本發(fā)明涉及一種活性多肽在制備離子通道工具試劑中的用途,尤其是用化學(xué)法制備的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-27(簡(jiǎn)寫(xiě)為spnp-27)在制備電壓門(mén)控鈉通道工具試劑-nav1.7型鈉通道抑制劑中的用途。
背景技術(shù):
電壓門(mén)控鈉通道廣泛分布于神經(jīng)元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可興奮性組織中,是一種重要的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白,其參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、血管收縮、胰腺分泌和骨骼肌興奮性等多種生理過(guò)程,同時(shí)也是治療藥物作用的重要靶標(biāo)之一。鈉通道在動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳播過(guò)程中的關(guān)鍵性作用,電壓門(mén)控鈉通道成為很多動(dòng)植物毒素的作用靶標(biāo)。鈉離子通道的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究已經(jīng)成為國(guó)際上的研究熱點(diǎn)。電壓門(mén)控鈉通道很可能成為神經(jīng)性和心血管等疾病的重要治療靶點(diǎn)。自然界的動(dòng)物毒素是一類(lèi)具有很高實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景的工具試劑或藥物導(dǎo)向物質(zhì),不僅是有毒動(dòng)物抵御天敵的有力武器,也是從事神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)研究、天然創(chuàng)新藥物開(kāi)發(fā)以及蛋白質(zhì)基礎(chǔ)研究的寶貴材料,同時(shí)也是研究離子通道的獨(dú)特“分子探針和解密器”。迄今為止,從多種動(dòng)物(如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋動(dòng)物等)的毒液中鑒定到了很多作用于鈉通道的活性成分。它們通過(guò)與鈉通道的不同位置相結(jié)合從而引起通道的動(dòng)力學(xué)特征發(fā)生相應(yīng)的變化,如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延緩等。通過(guò)闡述這些特異性調(diào)制劑作用于鈉通道的分子機(jī)制,除了在理論上可深入推測(cè)鈉通道亞型之間的功能活動(dòng)區(qū)別和門(mén)控活動(dòng)機(jī)制外,還可以為將它們開(kāi)發(fā)成治療人類(lèi)相關(guān)疾病的新藥提供充分的理論基礎(chǔ)和廣闊的應(yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明旨在于提供一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-27在制備電壓門(mén)控鈉通道工具試劑-nav1.7型鈉通道抑制劑中的應(yīng)用,所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-27(簡(jiǎn)寫(xiě)為spnp-27),其氨基酸序列為:
nh2-aspcysleuglyleuphetrpilecysglntyrmetaspasplyscyscys
proglytyrlyscysgluargserserprotrpcyslysileaspiletrp-nh2,
其特征在于廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-27作為單一有效活性組份用于制備nav1.7型鈉通道抑制劑。
所述的一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-27在制備電壓門(mén)控鈉通道工具試劑-nav1.7型鈉通道抑制劑中的應(yīng)用,其特征在于,所述的蜘蛛抑鈉肽-27的n端第2位半胱氨酸和第17位半胱氨酸之間,n端第9位半胱氨酸和第22位半胱氨酸之間,n端第16位半胱氨酸和第29位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。
該蜘蛛抑鈉肽-27作為單一有效活性組分用于制備nav1.7型鈉通道抑制劑,以細(xì)胞外給藥的方式制備成nav1.7型鈉通道工具試劑。
蜘蛛抑鈉肽-27在制備nav1.7型鈉通道工具試劑或抑制劑時(shí),配制細(xì)胞外給藥的劑量為1μmol/l或5μmol/l。
蜘蛛抑鈉肽-27對(duì)nav1.7型鈉通道的抑制呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性,是一種較好的nav1.7型鈉通道工具試劑。
附圖說(shuō)明
圖1是spnp-27對(duì)nav1.7型鈉通道的影響。
具體實(shí)施方式
為了更好的理解和更充分公開(kāi)本發(fā)明,下面將通過(guò)細(xì)胞外給藥途徑,采用轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞模型來(lái)說(shuō)明蜘蛛抑鈉肽-27的nav1.7型鈉通道抑制作用。
1、實(shí)驗(yàn)材料和方法
