本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及與甲狀腺結(jié)節(jié)相關(guān)的基因體細(xì)胞特異性突變位點(diǎn)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：甲狀腺結(jié)節(jié)是臨床最常見的一種甲狀腺疾病，觸診可以的發(fā)現(xiàn)的甲狀腺結(jié)節(jié)的患病率在美國成年人群中約為4-7％。而應(yīng)用敏感的甲狀腺b檢查，在65歲以上人群中，甲狀腺結(jié)節(jié)的患病率高達(dá)50％以上。我國2010年由中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌協(xié)會滕衛(wèi)平教授牽頭進(jìn)行的全國十城市15,181居民的甲狀腺疾病流行病學(xué)調(diào)查的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我國人群中甲狀腺結(jié)節(jié)的患病率高達(dá)18.6％，因此推測我們國家的甲狀腺結(jié)節(jié)的患者高達(dá)2億人。大多數(shù)甲狀腺結(jié)節(jié)是良性的，可以采取保守治療，但有5-10％的甲狀腺結(jié)節(jié)是惡性的，需要早期手術(shù)治療，才能獲得良好的預(yù)后。因此，一個(gè)甲狀腺?？频尼t(yī)生，面對的巨大挑戰(zhàn)就是如何鑒別病人的甲狀腺結(jié)節(jié)的良性和惡性，只有這樣，才能使病人獲得及時(shí)合理的治療。如果大量的不需要手術(shù)的甲狀腺良性結(jié)節(jié)，不適當(dāng)?shù)亟o予手術(shù)治療，這樣大的人群患病率，將會產(chǎn)生巨大的醫(yī)保負(fù)擔(dān)；反之，如果不能從大量的良性結(jié)節(jié)中識別鑒定真正的惡性腫瘤，將延緩對這些病人的治療，危及患者的生命健康。目前臨床上常用的甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的手段主要有甲狀腺b超、核素掃描及甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺病理活檢(fine-needleaspirationbiopsy，fnab)。其中，甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)活檢是目前甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)美國國家癌癥研究所2008年的甲狀腺細(xì)針穿刺病理學(xué)的專題會議的指南，目前將甲狀腺結(jié)節(jié)穿刺細(xì)胞學(xué)診斷分成以下幾類：1.因穿刺甲狀腺細(xì)胞數(shù)量不足，無法診斷；2.良性結(jié)節(jié)；3.病理細(xì)胞學(xué)無法確診的結(jié)節(jié)；4.惡性甲狀腺結(jié)節(jié)四類。近年來，隨著b超引導(dǎo)下進(jìn)行細(xì)針穿刺的廣泛應(yīng)用，那種因穿刺獲得的細(xì)胞數(shù)量不足，無法診斷的病人的比例明顯減少，從以前的高達(dá)15％，降到目前的7％以下。在細(xì)針穿刺獲得足夠的甲狀腺濾泡細(xì)胞后，大多數(shù)的甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性均能通過細(xì)胞病理學(xué)的診斷方法獲得正確的診斷。但即使目前國際上最好的甲狀腺細(xì)胞病理診斷的實(shí)驗(yàn)室，也有20-40％穿刺成功的甲狀腺結(jié)節(jié)不能確定其良惡性，即病理學(xué)無法確診的結(jié)節(jié)。因此，在病人進(jìn)行甲狀腺穿刺病理活檢時(shí)，因穿刺失敗和病理不能判斷良惡性從而無法給患者進(jìn)行正確診斷的比例高達(dá)30-50％，受各中心的甲狀腺病理診斷醫(yī)師和穿刺醫(yī)師的技術(shù)水平影響較大。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種甲狀腺癌發(fā)病的致病基因突變位點(diǎn)及其應(yīng)用。本發(fā)明的第一方面，提供了選自下組(i)中的一個(gè)或多個(gè)基因突變位點(diǎn)和/或其檢測試劑的用途，用于制備試劑或試劑盒，所述試劑或試劑盒用于鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性，所述組(i)包括以下基因突變位點(diǎn)：gnas基因：nm_001077490:exon1:c.t1019c；nras基因：nm_002524:exon3:c.t284c；tshr基因：nm_000369:exon10:c.a2098g。在另一優(yōu)選例中，所述組(i)還包括以下基因突變位點(diǎn)：chek2基因：nm_145862:exon11:c.a1250g。在另一優(yōu)選例中，所述組(i)還包括以下基因突變位點(diǎn)：pik3ca基因：nm_006218:exon12:c.1818位缺失c。在另一優(yōu)選例中，所述組(i)還包括以下基因突變位點(diǎn)：gnas基因：nm_016592:exon1:c.c205a、nm_016592:exon1:c.c216t。在另一優(yōu)選例中，所述組(i)還包括以下基因突變位點(diǎn)：tshr基因：nm_000369:exon10:c.a2252g。在另一優(yōu)選例中，所述組(i)還包括以下基因突變位點(diǎn)：braf基因：nm_004333:exon15:c.t1799a。在另一優(yōu)選例中，被檢測對象包括：人或非人哺乳動物(如家畜、家禽、實(shí)驗(yàn)動物等)。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括引物、探針、芯片、或抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒含有一種或多種選自下組的試劑：(a)用于基因檢測的特異性引物；(b)用于基因檢測的特異性探針；(c)用于基因檢測的芯片；(d)用于檢測突變的基因所對應(yīng)的氨基酸突變的特異性抗體。在另一優(yōu)選例中，所述試劑或試劑盒用于實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測。在另一優(yōu)選例中，所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr中，退火溫度為60-67℃之間，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物長度為80-300bp。在另一優(yōu)選例中，所述實(shí)時(shí)熒光定量pcr中，熒光探針退火溫度為60-70℃之間。