本發(fā)明涉及一種半抗原及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及菊酯類農(nóng)藥半抗原及其制備方法和應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

菊酯類農(nóng)藥具有殺蟲(chóng)譜廣、藥效迅速、對(duì)光和熱穩(wěn)定、藥效時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、公共衛(wèi)生等領(lǐng)域廣泛使用，但其對(duì)生態(tài)系統(tǒng)及人類健康存在危害，尤其對(duì)蜜蜂及水生生物具有高毒性。世界衛(wèi)生組織(who)和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(fao)對(duì)菊酯類農(nóng)藥在蔬果上的殘留制定了嚴(yán)格限量標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)也對(duì)該類農(nóng)藥制定了限量標(biāo)準(zhǔn)(gb2763-2016)。

目前，菊酯類農(nóng)藥的檢測(cè)方法主要是色譜法，包括氣相色譜(gc)、高效液相色譜(hplc)、質(zhì)譜法(ms)及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gc-ms)或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(hplc-ms)等。儀器分析方法具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但費(fèi)用較昂貴，技術(shù)要求高，不適用現(xiàn)場(chǎng)快速篩查大量樣品。

免疫分析法可以彌補(bǔ)以上所有缺點(diǎn)，免疫分析是以抗原與抗體之間特異性識(shí)別和可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的痕量分析方法，由于具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)單、快速、費(fèi)用低和適于現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品篩選等優(yōu)點(diǎn)，已在環(huán)境和食品安全等分析領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。建立小分子化合物的免疫分析方法的關(guān)鍵是能夠制備出對(duì)小分子化合物具有高親和力和高選擇性的抗體，而半抗原的合成又是制備優(yōu)質(zhì)抗體的基礎(chǔ)。半抗原設(shè)計(jì)的關(guān)鍵是盡可能地保留原待測(cè)物質(zhì)的特征結(jié)構(gòu)，并在適當(dāng)?shù)奈恢靡牒线m的連接臂和與載體蛋白偶聯(lián)的活性基團(tuán)。不同結(jié)構(gòu)的連接臂、不同的偶聯(lián)方法或連接臂的引入位置，都影響后續(xù)制備的抗體的靈敏度和特異性。另外，作為家族類化合物，多種菊酯類農(nóng)藥在食品與環(huán)境中的累積毒性是嚴(yán)重的隱含風(fēng)險(xiǎn)，因此合成高效價(jià)、具有菊酯類共同結(jié)構(gòu)特征的通用抗原，制備具有廣譜識(shí)別的抗體成為菊酯類農(nóng)藥免疫分析研究的重點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種菊酯類農(nóng)藥半抗原及其制備方法，以及該半抗原與人血清白蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物作為免疫原免疫動(dòng)物制備的單克隆抗體。經(jīng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證，制備的單克隆抗體對(duì)溴氰菊酯、氯氟氰菊酯、氟胺氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯戊菊酯、苯氯菊酯6種菊酯類農(nóng)藥具有較好的檢測(cè)靈敏度，可以用來(lái)建立菊酯類農(nóng)藥多殘留的免疫學(xué)檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

一種菊酯類農(nóng)藥半抗原，其分子結(jié)構(gòu)式為：

上述菊酯類農(nóng)藥半抗原的制備方法，包括如下步驟：

取[氰基-(3-苯氧基)-甲基]2溴乙酸酯1.0g，加n,n-二甲基甲酰胺溶解，加碳酸氫鈉0.72g，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，?-氨基-2,2-二甲基環(huán)丙烷羧酸0.45g，60℃攪拌反應(yīng)4h；停止反應(yīng)，加水乙酸乙酯萃取，靜置分層，有機(jī)相無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸干，上硅膠柱，石油醚/乙酸乙酯＝1:1洗脫分離，得到環(huán)丙烷羧基菊酯半抗原1.1g，即為菊酯類農(nóng)藥半抗原，收率97.35％。

