本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體指n15多肽在制備真菌抑制劑中的用途。

背景技術(shù)：

真菌可引起動植物的多種病害，不僅影響農(nóng)作物產(chǎn)量、經(jīng)濟動物生長生產(chǎn)，造成極大的經(jīng)濟損失，而且影響人體健康，威脅人類生命安全。為了抑制和消滅病原真菌，人們一直致力于尋找有效的抗真菌藥物。紅色毛癬菌是毛癬菌屬下的一個種。紅色毛癬菌是一種人源的皮癬菌，引起常見的皮膚淺部真菌病，如手癬、足癬、頭癬等。近二十年來，由皮膚癬菌及其他真菌引起的感染明顯增多。目前發(fā)現(xiàn)有四十余種皮膚癬菌主要有紅色毛癬菌，須癬毛癬菌，犬小孢子菌等。紅色毛癬菌(trichophytonrubrum)屬于有絲分裂孢子真菌，ichangjiande親人性治病性皮膚癬菌。為世界性分布，也是我國最常見的一種皮膚癬菌。

酵母菌是真菌中比較有代表性的一類，它是子囊菌、擔子菌等幾科單細胞真菌的通稱，可用于釀造生產(chǎn)，有的為致病菌。酵母菌是某些種類的真菌(真菌自然地存在于身體之內(nèi))。然而體內(nèi)真菌過多也會造成問題，酵母菌感染可能會發(fā)生在身體的任何部位，主要是因為病人免疫力低下，導致體內(nèi)菌群失衡引起的，瘙癢、灼痛是酵母菌感染的主要癥狀。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種多肽，該多肽能夠抑制多種真菌，包括酵母菌生長，具有在制備真菌抑制劑中的用途，它已被現(xiàn)有技術(shù)公開，名為n15多肽。

n15多肽是一個具有15個氨基酸的短肽，其序列為甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天門冬氨酸-脯氨酸，它具有多種生物學功能，包括調(diào)節(jié)nf-κb轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合目的基因的能力，影響nf-κb目的基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和表達；阻斷pcna結(jié)合dna聚合酶，從而阻止細胞dna合成抑制細胞增殖；抑制上皮細胞增生，調(diào)節(jié)表皮增生及分化，使皮膚角化過程正常化等。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在研究中發(fā)現(xiàn)n15多肽能夠?qū)Ω鞣N真菌的生長產(chǎn)生抑制作用。

前期研究表明，在酵母中加入n15會起到抑制酵母增殖的效果。通過檢測酵母細胞內(nèi)dna含量發(fā)現(xiàn)，n15會引起酵母細胞內(nèi)的dna含量的減少，因此n15抑制酵母細胞的增殖可能是通過抑制基因組dna復制而實現(xiàn)的。此外，我們的結(jié)果顯示n15多肽還可以抑制紅色毛癬菌、白色念珠菌的增殖。

本發(fā)明還提供了一種n15多肽制備的抗真菌藥物，為n15多肽的水溶液，濃度大于等于500μg/ml。

本發(fā)明的有益效果：n15多肽是一種結(jié)構(gòu)清晰，易于工業(yè)化生產(chǎn)的多肽，它可以抑制酵母、白色念珠菌、紅色毛癬菌等多種真菌的增殖，效果好且無毒副作用。

附圖說明

圖1為n15對釀酒酵母的生長抑制實驗的效果對比照片。

圖2為流式細胞儀檢測n15對釀酒酵母dna含量的影響。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實驗例對本發(fā)明作進一步的論證說明，以下實驗例僅是對本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實驗例。

實驗例1：n15對釀酒酵母的生長具有抑制作用

實驗方法：

在35mm直徑的培養(yǎng)皿中制備yepd培養(yǎng)基固體平板，再將n15涂布在固體平板上(n15的終濃度為2mg/ml)。取過夜培養(yǎng)的飽和釀酒酵母菌液，用生理鹽水，倍比稀釋到10^-4濃度，取菌液50μl加入到固體平板中，用無菌玻璃棒涂布均勻，30度培養(yǎng)48小時，觀察實驗結(jié)果，結(jié)果見圖1。

結(jié)果顯示，平板上可見白色的圓形酵母菌單菌落，邊緣整齊，表面光滑濕潤。和對照酵母菌單菌落相比，加入n15多肽的酵母菌(b1)單菌落直徑明顯偏小，n15對釀酒酵母生長具有抑制效應(yīng)。