在另一優(yōu)選例中，所述探針的雙末端進(jìn)行化學(xué)基團(tuán)的修飾，5'端修飾有熒光激發(fā)基團(tuán)，3端修飾有熒光淬滅基團(tuán)。在另一優(yōu)選例中，所述檢測為輔助性檢測。本發(fā)明的第二方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)基因突變位點(diǎn)的檢測試劑：gnas基因：nm_001077490:exon1:c.t1019c；nras基因：nm_002524:exon3:c.t284c；tshr基因：nm_000369:exon10:c.a2098g。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括以下基因突變位點(diǎn)的檢測試劑：chek2基因：nm_145862:exon11:c.a1250g。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括以下基因突變位點(diǎn)的檢測試劑：pik3ca基因：nm_006218:exon12:c.1818位缺失c。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)基因突變位點(diǎn)的檢測試劑：gnas基因：nm_016592:exon1:c.c205a、nm_016592:exon1:c.c216t。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括以下基因突變位點(diǎn)的檢測試劑：tshr基因：nm_000369:exon10:c.a2252g。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)基因突變位點(diǎn)的檢測試劑：braf基因：nm_004333:exon15:c.t1799a、nm_004333:exon11:c.g1338a、nm_004333:exon15:c.a1801g；chek2基因：nm_145862:exon10:c.c1024t；nras基因：nm_002524:exon3:c.c181a、nm_002524:exon3:c.a182g；akt1基因：nm_001014431:exon3:c.g49a；ppm1d基因：nm_003620:exon1:c.c262t；pten基因：nm_000314:exon5:c.c328t；ret基因：nm_020630:exon11:c.t1888c、nm_020630:exon16:c.t2753c；tp53基因：nm_001126115:exon3:c.c265t、nm_000546:exon8:c.g814t。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)融合基因的檢測試劑：etv6-ntrk3融合基因：etv6{enst00000396373}:r.1_737_ntrk3{enst00000394480}:r.1719_19984；ncoa4-ret融合基因：ncoa4{enst00000452682}:r.1_1014_ret{enst00000355710}:r.2369_5659；ccdc6-ret融合基因：ccdc6{enst00000263102}:r.1_535_ret{enst00000355710}:r.2369_5659。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測試劑為：(a)用于基因檢測的特異性引物；(b)用于基因檢測的特異性探針；(c)用于基因檢測的芯片；(d)用于檢測突變的基因所對應(yīng)的氨基酸突變的特異性抗體。本發(fā)明的第三方面，提供了一種體外檢測樣品是否存在基因突變的方法，包括步驟：(a)用特異性引物擴(kuò)增樣品的多核苷酸，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下一個(gè)或多個(gè)基因突變：gnas基因：nm_001077490:exon1:c.t1019c、nm_016592:exon1:c.c205a、nm_016592:exon1:c.c216t；nras基因：nm_002524:exon3:c.t284c；tshr基因：nm_000369:exon10:c.a2098g、nm_000369:exon10:c.a2252g。在另一優(yōu)選例中，所述檢測為非診斷性的。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(b)中還包括檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下基因突變：chek2基因：nm_145862:exon11:c.a1250g。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(b)中還包括檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下基因突變：pik3ca基因：nm_006218:exon12:c.1818位缺失c。如果具有一個(gè)或多個(gè)基因位點(diǎn)，則說明該甲狀腺結(jié)節(jié)為惡性。在另一優(yōu)選例中，所述樣本來自于人。本發(fā)明的第五方面，提供了一種分離的基因多核苷酸序列，所述的多核苷酸序列為衍生自選自下組的基因的片段：nras基因、gnas基因、pik3ca基因、chek2基因、和tshr基因，且所述的核苷酸序列分別具有選自下組的基因突變位點(diǎn)：nras基因：nm_002524:exon3:c.t284c；gnas基因：nm_001077490:exon1:c.t1019c、nm_016592:exon1:c.c205a、nm_016592:exon1:c.c216t；pik3ca基因：nm_006218:exon12:c.1818位缺失c；chek2基因：nm_145862:exon11:c.a1250g；tshr基因：nm_000369:exon10:c.a2098g、nm_000369:exon10:c.a2252g。在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸序列長度為30-1000bp；優(yōu)選為50-500bp。本發(fā)明還提供了多核苷酸序列的用途，所述的序列可用作陽性對照(標(biāo)準(zhǔn)品)。本發(fā)明的第六方面，提供了選自下組的一個(gè)或多個(gè)或全部基因和/或其檢測試劑的用途，用于制備試劑或試劑盒，所述試劑或試劑盒用于鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性：akt1基因、braf基因、chek2基因、gnas基因、nras基因、pik3ca基因、ppm1d基因、pten基因、ret基因、tp53基因、tshr基因、etv6-ntrk3融合基因、ncoa4-ret融合基因、和ccdc6-ret融合基因。