上述菊酯類農(nóng)藥半抗原在免疫檢測(cè)中的應(yīng)用，具體包括由所述菊酯類農(nóng)藥半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到的菊酯類農(nóng)藥人工抗原，及由所得的菊酯類農(nóng)藥人工抗原免疫動(dòng)物制備的單克隆抗體。

其中所述載體蛋白為鼠血清白蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白或纖維蛋白原。

所述單克隆抗體是由保藏編號(hào)為cgmccno.13842的菊酯類單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株f-3-2分泌產(chǎn)生的，應(yīng)用于菊酯類農(nóng)藥的多殘留免疫檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果在于：

(1)本發(fā)明提供的菊酯類農(nóng)藥半抗原既最大程度地保留了菊酯類農(nóng)藥母核的化學(xué)結(jié)構(gòu)，又通過(guò)化學(xué)合成改造引入了可以與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的—cooh，合成方法簡(jiǎn)單，純度、產(chǎn)率較高；

(2)本發(fā)明制備得到的菊酯類農(nóng)藥人工抗原免疫動(dòng)物得到的單克隆抗體，效價(jià)達(dá)到了2×10⁵，說(shuō)明本發(fā)明合成的抗原具有優(yōu)良的免疫原性，合成抗原過(guò)程中完整地保留了半抗原分子的原始結(jié)構(gòu)；

(3)本發(fā)明提供的單克隆抗體特異性好，與溴氰菊酯的交叉反應(yīng)率為100％，與氯氟氰菊酯的交叉反應(yīng)率為50.9％，與氟胺氰菊酯的交叉反應(yīng)率為103.6％，與氟氯氰菊酯的交叉反應(yīng)率為70.7％，與氯戊聚酯的交叉反應(yīng)率為74.4％，與苯氯菊酯的交叉反應(yīng)率為69.0％，可應(yīng)用于菊酯類農(nóng)藥的多殘留免疫檢測(cè)。

生物材料樣品保藏：一株菊酯類單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱cgmcc，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2017年05月05日，保藏編號(hào)為cgmccno.13842。

附圖說(shuō)明

圖1菊酯類農(nóng)藥半抗原合成路線圖

圖2菊酯類農(nóng)藥半抗原核磁共振氫譜圖

圖3菊酯類農(nóng)藥競(jìng)爭(zhēng)elisa標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

實(shí)施例1：菊酯類農(nóng)藥半抗原合成及鑒定

菊酯類農(nóng)藥半抗原的合成路線如附圖1所示。

取[氰基-(3-苯氧基)-甲基]2溴乙酸酯1.0g，加n,n-二甲基甲酰胺溶解，加碳酸氫鈉0.72g，充分?jǐn)嚢杌靹蚝螅?-氨基-2,2-二甲基環(huán)丙烷羧酸0.45g，60℃攪拌反應(yīng)4h；停止反應(yīng)，加水乙酸乙酯萃取，靜置分層，有機(jī)相無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸干，上硅膠柱，石油醚/乙酸乙酯＝1:1洗脫分離，得到環(huán)丙烷羧基菊酯半抗原1.1g，即為菊酯類農(nóng)藥半抗原，收率97.35％。

取上述半抗原經(jīng)核磁共振氫譜鑒定，結(jié)果見(jiàn)附圖2。¹h-nmr(cdcl3,300mhz)δ：11.00(1h,s,cooh)，7.41(2h,dd,arh)，7.17(1h,dd,arh)，7.14(2h,dd,arh)，7.08(2h,dd,arh)，7.34(2h,dd,arh)，6.25(1h,s,ch)，3.51(2h,s,ch2)，2.0(1h,s,nh)，0.94(6h,s,ch3)，0.57(1h,d,ch)，0.33(1h,d,ch)。圖譜中，化學(xué)位移δ＝11.0的為化合物上羧基氫共振吸收峰，7.08～7.41為苯環(huán)上氫的吸收峰，0.94為兩個(gè)甲基氫的吸收峰，0.33～0.57為三元環(huán)上的兩個(gè)氫吸收峰，結(jié)合其他吸收峰，證明半抗原合成成功。