1.1人胚腎細(xì)胞(hek293t)的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
hek293t細(xì)胞適應(yīng)酸性環(huán)境,ph值在6.9~7.1時(shí),可順利貼壁生長(zhǎng),換液時(shí)動(dòng)作要輕。一般用高糖的dmem培養(yǎng)基。
1.1.1細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
(1)hek293細(xì)胞傳代時(shí)機(jī)為達(dá)80-90%匯合,待細(xì)胞在60mm培養(yǎng)皿中長(zhǎng)滿(mǎn)后,吸掉培養(yǎng)液。
(2)加適量pbs漂洗兩次,吸掉。
(3)加0.5ml0.25%胰酶,搖勻。37℃培養(yǎng)箱中胰酶處理2-3min。于顯微鏡下觀察細(xì)胞是否全部脫壁。加入適量10%新生牛血清dmem培養(yǎng)液終止胰酶反應(yīng)。
(4)用移液管將細(xì)胞團(tuán)輕輕吸打成單個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞按1∶3平均分入裝有預(yù)熱培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中,于37℃、5%co2、15%相對(duì)濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.1.2陽(yáng)離子性的脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染方法:
(1)在轉(zhuǎn)染前一天,對(duì)于35mm培養(yǎng)皿,每皿用2ml不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)。
(2)轉(zhuǎn)染的當(dāng)天,細(xì)胞密度最好達(dá)到80-90%,吸掉舊培養(yǎng)液,pbs漂洗一次,換成2ml無(wú)血清opti-mem培養(yǎng)液。
(3)每皿dna用量為4μg,用無(wú)血清無(wú)血清opti-mem培養(yǎng)液分別稀釋到250μl,輕輕混勻,室溫靜置5min。
(4)同時(shí)將10μl脂質(zhì)體加入250μl無(wú)血清opti-mem培養(yǎng)液中,輕輕混勻,室溫靜置5min。
(5)將稀釋的脂質(zhì)體加入等體積dna混勻,室溫靜置20min。
(6)將0.5mldna/脂質(zhì)體復(fù)合物輕輕混勻,滴加入細(xì)胞中,輕輕混勻,常規(guī)條件培養(yǎng)。
(7)讓dna/脂質(zhì)體復(fù)合物與細(xì)胞接觸4-6h后,換成10%新生牛血清dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)。24-72h內(nèi)可以進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。
1.2膜片鉗電生理活性實(shí)驗(yàn)
膜片鉗實(shí)驗(yàn)均在室溫(25±1℃)進(jìn)行,采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)。挑選質(zhì)膜光滑可見(jiàn)、胞質(zhì)均勻的有綠色熒光的hek293t細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。電流記錄通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)利用epc9放大器(heka公司,german)在電腦上進(jìn)行。計(jì)算機(jī)記錄和分析系統(tǒng)采用pulse+pulsefit8.0軟件。玻璃電極管為硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管(南京泉水教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材廠)。玻璃電極兩步拉制而成,經(jīng)拋光儀(narishige,japan)拋光后電極尖端直徑約為3μm,充灌電極液后電極電阻為1-3mω。膜片鉗實(shí)驗(yàn)要在室溫條件下進(jìn)行,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溫度的變動(dòng)最多上下不超過(guò)2℃。采用sigmaplot9.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
2.1spnp-27對(duì)nav1.7型電壓門(mén)控鈉通道的影響
運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),我們進(jìn)一步研究了spnp-27對(duì)瞬時(shí)表達(dá)于hek293t細(xì)胞的鈉通道亞型nav1.7的抑制作用。鈉通道亞型電流以同一種去極化方式誘導(dǎo):將細(xì)胞膜電位鉗制在-80mv,以50ms的時(shí)程給予一測(cè)試電壓-10mv,每隔5s重復(fù)一次。
如圖1所示,我們采用細(xì)胞外給藥的方式發(fā)現(xiàn),500nmol/l、1μmol/l和5μmol/lspnp-27對(duì)nav1.7通道有一定的抑制作用,其抑制程度分別為29.1%、51.2%和81.7%。spnp-27對(duì)nav1.7通道的抑制作用呈現(xiàn)明顯的濃度依從性和時(shí)間依賴(lài)性。
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