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。具體實(shí)施方式本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，意外地獲得一組與甲狀腺癌致病基因的突變位點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的基因突變位點(diǎn)能夠作為鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的標(biāo)志物。在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@類方法和條件可以變動。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語其目的僅在于描述具體實(shí)施方案，并且不意圖是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書限制。雖然在本發(fā)明的實(shí)施或測試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價(jià)的任何方法和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。在本領(lǐng)域中，如何在術(shù)前對這些甲狀腺結(jié)節(jié)進(jìn)行正確的診斷，從而給病人一個(gè)合理及時(shí)的治療，一直是甲狀腺研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，分子診斷在甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別診斷中，逐漸受到人們的關(guān)注。結(jié)節(jié)良惡性分子鑒別診斷的理論基礎(chǔ)是基于有些甲狀腺癌的致病基因，只在癌癥病人的癌組織中發(fā)生特異性的體細(xì)胞突變或融合基因的出現(xiàn)，這種突變或新融合基因在患者的正常細(xì)胞及非甲狀腺癌患者的甲狀腺組織中是不存在的。因此，這些分子標(biāo)志，在甲狀腺癌的良惡性鑒別鑒別診斷中，具有非常特異的。如人們發(fā)現(xiàn)在帶有braf基因上第600位氨基酸的val600glu突變的甲狀腺結(jié)節(jié)100％的病人是惡性結(jié)節(jié)。雖然這些基因突變在甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷中有非常好的特異性，但每一致病基因在甲狀腺癌病人中的突變頻率是不高的，因此，單靠這樣對單個(gè)基因的分子突變進(jìn)行檢測，陽性病人有重要的診斷意義，但陰性病人會漏診許多真正的甲狀腺癌患者，耽誤病人的治療。因此要解決甲狀腺癌分子診斷這一困境，需要對導(dǎo)致甲狀腺癌的多個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行突變檢測，才能夠提高甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷的特異性，降低假陰性率。但是，要想在甲狀腺結(jié)節(jié)樣本中，同時(shí)進(jìn)行多個(gè)甲狀腺癌特異性致病基因的體細(xì)胞突變和新的融合基因的檢測，需要突破以下幾個(gè)方面的科學(xué)和技術(shù)難點(diǎn)，才能達(dá)到臨床應(yīng)用的目的：第一：雖然文獻(xiàn)報(bào)道大量的甲狀腺癌的致病基因突變，但在這些報(bào)道的突變基因中，哪些是真正的致病基因，哪些不是甲狀腺癌的致病，這些問題是不清楚的。其次，在目前報(bào)道的甲狀腺癌致病基因中，哪些基因的組合在甲狀腺結(jié)節(jié)鑒別診斷中陽性率高，而陰性漏診的可能性小，是目前不知道。找到這樣的一群甲狀腺癌致病基因的組合，將在甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別中非常重要的。第二：由于甲狀腺癌的致病基因的變異(突變和融合基因)均是在甲狀腺癌細(xì)胞內(nèi)的體細(xì)胞突變，因此必須通過細(xì)針穿刺獲取甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)胞才能進(jìn)行診斷，而細(xì)針穿刺的細(xì)胞數(shù)量很少(一般細(xì)胞數(shù)在10-200個(gè))，要想在如此少的細(xì)胞中，進(jìn)行大量基因突變和融合基因的檢測，用傳統(tǒng)的一代測序是不可能的。須采用的新的檢測技術(shù)才能，完成組合型標(biāo)志的分子診斷方法的建立。第三：由于甲狀腺癌中基因變異主要包括兩大類，一類是基因體細(xì)胞突變；另一類是腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)新的融合基因。傳統(tǒng)的檢測這兩類變異方法，分別依賴樣本的dna和mrna。需要采集兩次最夠量的甲狀腺結(jié)節(jié)組織。這在臨床常規(guī)診斷中執(zhí)行困難，因此，如何能利用同一次少量的活檢樣本，進(jìn)行大量這些基因變異的檢測，是組合型分子標(biāo)志走向?qū)嶋H應(yīng)用的瓶頸。因此，本發(fā)明主要是針對上述3個(gè)甲狀腺結(jié)節(jié)分子診斷的瓶頸來進(jìn)行的,主要具有以下的獨(dú)創(chuàng)性:首先，選擇目前發(fā)現(xiàn)的19個(gè)甲狀腺乳頭狀癌的致病基因、8個(gè)不同的融合基因，以及未分化癌和差分化癌中常見tp53、ctnnb1基因和甲狀腺髓樣癌中的ret基因，作為分子標(biāo)志，通過對這些變異區(qū)段的cdna的靶向擴(kuò)增，結(jié)合二代測序技術(shù)，在甲狀腺癌和甲狀腺瘤或正常甲狀腺組織中，進(jìn)行基因突變和融合基因檢測，發(fā)現(xiàn)這一群組合型分子標(biāo)志，在中國甲狀腺癌人群中總的陽性率高達(dá)81％，是一群具有很好診斷價(jià)值的分子標(biāo)志物。其中最常見突變的11個(gè)核心基因和8個(gè)不同的融合基因的組合，可以使診斷的陽性率高達(dá)93％以上。其次,基于fludigam公司的靶基因多重pcr擴(kuò)增芯片技術(shù)，開發(fā)了一套特異性的組合的多重靶基因擴(kuò)增的技術(shù)，解決了在微量樣本中，同時(shí)進(jìn)行多個(gè)基因的靶向擴(kuò)增的方法；同時(shí)對多重pcr引物，通過二代測序技術(shù)，從而明確每一個(gè)樣本中，每一個(gè)基因特定基因的突變或新的融合基因是否存在。解決在微量樣本中，同時(shí)對多個(gè)基因變異的檢測的技術(shù)瓶頸。