實(shí)施例2：菊酯類農(nóng)藥人工抗原合成及鑒定

以菊酯類農(nóng)藥半抗原的羧基為活性位點(diǎn)，用混合酸酐法與人血清白蛋白(hsa)偶聯(lián)，制備免疫原；用碳二亞胺法與卵清蛋白(ova)偶聯(lián)，制備包被原。

1.混合酸酐法制備免疫原

取環(huán)丙烷羧基菊酯半抗原24mg，加二甲基亞砜0.5ml溶解，加三乙胺20μl，攪拌混勻，加氯甲酸異丁酯20μl，攪拌30min，得到半抗原活化液a液；取hsa100mg，加0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液溶解，得到b液；將a液逐滴滴加到b液中，室溫?cái)嚢?h，0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液透析3天，每天換液3次，得到免疫原，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.碳二亞胺法制備包被原

取環(huán)丙烷羧基菊酯半抗原10mg，加n,n-二甲基甲酰胺(dmf)0.3ml溶解，加碳二亞胺(edc)13mg，攪拌30min，加n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)13mg，攪拌30min，得到半抗原活化液a液；取ova100mg，加0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液溶解，得到b液；將a液逐滴滴加到b液中，室溫?cái)嚢?h，0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液透析3天，每天換液3次，得到包被原，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

上述方法中也可以采用鼠血清白蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、血藍(lán)蛋白或纖維蛋白原。

3.人工抗原鑒定

將載體蛋白、菊酯類農(nóng)藥半抗原、菊酯類農(nóng)藥半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物用ph7.4的pbs配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/lph7.4的pbs調(diào)零，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)200～800nm范圍內(nèi)掃描，得到載體蛋白、菊酯類農(nóng)藥半抗原、菊酯類農(nóng)藥半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線，并計(jì)算其結(jié)合比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明菊酯類農(nóng)藥半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功，半抗原與hsa的結(jié)合比為(17～21):1，與ova的結(jié)合比為(15～20):1。

實(shí)施例3：?jiǎn)慰寺】贵w制備純化及特性鑒定

1.動(dòng)物免疫

取健康的6～8周雌性balb/c小鼠10只(分為a與b兩組，每組5只)，初次免疫用弗氏完全佐劑乳化后頸背部皮下多點(diǎn)注射，每只小鼠免疫劑量為200μg免疫原；之后加強(qiáng)免疫每?jī)芍茴i背部皮下多點(diǎn)注射一次，乳化用弗氏不完全佐劑；最后一次免疫使用生理鹽水代替弗氏不完全佐劑，采用腹腔注射，注射劑量和前面幾次相同。具體免疫步驟見(jiàn)表1。

表1小鼠免疫程序

第三次、四次、加強(qiáng)免疫后7d，對(duì)小鼠斷尾取血，elisa方法測(cè)定小鼠血清效價(jià)，具體步驟如下：

(1)用0.05mol/lph9.6的碳酸鹽緩沖液將包被原做1:1000稀釋，每孔100μl包被酶標(biāo)板，37℃孵育2h，甩掉包被液，以pbst洗滌1次，拍干；

(2)每孔加入150μl封閉液，37℃反應(yīng)2h后傾去封閉液，拍干；

(3)每孔加入50μl以pbs倍比稀釋的抗血清，25℃反應(yīng)30min后傾去反應(yīng)液，以pbst洗滌3～5次，每次間隔30s，拍干；

(4)加pbs稀釋的酶標(biāo)二抗(1:1000)100μl/孔，25℃反應(yīng)30min，以pbst洗滌3～5次，每次間隔30s，拍干；

(5)每孔加入底物顯色液a液和b液各50μl，25℃避光反應(yīng)15min，每孔加入50μl2mol/l的h2so4溶液終止反應(yīng)；

(6)酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)在450nm的od值，以樣品孔o(hù)d450接近于1的稀釋倍數(shù)作為陽(yáng)性血清的效價(jià)。

