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      一種基于定量PCR技術(shù)的GSTT1分型檢測(cè)方法與流程

      文檔序號(hào):11246410閱讀:2217來(lái)源:國(guó)知局

      本發(fā)明涉及基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域,具體是一種基于定量pcr技術(shù)的gstt1分型檢測(cè)方法。



      背景技術(shù):

      gstt1為一種重要的代謝酶,參與對(duì)內(nèi)生和外源性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和代謝,賦予代謝物新的生物學(xué)特性。在人類(lèi)gstt1具有多態(tài)性,gstt1缺失為一種常見(jiàn)的基因型。不同gstt1基因型的個(gè)體地物質(zhì)的轉(zhuǎn)化功能存在差異。gstt1基因分型用于多種生物學(xué)性狀的研究。傳統(tǒng)的,由于gstt1缺失多態(tài)性可以通過(guò)普通pcr檢測(cè),多采用常規(guī)基因特異性pcr,瓊脂糖電泳檢測(cè)方式確認(rèn)gstt1基因型。雖然簡(jiǎn)便,但是由于電泳操作必須開(kāi)管加樣和電泳,容易造成實(shí)驗(yàn)室污染,難于在高通量下確保實(shí)驗(yàn)可靠性。同時(shí)常規(guī)pcr電泳分析法也難于發(fā)現(xiàn)雜合子基因型,影響基因性狀分析的準(zhǔn)確定。



      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

      本發(fā)明的目的在于提供一種避免有毒dna染色劑污染、提高檢測(cè)通量的基于定量pcr技術(shù)的gstt1分型檢測(cè)方法,以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

      為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:

      一種基于定量pcr技術(shù)的gstt1分型檢測(cè)方法,具體步驟如下:

      (1)采用二代測(cè)序驗(yàn)證的人gstt1正常純合子、雜合子和缺失純合子基因組dna作為相應(yīng)對(duì)照物;

      (2)采用gstt1基因特異性的引物seq1和seq2擴(kuò)增gstt1基因片段,同時(shí)在gstt1基因特異性的引物界定的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)gstt1基因特異性taqman探針seq3-fam;若存在gstt1基因,則gstt1基因特異性taqman探針seq3-fam釋放fam熒光信號(hào)而被定量pcr儀器檢到;若沒(méi)有g(shù)stt1片段,則無(wú)gstt1擴(kuò)增,無(wú)fam熒光信號(hào)釋放;

      (3)采用albumin特異性的pcr引物seq4和seq5擴(kuò)增albumin基因片段,同時(shí)在albumin基因特異性的引物界定的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)albumin基因特異性taqman探針seq6-vic;若存在合格樣本,則有albumin擴(kuò)增,釋放vic熒光信號(hào),定量pcr儀器檢測(cè)到vic熒光信號(hào);若樣本不合格,則樣本無(wú)albumin擴(kuò)增,無(wú)vic熒光信號(hào)釋放;

      (4)對(duì)比擴(kuò)增fam/vic信號(hào)確認(rèn)待檢測(cè)樣本基因型;

      所述引物seq1的核苷酸序列號(hào)如下:tctgtggtccccaaatcaga;

      所述引物seq2的核苷酸序列號(hào)如下:ctgtggggaaaagggtacag;

      所述gstt1基因特異性taqman探針seq3-fam的核苷酸序列號(hào)如下:

      vic-5′-tgctgcccatccctgccctcacaacca;

      所述引物seq4的核苷酸序列號(hào)如下:5′-actccaaacctgatgcttct-3′;

      所述引物seq5的核苷酸序列號(hào)如下:5′-ccttagggcagaattatcca-3′;

      所述albumin基因特異性taqman探針seq6-vic的核苷酸序列號(hào)如下:

      fam-5′-cagcctgttgccccttttagagttcctttt-3′。

      作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案:所述步驟(1)中人gstt1正常純合子、雜合子和缺失純合子基因組dna的濃度為10ng/μl。

      與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果是:

      本發(fā)明采用基于taqman探針的定量pcr實(shí)現(xiàn)閉管一次檢測(cè)確定gstt1基因拷貝數(shù)的目的,解決了常規(guī)gstt1檢測(cè)需要pcr后開(kāi)管電泳,而容易引起實(shí)驗(yàn)室內(nèi)pcr產(chǎn)物污染,難于高通量穩(wěn)定獲得準(zhǔn)確基因分型結(jié)果的問(wèn)題,同時(shí)簡(jiǎn)化了pcr檢測(cè)方法,防止電泳檢測(cè)方法的操作過(guò)程復(fù)雜、存在潛在dna染料等環(huán)境污染危險(xiǎn)以及人為結(jié)果誤判的可能;可以有效預(yù)防pcr產(chǎn)物污染,避免有毒dna染色劑污染,可以大大簡(jiǎn)化檢測(cè)與結(jié)果分析過(guò)程,提高檢測(cè)通量;另外,本發(fā)明也建立一種定量機(jī)制,提供鑒定發(fā)現(xiàn)雜合子的技術(shù)路線(xiàn)。

      附圖說(shuō)明

      圖1為本發(fā)明實(shí)施例中albumin基因擴(kuò)增和gstt1特異性片段擴(kuò)增曲線(xiàn)示意圖。

      具體實(shí)施方式

      下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本專(zhuān)利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明。