另外，本發(fā)明選擇mrna作為進(jìn)行靶基因擴(kuò)增的對象進(jìn)行組合型分子標(biāo)志的基因變異檢測的樣本，實(shí)現(xiàn)了在同一個(gè)樣本即對基因突變進(jìn)行檢測，又對融合基因進(jìn)行檢測的目的，是該發(fā)明在臨床應(yīng)用成為可能。同時(shí)，以mrna為模板進(jìn)行基因變異的檢測，有可以評價(jià)穿刺樣本的質(zhì)量，對診斷的可靠性進(jìn)行客觀的評價(jià)?？梢詰?yīng)用多種分子標(biāo)志物的組合對甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性進(jìn)行鑒別，如應(yīng)用brafv600e,ras和ret/ptc1,ret/ptc3,以及pax8/ppar融合基因等作為分子標(biāo)志，可以明顯增加甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷的能力。這種組合性分子標(biāo)志用于甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷的敏感性可以達(dá)到62％，特異性可以達(dá)到99.7％；如與病理細(xì)胞學(xué)診斷聯(lián)合應(yīng)用，可以使甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的敏感性，從單用病理細(xì)胞學(xué)診斷的44％提高到80％。而造成這種分子標(biāo)志物診斷敏感性不高的主要原因，是目前還沒有發(fā)現(xiàn)所有的甲狀腺的致病基因，上述常見甲狀腺癌的致病基因，在甲狀腺癌患者中，不同基因間互相排斥的突變頻率大多在70％左右，因此，用目前常見的致病基因的熱點(diǎn)位點(diǎn)的組合，作為分子標(biāo)志，進(jìn)行甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別診斷具有較大的局限性。要想提高分子標(biāo)志物診斷的敏感性，首先要找到甲狀腺癌致病的基因或分子標(biāo)志。按照2008年美國癌癥研究所甲狀腺細(xì)胞學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，目前將甲狀腺癌分為乳頭狀癌(目前將濾泡狀癌分在這類病理類型中，歸為變異性乳頭狀癌的一種)、差分化癌、未分化癌和甲狀腺髓樣癌四種，其中最常見的是甲狀腺乳頭狀細(xì)胞癌，約占所有甲狀腺癌的95％以上。不同的甲狀腺癌中，致病的基因可能不同，且同一個(gè)致病基因在不同類型的甲狀腺癌中的突變頻率也不同。如甲狀腺乳頭狀癌中常見的突變基因是braf基因，而差分化和未分化癌中，tp53基因是高頻的突變基因，在未分化癌中50％以上的病人攜帶tp53基因突變，但在甲狀腺乳頭狀癌中，很少發(fā)現(xiàn)有p53基因的突變。而甲狀腺髓樣癌患者中ret基因的突變是非常常見的，如在家族性髓樣癌中，該基因的突變率高達(dá)95％，在散發(fā)性甲狀腺髓樣癌中，ret基因的突變率也有40-50％。2014年發(fā)表在cell上的一篇大樣本甲狀腺乳頭狀癌的全基因組外顯子測序的研究，為應(yīng)用組合性分子標(biāo)志進(jìn)行甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別診斷提供了令人興奮的前景。他們通過對496例甲狀腺乳頭狀癌的全基因組外顯子測序，發(fā)現(xiàn)5個(gè)甲狀腺癌的致病基因，其中包括3個(gè)可能新的甲狀腺癌致病基因；并發(fā)現(xiàn)了8個(gè)基因與其它不同基因形成的各種類型的融合基因變異。在這些甲狀腺癌中，至少帶有這5個(gè)致病基因中一個(gè)以上基因突變的樣本占73.6％，發(fā)現(xiàn)帶有致病基因突變或融合基因變異中一個(gè)以上變異的樣本占89.8％。還有10％左右的甲狀腺癌中，既沒有這5個(gè)致病基因的點(diǎn)突變，也沒有發(fā)現(xiàn)的融合基因變異。他們隨后通過snp芯片等技術(shù)，對這些腫瘤樣本中染色體的擴(kuò)增缺失變異進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)染色體區(qū)段的大片段擴(kuò)增和缺失(arm-level的染色體變異)在甲狀腺癌樣本中非常常見，其中22q的染色體缺失約在14.4％甲狀腺癌病人發(fā)生，而1q染色體的大片段擴(kuò)增占14.8％。如果將這些染色體arm-level水平的擴(kuò)增和缺失變異，作為分子標(biāo)志，將使帶有致病基因突變、融合基因變異或arm-level的染色體擴(kuò)增缺失三類變異中至少一種變異的病人增加到96.6％。這表明，如果我們能夠用這三類不同的變異，對甲狀腺結(jié)節(jié)進(jìn)行分子診斷的話，將可能是診斷的敏感性達(dá)到95％以上，這將是目前甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷的所有手段中最可靠的診斷方法。新的分子生物學(xué)技術(shù)靶基因的多重pcr擴(kuò)增結(jié)合二代測序的出現(xiàn)，使得利用甲狀腺穿刺細(xì)胞中提取的少量rna為模板，同時(shí)檢測多種基因變異成為可能，從而使組合性分子標(biāo)志的檢測變得簡單、容易操作，同時(shí)又不至于漏檢可能存在的基因突變。fluidigm公司的靶向擴(kuò)增芯片可對多種突變基因靶向擴(kuò)增并進(jìn)行二代測序建庫，一塊芯片可同時(shí)對48個(gè)樣本的450到1500對引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，滿足甲狀腺癌這些分子標(biāo)志診斷的需求。因此，本發(fā)明采用fluidigm公司的靶基因多重pcr擴(kuò)增芯片技術(shù)，選擇目前發(fā)現(xiàn)19個(gè)甲狀腺乳頭狀癌的致病基因、8個(gè)不同的融合基因，以及未分化癌和差分化癌中常見tp53、ctnnb1基因和甲狀腺髓樣癌中的ret基因，作為分子標(biāo)志，通過對這些變異區(qū)段的cdna的靶向擴(kuò)增，結(jié)合二代測序技術(shù)，識別甲狀腺結(jié)節(jié)中是否存在這些分子標(biāo)志的變異，從而進(jìn)行甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別診斷。最終發(fā)現(xiàn)了一批新的惡性甲狀腺結(jié)節(jié)相關(guān)的基因多態(tài)性位點(diǎn)，具體信息如表1所示。