本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種具有抗菌抗炎活性的多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：抗菌多肽是生物體合成的一類(lèi)小分子防御多肽，具有廣譜殺菌作用，對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均有較強(qiáng)的殺滅作用，對(duì)某些真菌、支原體，尤其對(duì)耐藥性細(xì)菌也都有很好的殺滅作用，是動(dòng)物固有免疫系統(tǒng)的重要成員。一般的抗生素是通過(guò)阻斷生物大分子的生物合成來(lái)發(fā)揮作用，而抗菌多肽可以在細(xì)菌細(xì)胞膜上穿孔而形成離子性通道，造成細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，引起胞內(nèi)水溶性物質(zhì)大量滲出，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。隨著傳統(tǒng)抗生素的廣泛使用，許多病原菌已經(jīng)產(chǎn)生耐藥性，因此，活性多肽在抗菌方面就有明顯優(yōu)勢(shì)。現(xiàn)有技術(shù)中，科學(xué)工作者們已經(jīng)從細(xì)菌、真菌、高等植物、無(wú)脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物乃至人體中發(fā)現(xiàn)并分離獲得上千種具有抗菌活性的多肽。比如大豆生物活性多肽lunasin是從大豆中分離鑒定的一個(gè)天然多肽，分子量約為5kda，全長(zhǎng)43個(gè)氨基酸殘基，將此基因轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，能阻斷有絲分裂并引起染色體斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，研究表明，lunasin具有抗結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌的功能，還具有抗炎作用，對(duì)巨細(xì)胞具有抗氧化作用。然而天然分離的活性多肽lunasin存在含量低、活性較低的缺陷，不利于分離純化，限制了其應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供的一種具有抗菌抗炎活性的多肽及其應(yīng)用，對(duì)現(xiàn)有多肽lunasin結(jié)構(gòu)進(jìn)行改進(jìn)，在細(xì)胞中高效表達(dá)，易于分離純化，活性較高。本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種具有抗菌抗炎活性的多肽，所述多肽的核苷酸序列如seqidno.1所示，氨基酸序列如seqidno.2所示。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的多肽制備的重組載體，所述重組載體是將如seqidno.1所述的核苷酸序列插入質(zhì)粒pet-32a(+)中得到的。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種包含權(quán)利要求2所述的重組載體的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種權(quán)利要求1所述的多肽在抑制lps引起的炎癥反應(yīng)中的應(yīng)用。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種權(quán)利要求1所述的多肽在抗痤瘡丙酸桿菌中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種具有抗菌抗炎活性的多肽及其應(yīng)用，具有以下有益效果：g-lunasin是對(duì)現(xiàn)有多肽lunasin氨基酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行改進(jìn)，利用第32-37位grdgrd的作用使g-lunasin進(jìn)入目的細(xì)胞核內(nèi)，提高與目的細(xì)胞的結(jié)合效率，與天然lunasin相比，促進(jìn)高效表達(dá)，增加生物活性。grdgrd后添加h氨基酸，在不影響多肽活性的基礎(chǔ)上，增加其與親和ni柱的結(jié)合效率，便于分離純化。附圖說(shuō)明圖1為凝膠回收后目的基因片段和質(zhì)粒片段的電泳圖譜；其中，m泳道為dnamaker，1號(hào)泳道為目的基因片段，2號(hào)泳道為質(zhì)粒片段；圖2為陽(yáng)性克隆經(jīng)xbai和psti雙酶切鑒定圖譜；其中，m泳道為dnamaker，1號(hào)泳道為雙酶切后的空質(zhì)粒，2號(hào)泳道為雙酶切后的重組質(zhì)粒；圖3為sds-page電泳檢測(cè)結(jié)果；其中，m泳道為dnamaker，1號(hào)泳道為g-lunasin多肽表達(dá)產(chǎn)物。