      請(qǐng)參閱圖1,一種基于定量pcr技術(shù)的gstt1分型檢測(cè)方法,具體步驟如下:

      (1)采用二代測(cè)序驗(yàn)證的濃度為10ng/μl的人gstt1正常純合子、雜合子和缺失純合子基因組dna作為相應(yīng)對(duì)照物;

      (2)采用gstt1基因特異性的引物seq1和seq2擴(kuò)增gstt1基因片段,同時(shí)在gstt1基因特異性的引物界定的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)gstt1基因特異性taqman探針seq3-fam;若存在gstt1基因,則gstt1基因特異性taqman探針seq3-fam釋放fam熒光信號(hào)而被定量pcr儀器檢到;若沒(méi)有g(shù)stt1片段,則無(wú)gstt1擴(kuò)增,無(wú)fam熒光信號(hào)釋放;

      (3)采用albumin特異性的pcr引物seq4和seq5擴(kuò)增albumin基因片段,同時(shí)在albumin基因特異性的引物界定的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)albumin基因特異性taqman探針seq6-vic;若存在合格樣本,則有albumin擴(kuò)增,釋放vic熒光信號(hào),定量pcr儀器檢測(cè)到vic熒光信號(hào);若樣本不合格,則樣本無(wú)albumin擴(kuò)增,無(wú)vic熒光信號(hào)釋放;

      (4)對(duì)比擴(kuò)增fam/vic信號(hào)確認(rèn)待檢測(cè)樣本基因型;

      所述引物seq1的核苷酸序列號(hào)如下:tctgtggtccccaaatcaga;

      所述引物seq2的核苷酸序列號(hào)如下:ctgtggggaaaagggtacag;

      所述gstt1基因特異性taqman探針seq3-fam的核苷酸序列號(hào)如下:

      vic-5′-tgctgcccatccctgccctcacaacca;

      所述引物seq4的核苷酸序列號(hào)如下:5′-actccaaacctgatgcttct-3′;

      所述引物seq5的核苷酸序列號(hào)如下:5′-ccttagggcagaattatcca-3′;

      所述albumin基因特異性taqman探針seq6-vic的核苷酸序列號(hào)如下:

      fam-5′-cagcctgttgccccttttagagttcctttt-3′。

      本發(fā)明基于基因特異性pcr結(jié)合taqman探針判斷基因片段存在時(shí)學(xué)界一致認(rèn)為可靠的技術(shù)方法。采用albumin基因?qū)φ諗U(kuò)增也是學(xué)界一致認(rèn)為的提示樣本質(zhì)量和相對(duì)定量的參照體系。本發(fā)明采用的技術(shù)方案采用gstt1特異性的基因擴(kuò)增和taqman探針,同時(shí)采用對(duì)照albumin基因?qū)φ諗U(kuò)增可以明確gstt1基因分型結(jié)果?;趖aqman探針定量pcr方法不需要開(kāi)管電泳,可以有效預(yù)防pcr產(chǎn)物污染,避免有毒dna染色劑污染,可以大大簡(jiǎn)化檢測(cè)與結(jié)果分析過(guò)程,提高檢測(cè)通量。

      實(shí)施例1

      (1)測(cè)試用正常人基因組dna制備:采取正常人口腔咽拭子,chlex100抽提制備,正常人基因組dna濃度稀釋到10ng/μl;

      (2)pcr特異性引物和探針設(shè)計(jì)合成:根據(jù)人gstt1基因序列設(shè)計(jì)合成基因特異性引物seq1,seq2和gstt1特異性taqman基因探針標(biāo)記fam;依據(jù)人albumin基因設(shè)計(jì)內(nèi)參基因特異性pcr引物seq4,seq5和探針seq6標(biāo)記vic;

      (3)gstt1定量pcr檢測(cè):

      1)引物探針混合物配置:

      2)反應(yīng)體系:引物探針混合物1.5μl,2倍tiantoughgenotypingqpcrpremix(probe)12.5μl,標(biāo)準(zhǔn)模板1.5μl,ddh2o9.5μl。

      3)定量pcr儀:abi7500

      4)反應(yīng)條件:95℃、2min;95℃、15s---60℃、32s,42循環(huán)。

      (4)基因驗(yàn)證結(jié)果讀取:

      參見(jiàn)圖1,圖1是人gstt1正常檢測(cè)結(jié)果,albumin基因擴(kuò)增曲線(xiàn),gstt1特異性片段擴(kuò)增曲線(xiàn),橫坐標(biāo)是以0-42的偶數(shù)標(biāo)示的循環(huán)數(shù),縱坐標(biāo)是相應(yīng)的熒光信號(hào)。

      檢測(cè)到vic、fam信號(hào)確定為擴(kuò)增成功;樣本fam/vic與三個(gè)對(duì)照樣本之一擴(kuò)增fam/vic比值為3-6,確定為對(duì)應(yīng)對(duì)應(yīng)基因型;無(wú)法對(duì)應(yīng)三個(gè)樣本之一或者對(duì)應(yīng)多個(gè)則實(shí)驗(yàn)失敗.

      上面對(duì)本專(zhuān)利的較佳實(shí)施方式作了詳細(xì)說(shuō)明,但是本專(zhuān)利并不限于上述實(shí)施方式,在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識(shí)范圍內(nèi),還可以在不脫離本專(zhuān)利宗旨的前提下作出各種變化。

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