表1基因名稱突變位點(diǎn)brafnm_004333:exon15:c.t1799achek2nm_145862:exon11:c.a1250g:p.n417sgnasnm_001077490:exon1:c.t1019c:p.l340pgnasnm_016592:exon1:c.c205a:p.h69ngnasnm_016592:exon1:c.c216t:p.g72gnrasnm_002524:exon3:c.t284c:p.l95ppik3canm_006218:exon12:c.1818delc:p.y606fstshrnm_000369:exon10:c.a2098g:p.k700etshrnm_000369:exon10:c.a2252g:p.k751r表1中基因序列編號參照grch37/hg19版本。braf基因braf基因編碼的蛋白屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶raf家族。在mapk/erks通路中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，參與細(xì)胞分裂、分化及分泌等。braf基因突變被認(rèn)為與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)，包括非霍奇金淋巴瘤、結(jié)直腸癌、惡性黑色素瘤、甲狀腺癌及非小細(xì)胞肺癌。另外，研究表明braf基因突變與心臉皮膚綜合征有關(guān)。第1799位發(fā)生突變的braf基因(nm_004333)的序列片段如下：cctcacagtaaaaataggtgattttggtctagctacag[t/a]gaaatctcgatggagtgggtcccatcagtttgaacagttgt(seqidno.1)在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中用于檢測braf基因1799位突變位點(diǎn)的引物對如下：braf-e15-fggagccttgtatatagacggseqidno.2braf-e15-rtgtatgttctaacaggcaccseqidno.3nras基因nras基因?yàn)橹掳┗?，其編碼的膜蛋白可穿梭于高爾基體與細(xì)胞膜之間。nras蛋白具有內(nèi)在的gtp酶活性，可分別被鳥嘌呤核苷酸交換因子激活及被gtp酶活化蛋白所抑制。位于nras上的點(diǎn)突變被認(rèn)為與體細(xì)胞直腸癌、濾泡型甲狀腺癌、自身免疫性淋巴增生綜合征、noonan綜合征以及白血病的發(fā)生有關(guān).第284位發(fā)生突變的nras基因(nm_002524)的序列片段如下：atagcaagtcatttgcggatattaacctc[t/c]acagggagcagattaagcgagtaaaagact(seqidno.4)在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中用于檢測nras基因284位突變位點(diǎn)的引物對如下：nras-e3-fcaagaaaccatatgctcaccseqidno.5nras-e3-rttggattgtgtccgttgagcseqidno.6gnas基因gnas是一個(gè)蛋白編碼基因，相關(guān)的信號通路為g蛋白偶聯(lián)受體(gpcr)信號通路及多肽配體結(jié)合受體信號通路，參與腺苷酸環(huán)化酶的激活及多種細(xì)胞反應(yīng)。該基因有多種轉(zhuǎn)錄版本。gnas基因突變與假性甲狀旁腺功能減退癥、遺傳性骨營養(yǎng)不良癥、mccune-albright綜合征、進(jìn)展性骨發(fā)育異常、多骨性纖維性結(jié)構(gòu)不良以及一些垂體腫瘤相關(guān)。第1019位發(fā)生突變的gnas基因(nm_001077490)的序列如下：gcccaacagcgccggagcttccttaacgcccac[c/a]accgctccggcgcccaggtattccctgagtcccccg(seqidno.7)在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中用于檢測gnas基因1019位突變位點(diǎn)的引物對如下：gnas-e1-1-fagaggccgccaccgtgttatseqidno.8gnas-e1-1-raggcctcgccatcattctcseqidno.9tshr基因tshr基因編碼的蛋白為膜蛋白，主要參與甲狀腺細(xì)胞的代謝，是促甲狀腺素的受體，可被腺苷酸環(huán)化酶激活。與tshr相關(guān)的疾病有先天性甲狀腺功能減退癥及非自身免疫性甲狀腺功能亢進(jìn)癥。第2252位發(fā)生突變的tshr基因(nm_000369)的序列片段如下：tgaactgattgaaaactcccatctaaccccaaaga[a/g]gcaaggccaaatctcagaagagtatatgcaaacggttttgtaag(seqidno.10)在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中用于檢測tshr基因2252位突變位點(diǎn)的引物對如下：tshr-e10-faggcaactatgttgagcgtcseqidno.11tshr-e10-rtatgccatcaccttcgccatseqidno.12chek2基因在細(xì)胞周期中調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程對dna損傷與復(fù)制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。chek2基因編碼的蛋白為細(xì)胞周期檢查調(diào)節(jié)器，被認(rèn)為是抑癌基因。此基因突變與li-fraumeni綜合征,一種攜帶tp53突變的家族性的高聚集性的癌癥表型。另外，攜帶此基因突變有發(fā)生肉瘤、乳腺癌及腦腫瘤傾向。第1250位發(fā)生突變的chek2基因(nm_145862)的序列片段如下：gaaggatcagatcaccagtggaaaataca[a/g]cttcattcctgaagtctgggcagaagtctcagagaaag(seqidno.13)在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中用于檢測chek2基因1250位突變位點(diǎn)的引物對如下：chek2-e11-ftcccaccacagcacatacacseqidno.14chek2-e11-rcttttcctttctctctctaccseqidno.15pik3ca基因pik3ca基因?yàn)橹掳┗颍瑢儆趐i3ks家族，負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)各種不同的細(xì)胞功能包括生存及增殖，其基因突變與宮頸癌等腫瘤的發(fā)病有關(guān)。