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法，下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明提供的一種具有抗菌抗炎活性的多肽(下文稱(chēng)g-lunasin)，所述多肽的核苷酸序列如seqidno.1所示，氨基酸序列如seqidno.2所示，該多肽是對(duì)活性多肽lunasin的氨基酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行改進(jìn)，在如seqidno.3所示的lunasin氨基酸序列中添加氨基酸殘基，增加原有l(wèi)unasin的活性和在細(xì)胞中的表達(dá)效率，減少其分離純化的難度。基于同一種發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種g-lunasin的制備方法，包括以下步驟：s1，構(gòu)建重組載體將如seqidno.2所示的核苷酸序列的一端添加ndei的酶切位點(diǎn)，另一端添加xhoi的酶切位點(diǎn)，得到目的基因，插入到puc57質(zhì)粒中保存，得到重組質(zhì)粒puc57-g-lunasin。用ndei、xhoi雙酶切重組質(zhì)粒puc57-g-lunasin，酶切體系如表1所示，酶切條件為37℃，2h，凝膠回收帶有g(shù)-lunasin核苷酸序列的目的基因片段；用ndei、xhoi雙酶切質(zhì)粒pet-32a(+)，酶切體系如表2所示，酶切條件為37℃，2h，凝膠回收序列較長(zhǎng)的質(zhì)粒片段；圖1是凝膠回收后目的基因片段和質(zhì)粒片段的電泳圖譜，其中，m泳道為dnamaker，1號(hào)泳道為目的基因片段，2號(hào)泳道為質(zhì)粒片段，條帶清晰，無(wú)雜帶。將目的基因片段和質(zhì)粒片段經(jīng)t4連接酶連接過(guò)夜，連接體系如表3所示，構(gòu)建得到重組載體puc57-g-lunasin-pet-32a。質(zhì)粒pet-32a(+)廣泛應(yīng)用于融合蛋白、多肽的表達(dá)，并且?guī)в薪M氨酸標(biāo)簽等，便于下游多肽蛋白的分離純化。表1重組質(zhì)粒puc57-g-lunasin的酶切體系表2質(zhì)粒pet-32a(+)的酶切體系質(zhì)粒pet-32a(+)(30ng/μl)40μlndei3μlxhoi2μl10×buffer5μl總體系50μl表3連接體系試劑名稱(chēng)使用量目的基因片段(30ng)6μl10×t4dnaligasebuffer2μl質(zhì)粒片段(50ng)5μlt4dnaligase(5u/μl)1μlddh2o20μls2，轉(zhuǎn)化，制備表達(dá)工程菌將重組載體puc57-g-lunasin-pet-32a的轉(zhuǎn)化入大腸桿菌dh5αde3感受態(tài)細(xì)胞，選取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子作為表達(dá)工程菌，轉(zhuǎn)化方法采用常規(guī)轉(zhuǎn)化方法即可。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選也按照常規(guī)方法進(jìn)行。挑取陽(yáng)性克隆經(jīng)xbai和psti雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示重組載體構(gòu)建正確。s3，多肽表達(dá)、純化s31，將表達(dá)工程菌接種到lb(amp抗性)培養(yǎng)基中，37℃，220rpm震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得到種子液，次日將種子液按照2％的體積比例轉(zhuǎn)入新鮮的lb(amp抗性)培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至od600＝0.6，然后加入iptg，使iptg的終濃度為0.1mm，30℃，220rpm震蕩培養(yǎng)4h，得到多肽表達(dá)菌液；取多肽表達(dá)菌液1ml，5000rpm、4℃離心5min，收集菌體；iptg誘導(dǎo)表達(dá)后，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)sds-page電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，其中，m泳道為dnamaker，1號(hào)泳道為g-lunasin表達(dá)產(chǎn)物，6kda附近可見(jiàn)清晰的條帶。s32，取1g菌體，加入相當(dāng)于菌體質(zhì)量5％的bingdingbuffer溶液a(20mm磷酸鹽，0.5m氯化鈉，5mm咪唑，ph7.4)和pmsf。pmsf用無(wú)水乙醇配制成100mm的儲(chǔ)存液，pmsf的工作濃度為1mm。加入bingdingbuffer溶液a和pmsf重懸細(xì)胞沉淀，加入溶菌酶(工作濃度為0.3mg/ml)，混勻，冰上放置30min。400w冰上超聲破碎細(xì)胞，超聲5s停5s，反復(fù)40次。加入10％tritonx-100，使終濃度為0.05％，混勻，冰上放置15min。12000rmp、4℃離心20min，取上清，并用0.22μm膜過(guò)濾上清，得到過(guò)濾液，冰上保存?zhèn)溆?。