實驗例2：n15對釀酒酵母的dna復制具有抑制效應(yīng)

實驗方法：

制備yepd液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)釀酒酵母，并加入n15到y(tǒng)epd液體培養(yǎng)基中，同時設(shè)置不加n15多肽的釀酒酵母作為對照(control)，首先使用α因子對酵母細胞進行細胞周期同步化處理，獲得同步化的酵母細胞。再加入n15多肽(終濃度500μg/ml)，在處理0小時、1小時、2小時、15小時、15.5小時、16小時分別取樣2ml酵母菌體，加入sytox-green染料對酵母細胞dna染色后，使用流式細胞儀進行釀酒酵母細胞的dna相對含量進行測定，結(jié)果見圖2和表1。

表1.n15對釀酒酵母dna復制抑制結(jié)果對照表(釀酒酵母細胞的相對dna含量)

如實驗結(jié)果所示，橫坐標表示單個酵母細胞內(nèi)dna的含量，縱坐標表示酵母細胞數(shù)量。在n15處理2小時內(nèi)，n15處理細胞內(nèi)的dna含量和對照細胞相比沒有顯著性差異，而隨著時間的增加，在n15處理15小時以后，n15處理細胞內(nèi)的dna含量和對照細胞相比明顯減少。該結(jié)果表明n15會引起酵母細胞dna含量的減少。

實驗例3：n15對白色念珠菌的生長具有抑制作用

稱取n15多肽干粉1mg.將其溶解于1ml無菌h2o中，配制成1mg/ml的母液，再以倍比稀釋法稀釋成不同濃度梯度的n15溶液。將不同濃度的n15溶液滴加到無菌濾紙片上.制成n15劑量為100、50、20、10、5、2、0.5(單位μg/片)的藥敏紙片。將白色念珠菌液涂至沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基平板上。將不同劑量的n15藥敏紙片以及pbs空白對照藥敏紙片貼至平扳上，置于28℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，對結(jié)果進行測量。結(jié)果如表2所示。

表2.紙片法n15對白色念珠菌產(chǎn)生的抑菌環(huán)直徑比較表

如結(jié)果所示，在遞減劑量的n15藥敏紙片中，前6個劑量梯度的n15藥敏紙片對其周圍的白色念珠菌均產(chǎn)生了明顯抑菌環(huán)。其中高劑量組n15(100μg/片)藥敏紙片對白色念珠菌的抑菌環(huán)直徑為15±2.3mm，隨著n15多肽的濃度降低，抑菌環(huán)的直徑也逐漸減小，當n15多肽的劑量低于10μg/片時，未出現(xiàn)明顯的抑菌環(huán)。

實驗例4：n15對紅色毛癬菌的生長具有抑制作用

稱取n15多肽干粉1mg.將其溶解于1ml無菌h2o中，配制成1mg/ml的母液，再以倍比稀釋法稀釋成不同濃度梯度的n15溶液。將接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基(pda)上的紅色毛癬菌室溫培養(yǎng)轉(zhuǎn)種2次后，無菌生理鹽水反復沖洗菌落表面，收集菌絲片段和孢子液體，經(jīng)洗滌震蕩，采用血細胞計數(shù)板計數(shù)方法，rpmi-1640做稀釋將懸液調(diào)制成(0.4～5)×10⁴cfu/ml菌懸液備用。1～8孔每孔加0.1ml終濃度藥液，設(shè)陰性對照孔(加菌液不加藥液)，空白對照孔(只加rpmi-1640培養(yǎng)液)，加0.1ml菌懸液，倍比稀釋后得到1.024，0.512，0.256，0.128，0.064，0.032，0.016和0.008mg/ml的8個濃度混合液，室溫孵育7天。

依照下列標準打分：0：肉眼清晰；1：略模糊(80％受抑制)；2：濁度顯著減低(50％受抑制)；3：濁度輕度減低；4：濁度未減低。本實驗取1(略模糊)或2(濁度顯著減低)為判定終點。結(jié)果顯示，n15的mic為500～700μg/ml。

n15多肽的抑菌效果可作用于多種真菌，上述實施例僅為對真菌抑制劑的舉例，挑選了較有代表性的真菌，無法將所有真菌種類的抑制實驗例一一列出，不因此限制本發(fā)明的范圍。