第1818位發(fā)生突變的pik3ca基因(nm_006218)的序列如下：ctgaacaggctatggaacttctggactgtaatta[c/-]ccagatcctatggttcgaggttttgctgttcggtg(seqidno.16)在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中用于檢測pik3ca基因1818位突變位點(diǎn)的引物對如下：pik3ca-e12-fcacaaactagagtcacacacseqidno.17pik3ca-e12-rgcacgattcttttagatctgseqidno.18本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：(1)首次揭示一組能夠作為鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的標(biāo)志物的基因多態(tài)性位點(diǎn)，特異性高；(2)根據(jù)本發(fā)明的分子標(biāo)志(突變的基因位點(diǎn))組合，針對中國甲狀腺癌人群具有很好診斷價(jià)值，可以使診斷的陽性率高達(dá)90％以上。(3)在收集臨床病人樣本時(shí)，只需收集甲狀腺結(jié)節(jié)穿刺細(xì)胞，抽提rna作為模板，可同時(shí)檢測基因突變及融合基因，臨床可行性較好。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳陳本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如美國sambrook.j等著《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(黃培堂等譯，北京：科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。以下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。方法本發(fā)明提供一種鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的靶向基因二代測序的檢測方法，并根據(jù)甲狀腺結(jié)節(jié)的分子診斷結(jié)果確定患者合適的術(shù)式及術(shù)后管理。具體地，本發(fā)明提供了一種針對甲狀腺結(jié)節(jié)鑒別診斷的靶向基因二代測序的檢測方法，包括以下步驟：步驟(1)：獲得已知可能導(dǎo)致甲狀腺癌的相關(guān)基因信息；步驟(2)：通過ucsc和ncbi數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出基因序列以及編碼信息；步驟(3)：使用massarrayassaydesign軟件對這些基因進(jìn)行aa芯片引物設(shè)計(jì)；步驟(4)：aa芯片實(shí)驗(yàn)大致步驟(可分為5步)；①上樣：用排槍將96孔板里引物和模板吸到48.48accessarrayifc芯片上。②裝載：將芯片放進(jìn)pre-pcrifccontrollerax儀器里，引物和模板自動混合。③熱循環(huán)：利用fc1cycler儀器進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)。④收獲：利用post-pcrifccontrollerax儀器進(jìn)行pcr產(chǎn)物匯集和收獲。⑤恢復(fù)：用排槍將芯片模板上樣處pcr產(chǎn)物吸出。步驟(5)：利用bwa,samtools和gatk軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析。步驟(6)：所有測得的snv以及indel經(jīng)過annovar(http://annovar.openbioinformatics.org/)功能注釋和公共數(shù)據(jù)庫(exac,1000genomes,dbsnpandclinvar)過濾。步驟(7)：符合①雙復(fù)孔snv,alldepth>20,vaf>0.3；②單孔snv,alldepth>1000,vaf>0.4；③雙復(fù)孔snv,單孔測的不好，復(fù)孔測的好的(alldepth>1000)標(biāo)準(zhǔn)的snv經(jīng)sanger測序進(jìn)行證實(shí)。步驟(8)：符合①雙復(fù)孔indel,除去snp；②單孔indel,alldepth>25,vaf≥0.4,除去snp標(biāo)準(zhǔn)的indel經(jīng)sanger測序進(jìn)行證實(shí)。較佳地，panel中包含與甲狀腺癌發(fā)病有關(guān)的19個(gè)基因、8個(gè)融合基因及相關(guān)內(nèi)參基因，具體如下：檢測19個(gè)基因的snv:braf,hras,nras,kras,eif1ax,ppm1d,chek2,ret,ctnnb1,tp53,akt1,gnas,pik3ca,pten,tshr,cdkn2a,axin1,idh1,vhl檢測8個(gè)融合基因：ccdc6/ret,ncoa4/ret,etv6/ntrk3,strn/alk,pax8/pparg,tpm3/ntrk3,eml4/alk,prkar1a/ret甲狀腺特異基因及內(nèi)參基因：tg,tpo,gapdh,β-actin，18srrna,28srrna，tublin,rplpo(人類大核糖體蛋白),tfrc(轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)較佳地，所述的用于accessarraytmsystem擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)軟件為massarrayassaydesign。較佳地，所述的靶向測序后的數(shù)據(jù)分析軟件為bwa,samtools和gatk.。較佳地，篩選snv的標(biāo)準(zhǔn)為①雙復(fù)孔snv,alldepth>20,vaf>0.3；②單孔snv,alldepth>1000,vaf>0.4；③雙復(fù)孔snv,單孔測的不好，復(fù)孔測的好的(alldepth>1000)。較佳地，篩選indel的標(biāo)準(zhǔn)為①雙復(fù)孔indel,除去snp；②單孔indel,alldepth>25,vaf≥0.4,除去snp。本發(fā)明適用于甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷的明確，彌補(bǔ)了該領(lǐng)域的不足與缺失，根據(jù)可能導(dǎo)致甲狀腺癌發(fā)病的突變基因及融合基因，通過accessarraytmsystem建立組合性panel進(jìn)行靶向基因的二代測序。通過初步對123個(gè)甲狀腺癌患者的二代測序、數(shù)據(jù)分析以及sanger測序驗(yàn)證，19個(gè)基因中有11個(gè)基因測到突變，包括熱點(diǎn)突變brafv600e，nras:q61r,q61k,retm918t,pten,tshr,tp53及akt1,融合基因檢測到etv6-ntrk3,ncoa4-ret和ccdc6-ret。此次組合性分子標(biāo)志物應(yīng)用在123例甲狀腺癌患者中的診斷率極高。