2.細(xì)胞融合

(1)飼養(yǎng)細(xì)胞制備：斷頸處死8～10周齡balb/c小鼠，浸泡在75％酒精中5min，隨即放入超凈工作臺(tái)內(nèi)，腹部朝上放于平皿內(nèi)或固定于解剖板上。用眼科鑷子夾起小鼠腹部皮膚，用剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外流和污染。然后用剪刀向上下兩側(cè)做鈍性分離，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器吸取5mlrpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，注入小鼠腹腔，輕輕抽回注射器，晃動(dòng)小鼠腿部和尾部幾次。用原注射器抽回腹腔內(nèi)液體，注入離心管。如此反復(fù)操作3～4次。1000r/min離心10min，棄上清。用20～50ml完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，100μl/孔滴加到培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱備用。

(2)脾細(xì)胞制備：加強(qiáng)免疫后3d，取免疫balb/c小鼠，眼眶采血后脫臼處死，在75％酒精中消毒后取脾臟，去除結(jié)締組織，制備脾細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加rpmi-1640至30ml，1500～2000r/min離心5min，棄上清，加rpmi-1640至30ml，計(jì)數(shù)待用。

(3)骨髓瘤細(xì)胞制備：取3瓶生長(zhǎng)狀態(tài)良好的(活細(xì)胞數(shù)>95％)骨髓瘤細(xì)胞，將之完全吹下，轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加rpmi-1640至30ml，1500～2000r/min離心5min，棄上清，加rpmi-1640至30ml，計(jì)數(shù)待用。

(4)細(xì)胞混合：脾細(xì)胞:骨髓瘤細(xì)胞＝8:1，混合，1500～2000r/min離心5min。

(5)細(xì)胞融合：將混合好的細(xì)胞離心，倒干上清，把沉淀細(xì)胞塊彈成糊狀，置37℃水浴，在1min內(nèi)加入1ml融合劑，融合劑為聚乙二醇(peg)4000，作用2min，并輕輕攪拌細(xì)胞，在隨后4min內(nèi)加入20ml無(wú)血清的peg營(yíng)養(yǎng)液，1000r/min離心10min，棄上清。用20～50ml完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，鋪種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl，置培養(yǎng)箱中。

3.細(xì)胞株篩選

待細(xì)胞長(zhǎng)至孔底的1/2～1/3時(shí)，即可進(jìn)行抗體檢測(cè)。采用elisa方法對(duì)有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔進(jìn)行篩選，篩選分兩步：第一步先用間接elisa篩選出陽(yáng)性細(xì)胞孔，第二步選用多種菊酯類農(nóng)藥為標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測(cè)定。選出對(duì)多種菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均具有較好抑制的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)三次，即可得到能穩(wěn)定分泌菊酯類單克隆抗體的細(xì)胞株f-3-2。該細(xì)胞株已于2017年05月05日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱cgmcc，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為cgmccno.13842。

4.腹水制備

將液體石蠟注射6～8周balb/c小鼠，500μl/只。10天后將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞cgmccno.13842用rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基收集，用血球計(jì)數(shù)板和顯微鏡計(jì)數(shù)，細(xì)胞濃度在1.0×10⁶～1.5×10⁶個(gè)/ml范圍內(nèi)。每只小鼠0.5ml雜交瘤細(xì)胞cgmccno.13842注射到腹腔。注意觀察在一周后小鼠腹部膨大，用無(wú)菌注射器于小鼠腹腔采集腹水，每隔一到兩天采集一次，這樣多次反復(fù)采集直到小鼠自然死亡。4℃下5000r/min離心5min，收集上清，并去掉腹水上層漂浮的脂肪和蛋白質(zhì)膜。

