗脫液。10)各取5微升洗脫樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析進(jìn)行成像分析。

tbox5基因擴(kuò)增后，用bamhi和ecori進(jìn)行酶切，隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將含有目的dna膠切出，利用不同的硅柱從膠中回收、純化dna。最后，將回收的dna進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖4所示，利用qiagen再生硅柱純化獲得的dna量與未使用過(guò)的硅柱純化所獲得的dna量差別不大。說(shuō)明再生硅柱能夠從瓊脂糖膠中回收與純化dna。

本實(shí)施步驟使用的膠溶解液，硅柱清洗緩沖液為qiagen試劑盒中提供的試劑。

實(shí)施步驟五、再生硅柱能反復(fù)使用

以上步驟證明了再生硅柱能有效地純化dna，但這種再生硅柱是否可以反復(fù)使用并不清楚。本實(shí)驗(yàn)利用再生硅柱多次純化tbox5基因pcr產(chǎn)物。將使用過(guò)的硅柱用1mol/l磷酸按照實(shí)施步驟二中描述的方法進(jìn)行清洗。dna純化按照實(shí)施步驟三中描述的方法進(jìn)行，同時(shí)以qiagen試劑盒中未使用的硅柱設(shè)為對(duì)照，將pcr產(chǎn)物同時(shí)純化。再生硅柱采用本發(fā)明提供的硅柱再生液完成。將硅柱五次連續(xù)清洗和純化的dna(各取5微升)一起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和成像分析。

tbox5基因pcr擴(kuò)增后，連續(xù)使用同一再生硅柱進(jìn)行純化并對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖5所示，與新硅柱相比，5次純化的dna量沒(méi)有顯著差異。說(shuō)明再生硅柱能反復(fù)使用至少5次以上。

實(shí)施步驟六、再生硅柱純化的dna產(chǎn)物可用于基因克隆

將t-box5基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將pcr產(chǎn)物和克隆載體prsetb利用限制性酶bamhi和ecori進(jìn)行酶切。按照實(shí)施步驟四描述的方法，將dna從瓊脂糖膠中回收、純化。利用連接酶將純化的dna包括載體和目的片段進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)在16℃下進(jìn)行。連接體系如下：

1微升載體prsetb(50ng)；4微升目的片段t-box(80ng)；2微升10x連接緩沖液；1微升連接酶；12微升去離子水；共20微升反應(yīng)體系。

連接反應(yīng)進(jìn)行12小時(shí)后，取2微升連接產(chǎn)物與45微升感受態(tài)細(xì)胞冰上孵育45分鐘，孵育結(jié)束將樣品置于90℃水浴鍋中熱激1分鐘，將樣品再次冰浴2分鐘，然后將樣品均勻涂在lb培養(yǎng)皿上，隨后在37℃恒溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天挑取菌落接種于3毫升lb培養(yǎng)液中培養(yǎng)過(guò)夜。第三天收集細(xì)菌用axygen質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定和瓊脂糖凝膠電泳、成像分析。結(jié)果顯示，利用再生硅柱純化的dna與利用其他硅柱純化的dna，其克隆的結(jié)果沒(méi)有差異(圖6)。說(shuō)明再生硅柱制備的dna是可以用于基因克隆的。