而且發(fā)現(xiàn)在多例患者中出現(xiàn)多個(gè)致病基因出現(xiàn)突變或同時(shí)存在驅(qū)動基因突變及融合基因的情況，說明甲狀腺癌的發(fā)病是多種基因改變累積造成的，且具有腫瘤異質(zhì)性，進(jìn)一步證實(shí)對于此類疾病進(jìn)行精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診斷的必要性。本發(fā)明適用于臨床甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性鑒別診斷，可以進(jìn)行高通量檢測，并進(jìn)行臨床推廣，有助于全面選擇患者的治療方案，充分彌補(bǔ)彌補(bǔ)該領(lǐng)域的不足與缺失，十分具有實(shí)用價(jià)值。綜上所述，本項(xiàng)目的結(jié)果證實(shí)基于二代測序技術(shù)基礎(chǔ)上的組合性分子標(biāo)志物在甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性診斷中發(fā)揮重要作用。包涵大多數(shù)甲狀腺癌致病基因的組合性分子標(biāo)志物的靶向二代測序可提高甲狀腺惡性腫瘤的診斷率，成功的彌補(bǔ)了目前甲狀腺細(xì)胞學(xué)診斷的不足，并指導(dǎo)甲狀腺結(jié)節(jié)患者的診療得以完善，避免了非必須的診斷性手術(shù)對社會的醫(yī)療資源的浪費(fèi)及病患手術(shù)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，本研究的結(jié)果為基因診斷在臨床實(shí)踐中發(fā)揮作用提供了新的思路。實(shí)施例1甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性相關(guān)的基因多態(tài)性位點(diǎn)的篩選和鑒定樣本說明：甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞，抽提rna,反轉(zhuǎn)錄得到cdna文庫。具體實(shí)施步驟：步驟(1)：根據(jù)可能的甲狀腺癌致病基因，包括突變基因及融合基因，根據(jù)ucscgenomebrowser中g(shù)rch37/hg19中的基因序列，明確基因在染色體位置、編碼、基因大小以及假基因情況等。步驟(2)：根據(jù)accessarraytmsystem擴(kuò)增的要求(目標(biāo)序列大小240bp,存在重疊)，設(shè)計(jì)引物，并加入標(biāo)簽序列。步驟(3)：引物合成后，進(jìn)行稀釋，按accessarraytmsystem擴(kuò)增要求，配制引物混合物，分于96孔板。步驟(4)：擴(kuò)增模板的制備,定量到50ng/ul(不足50ng/ul以50ng/ul記)，配制模板混合物，分于96孔板。步驟(5)：用排槍將96孔板里引物和模板吸到48.48accessarrayifc芯片上。步驟(6)：將芯片放進(jìn)pre-pcrifccontrollerax儀器里，引物和模板自動混合，并利用fc1cycler儀器進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)。步驟(7)：利用post-pcrifccontrollerax儀器進(jìn)行pcr產(chǎn)物匯集和收獲(注意收獲時(shí)需要更換房間操作，以防污染)步驟(8)：準(zhǔn)備barcode混合物加入1：100稀釋產(chǎn)物，進(jìn)行pcr反應(yīng)。步驟(9)：磁珠純化產(chǎn)物，跑膠確認(rèn)barcode加上后，準(zhǔn)備上機(jī)測序。步驟(10)：nextseq500上機(jī)測序，利用bwa,samtools和gatk軟件對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。步驟(11)：所測得的snv以及indel經(jīng)過annovar(http://annovar.openbioinformatics.org/)功能注釋和公共數(shù)據(jù)庫(exac,1000genomes,dbsnpandclinvar)過濾。步驟(12)：符合①雙復(fù)孔snv,alldepth>20,vaf>0.3；②單孔snv,alldepth>1000,vaf>0.4；③雙復(fù)孔snv,單孔測的不好，復(fù)孔測的好的(alldepth>1000)標(biāo)準(zhǔn)的snv經(jīng)sanger測序進(jìn)行證實(shí)。步驟(13)：符合①雙復(fù)孔indel,除去snp；②單孔indel,alldepth>25,vaf≥0.4,除去snp標(biāo)準(zhǔn)的indel經(jīng)sanger測序進(jìn)行證實(shí)。本發(fā)明適用于甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷的分子檢測，彌補(bǔ)了該領(lǐng)域的不足與缺失，其原理為本發(fā)明在目前已報(bào)道的甲狀腺癌發(fā)病相關(guān)致病基因中，通過massarrayassaydesign軟件設(shè)計(jì)引物，在48.48accessarrayifc上，進(jìn)行靶向基因多重pcr擴(kuò)增后，進(jìn)行二代測序分析，使針對該疾病的高通量更大覆蓋面的基因診斷成為可能。通過對123例患者的研究，發(fā)現(xiàn)19個(gè)基因中有11個(gè)基因測到突變(表2)，檢測到3種融合基因(表3)，包含了115種突變，診斷率高于93％。進(jìn)一步可將更多的中國人群中甲狀腺癌的驅(qū)動基因及融合基因匯聚在一個(gè)診斷panel中，可以更高效、快速地進(jìn)行大量樣本的基因檢測。本發(fā)明十分適用于中國人群甲狀腺結(jié)節(jié)患者，可彌補(bǔ)該領(lǐng)域的不足與缺失，十分具有實(shí)用價(jià)值。表2表3融合基因名稱序列信息突變患者數(shù)etv6-ntrk3etv6{enst00000396373}:r.1_737_ntrk3{enst00000394480}:r.1719_1998410ncoa4-retncoa4{enst00000452682}:r.1_1014_ret{enst00000355710}:r.2369_56593ccdc6-retccdc6{enst00000263102}:r.1_535_ret{enst00000355710}:r.2369_56592對本發(fā)明的基因突變的組織特異性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，本發(fā)明的各突變位點(diǎn)具有優(yōu)異的組織特異性，突變特異性的在甲狀腺癌組織中有檢出，在正常體細(xì)胞中很少有檢出，僅在1例甲狀腺腺瘤中檢測到有nras基因上的q61k的突變。