5.抗體純化

單克隆抗體采用辛酸-硫酸銨方法純化，具體步驟如下：

(1)將腹水從-20℃冰箱拿出室溫解凍。腹水用雙層濾紙過(guò)濾，初步除去脂肪片、細(xì)胞碎片及其他雜質(zhì)。12000r/min離心15min，取上清，棄沉淀。精確量腹水體積；

(2)1份體積的腹水與3份體積的醋酸鹽緩沖液磁力攪拌混勻，用2mol/lhcl調(diào)ph至4.5～4.8；

(3)磁力攪拌下緩慢加入正辛酸，1ml腹水加33μl正辛酸，加完后室溫磁力攪拌30min，后置4℃靜置2h；

(4)12000r/min離心5min，取上清，雙層濾紙過(guò)濾，收集濾液；

(5)量取濾液體積，加入1/10體積的0.1mol/lph7.4的pbs，用2mol/lnaoh(記錄naoh體積)調(diào)ph至7.4；

(6)將上清冰浴預(yù)冷，加硫酸銨固體至0.277g/ml，邊加邊攪拌，并于30min內(nèi)加完，置4℃過(guò)夜；

(7)12000r/min離心15min，棄上清。用一定體積的0.01mol/lpbs溶解沉淀。用pb透析兩天后換0.01mol/lpbs透析兩天，收集透析液，12000r/min離心15min，取上清，置-20℃保存。

6.抗體效價(jià)測(cè)定

采用間接elisa方法測(cè)定抗體的效價(jià)為1:200000。具體步驟參考上述1.動(dòng)物免疫中的內(nèi)容。

7.抗體交叉反應(yīng)性測(cè)定

采用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa方法測(cè)定，具體步驟為：

(1)用0.05mol/lph9.6的碳酸鹽緩沖液將包被原做1:1000稀釋，每孔100μl包被酶標(biāo)板，37℃孵育2h，甩掉包被液，以pbst洗滌1次，拍干；

(2)每孔加入150μl封閉液，37℃反應(yīng)2h后傾去封閉液，拍干；

(3)每孔先加入50μl系列稀釋的菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)工作液(濃度分別為0、1、3、9、27、81μg/l)，然后加入50μl以pbs做1:200000稀釋的單克隆抗體，25℃反應(yīng)30min后傾去反應(yīng)液，以pbst洗滌3～5次，每次間隔30s，拍干；

(4)加pbs稀釋的酶標(biāo)二抗(1:1000)100μl/孔，25℃反應(yīng)30min，以pbst洗滌3～5次，每次間隔30s，拍干；

(5)每孔加入底物顯色液a液和b液各50μl，25℃避光反應(yīng)15min，每孔加入50μl2mol/l的h2so4溶液終止反應(yīng)；

(6)酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)在450nm的od值。

以菊酯類農(nóng)藥濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以百分吸光度值(各濃度標(biāo)準(zhǔn)品od值與不加標(biāo)準(zhǔn)品孔o(hù)d值的百分比)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)附圖3。以各曲線50％百分吸光度值的質(zhì)量濃度(ic50)按下式計(jì)算交叉反應(yīng)率，結(jié)果見(jiàn)表2，交叉反應(yīng)率越小，抗體特異性越高。

式中：

si——交叉反應(yīng)率，％；

y——溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)工作液曲線的ic50值；

z——其他菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)工作液曲線的ic50值。

表2交叉反應(yīng)測(cè)定結(jié)果

注：“—”表示曲線扭曲變形，無(wú)法用于計(jì)算。

由表2可知，菊酯類農(nóng)藥單克隆抗體對(duì)溴氰菊酯、氯氟氰菊酯、氟胺氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯戊聚酯、苯氯菊酯均有交叉反應(yīng)，說(shuō)明該抗體可以用于菊酯類農(nóng)藥的多殘留免疫檢測(cè)。