本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于紫斑牡丹與中原牡丹的分子鑒定方法。

背景技術(shù)：

紫斑牡丹[peaoniarockii(s.g.hawetl.a.lauener)t.hongetj.j.li]屬毛茛科，芍藥屬，牡丹組，花瓣基部具紫色斑，為著名的觀賞花卉，栽培種植集中分布于甘肅蘭州市、臨夏和臨洮等地區(qū)，栽培優(yōu)良品種約2000余種，由于紫斑牡丹傳統(tǒng)品種是經(jīng)過野生種引種馴化，之后通過與中原牡丹雜交形而形成的，而目前的新的栽培種是與中原牡丹再次回交得到的，因此其種源復(fù)雜，不同地區(qū)各自命名，常有同名異物、同物異名現(xiàn)象，在種苗生產(chǎn)、營銷和推廣上存在混亂、互代、以假充真等問題，影響地方產(chǎn)業(yè)信譽(yù)。隨著紫斑牡丹的推廣種植和新品種培育，未來品種資源隊(duì)伍龐大，將涉及知識(shí)產(chǎn)權(quán)的紛爭。紫斑牡丹與中原牡丹長期雜交的結(jié)果，親緣關(guān)系復(fù)雜，形態(tài)多樣，品種間區(qū)別較小，且牡丹同品種及同植株具有受環(huán)境影響形態(tài)變化豐富。利用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、組織學(xué)特征進(jìn)行鑒定非常困難，這給紫斑牡丹品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)和鑒定帶來了困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于紫斑牡丹與中原牡丹的分子鑒定方法，應(yīng)用該方法來鑒定紫斑牡丹，具有快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適合推廣應(yīng)用。

其具體技術(shù)方案為：

一種用于紫斑牡丹與中原牡丹的分子鑒定方法，包括以下步驟：

(1)對(duì)待鑒定樣品進(jìn)行dna提??；

(2)pcr擴(kuò)增

以步驟(1)提取的總dna為模板，分別用matk序列的正向和反向引物進(jìn)行擴(kuò)增，p1(5’-cctatatccgctactccttc-3’)和p2(5’-ctcagtgaatttcaccacg-3’)，分別得到擴(kuò)增產(chǎn)物；

(3)序列校正、比對(duì)

將來自genebank的紫斑牡丹matk序列(af033592.1)與所有擴(kuò)增后的樣品序列，經(jīng)過人工校正、對(duì)齊并除去引物區(qū)及測(cè)序質(zhì)量較差區(qū)域的片段，最終獲得干凈、長度一致的序列進(jìn)行比對(duì)；

(4)序列分析

利用mega(5.05)分析序列間的變異位點(diǎn)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，紫斑牡丹的matk序列在第31bp和79bp兩個(gè)位點(diǎn)處與所有中原牡丹序列發(fā)生差異，是最保守的2個(gè)差異位點(diǎn)，故這兩個(gè)位點(diǎn)可作為鑒定紫斑牡丹和中原牡丹的信息位點(diǎn)?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了matk序列作為dna條形碼在鑒定紫斑牡丹中的應(yīng)用。

本發(fā)明能夠在傳統(tǒng)分類學(xué)的基礎(chǔ)上，通過提取dna、pcr擴(kuò)增技術(shù)及序列分析比對(duì)，即可將紫斑牡丹和中原牡丹品種有效進(jìn)行區(qū)分，由于牡丹遺傳背景的復(fù)雜性，利用matk分子標(biāo)記的方法可以避免傳統(tǒng)分類學(xué)中出現(xiàn)的誤差，可以更加快捷有效得為國內(nèi)牡丹市場及品種的繁育帶來理論和實(shí)踐的基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1紫斑牡丹與中原牡丹matk序列第31bp差異位點(diǎn)圖；

圖2紫斑牡丹與中原牡丹matk序列第79bp差異位點(diǎn)圖；

圖3基于紫斑牡丹和中原牡丹部分栽培品種matk序列和最大簡約法(mp)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。

實(shí)施例

用甘肅不同地區(qū)的4份紫斑牡丹野生種材料、42份紫斑牡丹栽培種及來自洛陽的11份中原牡丹種質(zhì)為試材，用tiangen公司dna提取試劑盒提取樣本dna，采用的正向引物：cctatatccgctactccttc，反向引物ctcagtgaatttcaccacg，pcr擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5min，接下來95℃30s，48℃退火45s，72℃延伸30s，共進(jìn)行35次循環(huán)，最后72℃延伸7min,獲得的產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后比對(duì)，在31bp(堿基t)和79bp(堿基c)處為紫斑牡丹與中原牡丹鑒定的2個(gè)固定差異位點(diǎn)。

如圖1、圖2、圖3所示，圖1、圖2中，1-20表示紫斑牡丹品種，21-24為中原牡丹品種，s為來自genebank的紫斑牡丹matk序列。將所有紫斑牡丹和中原牡丹品種的序列進(jìn)行比對(duì)分析后，可得到兩個(gè)固定的差異位點(diǎn)，從這兩個(gè)位點(diǎn)可以清晰的將紫斑牡丹和中原牡丹品種區(qū)分開來。接著構(gòu)建了所有樣品的mp最大簡約樹，從進(jìn)化樹中可以看出，中原牡丹各個(gè)品種首先聚為一起，它們之間的親緣關(guān)系較近，而紫斑牡丹品種與中原牡丹品種不在一個(gè)進(jìn)化枝內(nèi)，且親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因此，從系統(tǒng)發(fā)育樹可以將紫斑牡丹和中原牡丹有效分開。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種用于紫斑牡丹與中原牡丹的分子鑒定方法

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cctatatccgctactccttc20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ctcagtgaatttcaccacg19

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種用于紫斑牡丹與中原牡丹的分子鑒定方法，該方法包括以下步驟：對(duì)待鑒定樣品進(jìn)行DNA提??；PCR擴(kuò)增；序列校正、比對(duì)；序列分析。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，紫斑牡丹的matK序列在第31bp和79bp兩個(gè)位點(diǎn)處與所有中原牡丹序列發(fā)生差異，是最保守的2個(gè)差異位點(diǎn)，故這兩個(gè)位點(diǎn)可作為鑒定紫斑牡丹和中原牡丹的信息位點(diǎn)。基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了matK序列作為DNA條形碼在鑒定紫斑牡丹中的應(yīng)用。

技術(shù)研發(fā)人員：唐紅;丑歡歡
受保護(hù)的技術(shù)使用者：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：2017.06.13
技術(shù)公布日：2017.09.15