免洗型近紅外溶酶體探針的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種溶酶體靶向的熒光探針的合成及應用，尤其涉及一種含有孔雀綠 陀螺型分子類探針對溶酶體內(nèi)粘度敏感而熒光激活原理的熒光探針的應該用，屬于生物技 術(shù)領域。
【背景技術(shù)】
[0002] 溶酶體是真核細胞中由單層膜結(jié)構(gòu)圍繞起來的一種細胞器，內(nèi)部呈酸性，pH處于 4. 0-6. 0之間，包含大約50種不同的降解酶，因此，溶酶體被稱作為細胞的回收利用中心。 正常情況之下，溶酶體可以將衰老的細胞碎片以及無用的生物大分子分解為可供細胞利用 的生物小分子，供細胞進行重新利用。然而，當溶酶體某種酶缺失或功能紊亂的情況下，導 致大分子無法分解而聚集在溶酶體中，使溶酶體粘度升高，發(fā)生功能性障礙。因此，溶酶體 的粘度是緊隨其內(nèi)部大分子數(shù)量和密度的變化而變化的，能夠?qū)崟r的反映其動力學變化， 而且反映其基本的生物學和與溶酶體相關的功能性狀態(tài)。另外，溶酶體還與細胞的很多生 理學過程相關，比如，新陳代謝、細胞內(nèi)運輸、細胞膜的循環(huán)等。然而，溶酶體的眾多功能的 變化往往導致不同的生理學病變過程，特別是與癌癥相關的疾病。因此，發(fā)展一種溶酶體可 視化的方法就顯得尤為重要。
[0003] 化學發(fā)光傳感器在活細胞器官組織分析熒光造影中已經(jīng)得到了廣泛的應用，其發(fā) 射信號具有快速、細胞組織的傷害性小、選擇性和靈敏度都較高等優(yōu)點。另外，市場上缺乏 一種針對細胞器具有特異性定位的靶向物質(zhì)，要達到對某種細胞器特異性的定位往往非常 困難，目前針對于溶酶體特異性定位的探針，往往聚焦于其酸性的內(nèi)部環(huán)境，包括商業(yè)化的 Lysosensor探針，都是弱堿性的，探針可以在酸性環(huán)境中質(zhì)子化而選擇性聚集。如大連理 工大學肖義等發(fā)展的溶酶體探針，將嗎啡林與陀螺型BODIYP相連，并且通過光致電荷轉(zhuǎn)移 作用（PET)效應將BODIPY熒光淬滅，探針可以利用弱堿性的嗎啡林特異性的聚集于溶酶體 內(nèi)，其陀螺型BODIPY熒光壽命僅隨粘度的變化而變化，并測得溶酶體粘度為50-90cP，而嗎 啡林基團在溶酶體中質(zhì)子化，這樣的質(zhì)子使PET淬滅的熒光基團淬滅因子喪失淬滅作用 而達到熒光團恢復熒光的作用，同時達到對溶酶體進行熒光失蹤的作用。然而，這種溶酶體 定位探針在溶酶體中顯現(xiàn)出堿性，在與這種探針長時間孵育過程當中，溶酶體內(nèi)pH值會不 斷升高，另外，由于PET效應不能夠?qū)晒鈭F的熒光進行完全的淬滅，因此，這些探針常常 在細胞中表現(xiàn)出高的非特異性本底熒光。再者傳統(tǒng)的熒光探針又存在發(fā)射波長較短、組織 穿透力弱、易受生物自發(fā)光干擾、對細胞光毒性大、光穩(wěn)定性差等缺點，因此，急需發(fā)展一種 特異性好、穩(wěn)定性好、長波長發(fā)射的溶酶體定位的熒光探針。
[0004] 孔雀綠是一種三苯甲烷類染料，它具有水溶性好、摩爾消光系數(shù)大、光穩(wěn)定性好、 沒有背景熒光等諸多優(yōu)點，并且，孔雀綠便于修飾，可以對其進行各種衍生化以滿足不同方 面的需求?？兹妇G類染料是一種典型的陀螺型分子，在低粘度下分子收激發(fā)光照射，基態(tài)電 子躍迀至激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)分子發(fā)生分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)扭曲而將激發(fā)態(tài)能量消耗，這樣分子就不 表現(xiàn)出熒光性質(zhì)，而在高粘度條件下，激發(fā)態(tài)分子扭曲受限，分子吸收的能量主要以熒光發(fā) 射的形式表現(xiàn)出來，達到熒光激活的目的。并且，孔雀綠具有苯胺類弱堿性基團，可以選擇 性聚集于溶酶體內(nèi)，并且，隨溶酶體的粘度變化熒光強度發(fā)生變化。因此設計合成了新型孔 雀綠型溶酶體長波長熒光探針。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種免洗型近紅外溶酶體探針，具體為孔雀綠類粘度 激活型熒光探針，可以特異性的定位于溶酶體中，不受酸性環(huán)境干擾，對溶酶體粘度具有熒 光響應；
[0006] 本發(fā)明的另一目在于提供了所述熒光探針的合成及其在檢測活細胞溶酶體方面 的應用。
[0007] 一種免洗型近紅外溶酶體探針，其結(jié)構(gòu)如式I所示：
[0008]
【主權(quán)項】
1. 一種免洗型近紅外溶酶體探針，其結(jié)構(gòu)如圖I所示：
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種免洗型近紅外溶酶體探針，其特征在于，按下述步驟合 成： 對羥基苯甲醛與4-溴丁酸乙酯在丙酮中以碳酸鉀為縛酸劑合成取代醛，取代醛與 N，N-二甲基苯胺在乙醇中以ZnCl2S催化劑合成丁酸乙酯修飾的孔雀石，孔雀石在丙 酮中以氫氧化鉀溶液為催化劑水解丁酸乙酯，丁酸衍生孔雀石在乙酸乙酯中以2, 3-二 氯-5, 6-二氰對苯醌為氧化劑氧化孔雀綠類溶酶體靶向熒光探針。
3. 權(quán)利要求1所述的一種免洗型近紅外溶酶體探針作為活細胞內(nèi)近紅外溶酶體熒光 探針的應用。
4. 權(quán)利要求1所述的一種免洗型近紅外溶酶體探針作為活細胞內(nèi)近紅外溶酶體熒光 探針的應用，其特征在于，所述活細胞為Hela細胞。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種免洗型近紅外溶酶體探針的合成及應用，屬于生物技術(shù)領域。上述孔雀綠類溶酶體靶向熒光探針的合成方法是：有對羥基苯甲醛與4-溴丁酸乙酯在丙酮中以碳酸鉀為縛酸劑合成取代醛，取代醛與N,N-二甲基苯胺在乙醇中以ZnCl2為催化劑合成丁酸乙酯修飾的孔雀石，孔雀石在丙酮中以氫氧化鉀溶液為催化劑水解丁酸乙酯，丁酸衍生孔雀石在乙酸乙酯中以2,3-二氯-5,6-二氰對苯醌為氧化劑氧化孔雀綠類溶酶體靶向熒光探針。細胞內(nèi)實驗證實：本發(fā)明所述孔雀綠陀螺型類近紅外靶向溶酶體探針具有很好的透膜性，可以特異性的在溶酶體激活，在溶酶體外部沒有熒光，達到了免洗型溶酶體標記的目的。
【IPC分類】C09K11-06, C07D295-096, G01N21-64, C12Q1-02
【公開號】CN104877668
【申請?zhí)枴緾N201510161497
【發(fā)明人】朱麟勇, 張大生, 夏亮, 林秋寧, 包春燕
【申請人】華東理工大學
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年4月7日