值得注意的是，雖然甲狀腺腺瘤是良性疾病，但腺瘤的病理形態(tài)有時(shí)和甲狀腺乳頭狀癌很相似，因此單靠病理有時(shí)可能發(fā)生診斷誤差，具體結(jié)果如下表4所示：表4ta,甲狀腺腺瘤(thyroidadenoma)ng,結(jié)節(jié)性甲狀腺腫(nodulargoiter)ptc,甲狀腺乳頭狀癌(papillarythyroidcarcinoma)ftc,甲狀腺濾泡癌(follicularthyroidcarcinoma,包含在ptc中)mtc,甲狀腺髓樣癌(medullarythyroidcarcinoma)pdtc,低分化甲狀腺癌(poorlydifferentiatedthyroidcancer)atc,未分化甲狀腺癌(anaplasticthyroidcarcinoma)實(shí)施例2試劑盒的制備和效果驗(yàn)證本實(shí)施例提供了一種檢測甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的試劑盒。本試劑盒可對上表2中的突變位點(diǎn)和上表3中的融合基因進(jìn)行基因突變檢測：試劑盒主要試劑：(1)多態(tài)位點(diǎn)擴(kuò)增引物上游引物(f)和下游引物(r)(massarrayassaydesign軟件設(shè)計(jì))；(2)多態(tài)位點(diǎn)測序引物測序引物(s)(根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法設(shè)計(jì))；(3)pcr主要試劑：pfu高保真酶，10×pcrbuffer，dntpmixtur，ddh2o；(4)焦磷酸測序主要試劑：70％乙醇溶液，磁珠，變性緩沖液，退火緩沖液，結(jié)合緩沖液，洗滌緩沖液，底物(asp,熒光素)，酶混合溶液(dna聚合酶、熒光素酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶)，a/t/c/g堿基。使用本實(shí)施例提供的試劑盒，對300例甲狀腺結(jié)節(jié)患者進(jìn)行檢測，具體方法參考實(shí)施例1，共檢出了176例患者攜帶本發(fā)明的基因突變，最后通過臨床常規(guī)方法確認(rèn)甲狀腺癌患者為184例，檢出率高達(dá)95％以上，具體檢測結(jié)果見表5。表5300例甲狀腺癌患者靶向基因二代測序的結(jié)果在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>上海安甲生物科技有限公司<120>與甲狀腺癌相關(guān)的基因多態(tài)性位點(diǎn)及其應(yīng)用<130>p2017-0424<160>18<170>patentinversion3.5<210>1<211>80<212>dna<213>人<220><221>misc_feature<222>(39)..(39)<223>n=t,或a<400>1cctcacagtaaaaataggtgattttggtctagctacagngaaatctcgatggagtgggtc60ccatcagtttgaacagttgt80<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2ggagccttgtatatagacgg20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3tgtatgttctaacaggcacc20<210>4<211>60<212>dna<213>人<220><221>misc_feature<222>(30)..(30)<223>n=t，或c<400>4atagcaagtcatttgcggatattaacctcnacagggagcagattaagcgagtaaaagact60<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5caagaaaccatatgctcacc20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6ttggattgtgtccgttgagc20<210>7<211>69<212>dna<213>人<220><221>misc_feature<222>(34)..(34)<223>n=c，或a<400>7gcccaacagcgccggagcttccttaacgcccacaccgctccggcgcccaggtattccctg60agtcccccg69<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8agaggccgccaccgtgttat20<210>9<211>19<212>dna<213>人工序列<400>9aggcctcgccatcattctc19<210>10<211>80<212>dna<213>人<220><221>misc_feature<222>(36)..(36)<223>n=a，或g<400>10tgaactgattgaaaactcccatctaaccccaaagangcaaggccaaatctcagaagagta60tatgcaaacggttttgtaag80<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11aggcaactatgttgagcgtc20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12tatgccatcaccttcgccat20<210>13<211>68<212>dna<213>人<220><221>misc_feature<222>(30)..(30)<223>n=a,，或g<400>13gaaggatcagatcaccagtggaaaatacancttcattcctgaagtctgggcagaagtctc60agagaaag68<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14tcccaccacagcacatacac20<210>15<211>21<212>dna<213>人工序列<400>15cttttcctttctctctctacc21<210>16<211>70<212>dna<213>人<220><221>misc_feature<222>(35)..(35)<223>n=c,或無<400>16ctgaacaggctatggaacttctggactgtaattanccagatcctatggttcgaggttttg60ctgttcggtg70<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列<400>17cacaaactagagtcacacac20<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列<400>18gcacgattcttttagatctg20當(dāng)前第1頁12