s33，將nisepharose樹(shù)脂裝入合適的層析柱，用相當(dāng)于過(guò)濾液10倍體積的洗脫液分離，經(jīng)bingdingbuffer溶液a(含50mmolnah2po4、5mmol咪唑、500mmolnacl，溶劑為雙蒸水，ph至7.4)、溶液b(含50mmolnah2po4、20mmol咪唑、500mmolnacl，溶劑為雙蒸水，ph至7.4)、溶液c(含50mmolnah2po4、60mmol咪唑、500mmolnacl，溶劑為雙蒸水，ph至7.4)、溶液d(含50mmolnah2po4、100mmol咪唑、300mmolnacl，溶劑為雙蒸水，ph至7.4)洗脫，流速為12-15ml/h分別收集洗脫液，經(jīng)鑒定洗脫液d中g(shù)-lunasin的純度達(dá)98.3％％，含量達(dá)0.05g/ml，而該方法提取的天然lunasin的純度為90.3％％，含量為0.03g/ml。一、g-lunasin毒性檢測(cè)分別配制0、10μm、30μm、60μm的g-lunasin溶液，刺激巨噬細(xì)胞raw264.7，加藥24h后mtt檢測(cè)刺激巨噬細(xì)胞活性，結(jié)果分別為100％、104％、110％、98％，結(jié)果表明0-60μm的g-lunasin多肽溶液對(duì)巨噬細(xì)胞病毒無(wú)毒性。二、g-lunasin對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基中no濃度的影響以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，24h后檢測(cè)no細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)中no產(chǎn)量為2.4μm。以1μg/ml的lps作為陽(yáng)性對(duì)照組，刺激巨噬細(xì)胞raw264.7，24h后檢測(cè)no細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)中no產(chǎn)量為5.5μm。然后我們分別向4個(gè)lps刺激的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)中加入10μm、30μm、60μm的g-lunasin溶液、100μm的天然lunasin溶液，24h后檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)中no分別濃度為4.5μm、4.3μm、4.1μm、4.8μm。說(shuō)明g-lunasin溶液能夠顯著降低lps引起的no升高現(xiàn)象，具有良好的生物學(xué)活性，能夠有效抑制lps引起的炎癥反應(yīng)，且g-lunasin比天然lunasin溶液效果更顯著。三、g-lunasin抗菌效果于大鼠耳廓中央給予痤瘡丙酸桿菌菌懸液50μl皮內(nèi)注射成功構(gòu)建大鼠痤瘡模型后，痤瘡模型a組不給予任何治療；b組皮損處給予克林霉素0.1％溶液外用治療；c組皮損處給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05％g-lunasin溶液外用治療。對(duì)照組不注射大鼠耳廓中央給予痤瘡丙酸桿菌菌懸液。三組大鼠注射部位皮膚于注射24h時(shí)開(kāi)始增厚，并逐漸增加，于第5天出現(xiàn)粉刺、丘疹、膿皰等痤瘡樣皮損，色紅，質(zhì)硬；b、c組處理2周后，膿腫基本消退，厚度變薄，顏色趨于正常。取各組大鼠右耳部注射部位皮膚組織，he染色發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的大鼠左耳皮膚表皮較薄，可見(jiàn)毛囊，表皮、真皮交界清楚；a組表皮角化過(guò)度，毛囊面積擴(kuò)大，炎性細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)；b、c組毛囊角化明顯減輕，真皮層可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞。說(shuō)明g-lunasin溶液具有良好的抗菌效果。b、c組大鼠未觀察到毒副反應(yīng)。盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。序列表<110>河南工程學(xué)院<120>一種具有抗菌抗炎活性的多肽及其應(yīng)用<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>141<212>dna<213>人工序列<400>1tccaaatggcagcaccagcaagacagctgccgcaagcagctccagggggtgaacctcacg60ccttgcgagaagcacatcatggagaagatccaaggccgcggcggccgcggccacgatgac120gatgatgatgatgacgacgac141<210>2<211>47<212>prt<213>人工序列<400>2serlystrpglnhisglnglnaspsercysarglysglnleuglngly151015valasnleuthrprocysglulyshisilemetglulysileglngly202530argaspglyargasphisaspaspaspaspaspaspaspaspasp354045<210>3<211>43<212>prt<213>大豆<400>3serlystrpglnhisglnglnaspsercysarglysglnleuglngly151015valasnleuthrprocysglulyshisilemetglulysileglngly202530argaspaspaspaspaspaspaspaspaspasp3540當(dāng)前第1頁(yè)12