本發(fā)明涉及一類用于細(xì)胞內(nèi)溶酶體靶向標(biāo)記的熒光探針及其制備方法。

背景技術(shù)：

溶酶體是一種非常重要的細(xì)胞器，幾乎存在于所有的真核細(xì)胞中，它的ph值約為4.5～5.5。溶酶體中有很多酶和蛋白質(zhì)，包括酸性水解酶、膜蛋白酶和組織蛋白酶，它們不僅控制著生物體內(nèi)大分子的降解，而且影響著許多特殊的內(nèi)分泌功能，在維持細(xì)胞的正常新陳代謝和防御微生物侵染方面都扮演著重要的角色。因此，對(duì)細(xì)胞內(nèi)溶酶體進(jìn)行定位成像，并檢測(cè)ph值的變化具有重要的意義，能為很多疾病的診斷及治療跟蹤提供有用的信息，尤其是對(duì)腫瘤組織進(jìn)行可視化檢測(cè)提供有效的途徑。

熒光探針具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)勢(shì)，在生物檢測(cè)領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注和研究。目前市售溶酶體標(biāo)記熒光探針存在售價(jià)高、種類少、背景信號(hào)干擾大等弊端，因此亟需一種售價(jià)低，靶向標(biāo)記，背景干擾小，方法靈敏、簡(jiǎn)單、快捷的靶向標(biāo)記效果好的溶酶體靶向熒光探針。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種靶向標(biāo)記效果好的溶酶體靶向熒光探針及其制備方法，該溶酶體靶向熒光探針在細(xì)胞環(huán)境中、在酸性條件下能發(fā)射紅色熒光，最大發(fā)射波長(zhǎng)達(dá)625nm左右，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)溶酶體的靶向標(biāo)記，背景干擾小，方法靈敏、簡(jiǎn)單、快捷。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供

一種溶酶體靶向熒光探針，其特征在于，其分子結(jié)構(gòu)式為：

式i中取代基r為烷基或聚乙二醇烷氧基鏈。

作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，本發(fā)明提供的溶酶體靶向熒光探針及其制備方法進(jìn)一步包括下列技術(shù)特征的部分或全部：

作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述烷基為甲基或者乙基。

作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述聚乙二醇烷氧基鏈為-ch2-ch2-o-ch2-ch2-o-ch2-ch2-o-ch3。

一種溶酶體靶向熒光探針的制備方法，包括如下步驟：

步驟一、化合物3-(叔丁基乙?；?乙酰丙酮與三氧化二硼、硼酸三丁酯在有機(jī)溶劑ⅰ中在65-85℃反應(yīng)15分鐘，然后依次加入化合物式ⅱ和催化劑i縮合反應(yīng)后，在60-80℃下經(jīng)20％醋酸水溶液酸化后得到化合物式ⅲ；

步驟二、化合物式ⅲ在三氟乙酸的有機(jī)溶劑ⅱ中裂解生成化合物式ⅳ；

步驟三、化合物式ⅳ與2-(二甲氨基)乙醇在催化劑條件下發(fā)生縮合反應(yīng)生成式ⅰ；

以上三步反應(yīng)中，化合物式ⅱ、化合物式ⅲ、化合物式ⅳ和化合物式ⅰ中取代基r為烷基或聚乙二醇烷氧基鏈。

作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，本發(fā)明提供的溶酶體靶向熒光探針及其制備方法進(jìn)一步包括下列技術(shù)特征的部分或全部：

作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述化合物式ⅱ、化合物式ⅲ、化合物式ⅳ和化合物式ⅰ中取代基r為甲基、乙基或-ch2-ch2-o-ch2-ch2-o-ch2-ch2-o-ch3。

作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述步驟一中所用的有機(jī)溶劑ⅰ為：乙酸乙酯、四氫呋喃、乙腈、甲苯、三氯甲烷、1,4-二氧六環(huán)、n,n-二甲基甲酰胺和二甲亞砜中的一種或其混合；縮合反應(yīng)所用催化劑ⅰ為：哌啶、吡啶、三乙胺、嗎啉中的一種或混合；縮合反應(yīng)反應(yīng)溫度ⅰ為20～120℃；縮合反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間ⅰ為1～24小時(shí)。

作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述步驟二中反應(yīng)所用有機(jī)溶劑ⅱ為二氯甲烷、三氯甲烷、四氫呋喃、甲苯、n,n-二甲基甲酰胺中的一種或其混合；裂解反應(yīng)溫度ⅱ為–10～10℃；裂解反應(yīng)時(shí)間ii為10～180分鐘。

作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述步驟三中反應(yīng)所用溶劑ⅲ為二氯甲烷，三氯甲烷、乙腈、丙酮、n,n-二甲基甲酰胺，四氫呋喃，1,4-二氧六環(huán)中的一種或混合；所用催化劑ⅲ為：二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)；所用有機(jī)堿ⅲ為：1-羥基苯并三唑、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、二異丙基乙基胺中的一種或混合。

作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述式ⅰ化合物通過(guò)硅膠柱層析分離提純得到。

一種溶酶體靶向熒光探針的應(yīng)用，上述溶酶體靶向熒光探針用于靶向細(xì)胞內(nèi)溶酶體的熒光成像。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有如下有益效果：本發(fā)明以α,β-不飽和酮為受體構(gòu)筑d-π-a-π-d(給體-π-受體-π-給體)型的大π共軛體系，通過(guò)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移作用，能使得分子的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)相比目前很多用于溶酶體的熒光探針大為紅移，從而有效降低背景信號(hào)的干擾。本發(fā)明提供的化合物用于溶酶體的熒光成像，在細(xì)胞環(huán)境中、在酸性條件下能發(fā)射紅色熒光，最大發(fā)射波長(zhǎng)達(dá)625nm左右，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)溶酶體的靶向標(biāo)記，背景干擾小，方法靈敏、簡(jiǎn)單、快捷。

上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，而可依照說(shuō)明書的內(nèi)容予以實(shí)施，并且為了讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更明顯易懂，以下結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例，詳細(xì)說(shuō)明如下。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。

圖1為實(shí)施例1中化合物式ⅰ的質(zhì)譜圖；

圖2為實(shí)施例1中化合物式ⅰ在不同溶劑中的熒光光譜圖；

圖3為式ⅰ溶酶體共定位實(shí)驗(yàn)染色圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式，其作為本說(shuō)明書的一部分，通過(guò)實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的原理，本發(fā)明的其他方面、特征及其優(yōu)點(diǎn)通過(guò)該詳細(xì)說(shuō)明將會(huì)變得一目了然。

下述實(shí)施例中所用材料、試劑等，若無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例以式ⅰ中取代基r為甲基為例，做詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1：式ⅰ的合成

(1)中間體m1的合成：氬氣保護(hù)下，化合物3-(叔丁基乙?；?乙酰丙酮(1.40g,6.53mmol)、三氧化二硼(0.46g,6.61mmol)和硼酸三丁酯(3.01g,13.07mmol)溶于5mldmf(溶劑ⅰ)，加熱至75℃攪拌15分鐘，再依次加入4-二甲氨基苯甲醛(2.05g,13.74mmol)和哌啶(40μl)(催化劑ⅰ)，升溫至90℃(反應(yīng)溫度ⅰ)反應(yīng)4小時(shí)(反應(yīng)時(shí)間ⅰ)。反應(yīng)完后，冷卻至70℃，加入50ml20％乙酸水溶液繼續(xù)攪拌1小時(shí)。冷卻至室溫后，加入100ml氯仿萃取，有機(jī)相用水洗三次后，加入無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱進(jìn)行分離，淋洗劑為氯仿/乙醇(100:1),得化合物m1(2.86g)，為紅色固體，收率92％。

(2)中間體m2的合成：冰水浴下，化合物m1(2.86g,6.00mmol)溶于10ml二氯甲烷(溶劑ⅱ)中，加入三氟乙酸10ml，0℃下(反應(yīng)溫度ⅱ)攪拌反應(yīng)1小時(shí)(反應(yīng)時(shí)間ⅱ)，用水洗分液，有機(jī)相干燥濃縮后，用乙酸乙酯重結(jié)晶，得紅色固體m2(2.35g),收率93％。

(3)式ⅰ的合成：冰水浴下，將m2(0.15g,0.357mmol)，二環(huán)己基碳二亞胺(0.088g,0.426mmol)(催化劑ⅲ)和1-羥基苯并三唑(0.058g,0.429mmol)(有機(jī)堿ⅲ)溶于二氯甲烷(溶劑ⅲ)中，通氬氣保護(hù)，緩慢滴加2-(二甲氨基)乙醇(0.050g,0.568mmol)的二氯甲烷溶液，滴完后于室溫反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)完后加入水萃取分液，收集有機(jī)相干燥濃縮后，用硅膠柱層析分離，淋洗劑為氯仿/乙醇(50:1)，得化合物式ⅰ(0.16g)，為紅色固體，收率91％。lcmsm/z:[m]+nacalcd.forc29h38n4o3na513.29；found513.24.(a)(b)(c)三步總收率為78％。

表1.實(shí)施例2-7實(shí)驗(yàn)參數(shù)及收率表

實(shí)施例8，式ⅰ的溶酶體共定位實(shí)驗(yàn)

為了考察式ⅰ在細(xì)胞中對(duì)溶酶體的定位能力，我們對(duì)式ⅰ進(jìn)行了溶酶體共定位實(shí)驗(yàn)。將hela細(xì)胞分別用lysosensorgreendnd-189(1μm，商業(yè)化的溶酶體染色劑)與式ⅰ(5μm)進(jìn)行染色，如附圖3所示。從圖3a中可以觀察到來(lái)自lysosensorgreendnd-189的綠色點(diǎn)狀熒光。從圖3b中可以在hela細(xì)胞核周圍區(qū)觀察到明亮的點(diǎn)狀紅色熒光。將圖3a和3b疊加得到圖3c，發(fā)現(xiàn)兩者重合度高達(dá)95％，從而證明探針式ⅰ能夠選擇性定位于溶酶體，并發(fā)射出強(qiáng)烈的紅色熒光。

以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式而已，當(dāng)然不能以此來(lái)限定本發(fā)明之權(quán)利范圍，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變動(dòng)，這些改進(jìn)和變動(dòng)也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。