本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的構(gòu)建基因敲除細(xì)胞系的方法，該方法中使用到了流式細(xì)胞術(shù)，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

crispr/cas9是目前應(yīng)用廣泛的基因組標(biāo)記工具，該系統(tǒng)利用一段rna引導(dǎo)cas9核酸酶可對多種細(xì)胞以及動植物基因組實現(xiàn)特定位點(diǎn)的切割和修飾，具有操作簡單、作用高效等優(yōu)點(diǎn)。利用該系統(tǒng)建立敲除基因細(xì)胞系，現(xiàn)在大多數(shù)實驗室都是將設(shè)計好的sg-rna與某一crispr相關(guān)的載體(如px458或者lenticrisprv2等)連接，構(gòu)建載體-sgrna敲除重組質(zhì)粒，再將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入病毒包裝細(xì)胞中，收集病毒上清液轉(zhuǎn)染細(xì)胞。然后用嘌呤霉素或者g418等抗生素進(jìn)行篩選。接著通過提基因組測序，篩選出敲除成功的細(xì)胞，再對敲除成功的細(xì)胞通過有限稀釋法將細(xì)胞分成單克隆，最后在96孔板中培養(yǎng)。這個方法操作起來過于繁瑣，需要比較全面的技術(shù)和高要求的實驗平臺，如慢病毒侵染的方法需要操作病毒，不能在一般的實驗室內(nèi)進(jìn)行，有限稀釋法不僅需要大量的重復(fù)性工作，也不能保證能將細(xì)胞全部分為單克隆。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種基于流式細(xì)胞術(shù)的構(gòu)建基因敲除細(xì)胞系的方法，該方法中用流式細(xì)胞術(shù)來解決構(gòu)建敲除細(xì)胞系過程中的轉(zhuǎn)染效率及慢病毒包裝兩個瓶頸，從而提供了一種簡便的構(gòu)建敲除細(xì)胞系的方法。

實現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：

一種基于流式細(xì)胞術(shù)的構(gòu)建基因敲除細(xì)胞系的方法，包括以下步驟：

(1)、細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染：構(gòu)建帶有g(shù)fp的序列的px458-sgrna重組質(zhì)粒，然后將px458-sgrna重組質(zhì)粒用lipo2000轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，使細(xì)胞帶上綠色熒光；

(2)、流式細(xì)胞術(shù)分選陽性細(xì)胞：然后利用流式細(xì)胞儀將帶綠色熒光的細(xì)胞分選為單細(xì)胞；

(3)、單細(xì)胞培養(yǎng)：將分選后的帶有綠色熒光的單細(xì)胞用細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)；

(4)、測序檢測：將培養(yǎng)完畢后的細(xì)胞提取基因組并測序，篩選出基因敲除后的細(xì)胞系。

步驟(1)中，首先將293t細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度長到70％時，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成opti-mem培養(yǎng)液，并將細(xì)胞饑餓處理，然后將構(gòu)建好的px458-sgrna重組質(zhì)粒和lipo2000進(jìn)行混合，并加入到opti-mem培養(yǎng)液中，3小時后，換上完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)48小時后觀察熒光，同時準(zhǔn)備一個空載體作為陰性對照。

步驟(2)中，首先將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞消化下來，用pbs緩沖液清洗，將其轉(zhuǎn)入滅菌后的流式管中并混勻；流式細(xì)胞儀開始分選的時候選擇single模式，然后根據(jù)陰性對照調(diào)節(jié)電壓，設(shè)置陽性門后，開始將帶有綠色熒光的細(xì)胞單個打到96孔板中。

步驟(3)中，將篩選出來的帶有綠色熒光的單細(xì)胞用含有20％血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)在96孔板中，培養(yǎng)15天后轉(zhuǎn)到24孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度長到80％，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入12孔板中，最后將細(xì)胞轉(zhuǎn)到6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

步驟(4)中，收取6孔板中的細(xì)胞提基因組，測序，篩選出基因敲除后的細(xì)胞系，并將該細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存一部分。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明中先建立px458-sgrna的重組質(zhì)粒，然后用lipo2000轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，再利用流式細(xì)胞儀將帶綠色熒光的細(xì)胞分選為單細(xì)胞并直接打到96孔板中培養(yǎng)3周左右，然后將培養(yǎng)起來的細(xì)胞提基因組測序，篩選出編輯過的細(xì)胞。這種方法解決了構(gòu)建敲除細(xì)胞系過程中的轉(zhuǎn)染效率及慢病毒包裝兩個瓶頸，更為簡便、省時。

附圖說明

圖1為px458-sgrna質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測圖；

圖2為單克隆細(xì)胞系序列與野生型序列比對圖；

圖3為單克隆細(xì)胞系序列與野生型序列的測序峰圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做詳細(xì)具體的說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于以下實施例。

1細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染

將293t細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中，等細(xì)胞密度長到70％準(zhǔn)備開始做轉(zhuǎn)染。首先將細(xì)胞培養(yǎng)液換成opti-mem將細(xì)胞饑餓2小時，然后將構(gòu)建好的2.5ug的px458-sgrna重組質(zhì)粒和8ul的lipo2000按照一定比例混合，并加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中。3小時后，換上完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。48小時后觀察熒光。同時準(zhǔn)備一個空載體作為陰性對照。熒光檢測結(jié)果如圖1所示，圖1中左上為px458-sgrna1^#轉(zhuǎn)染熒光圖，右上為px458-sgrna2^#轉(zhuǎn)染熒光圖，左下為px458-sgrna3^#轉(zhuǎn)染熒光圖，右下為px458空載體轉(zhuǎn)染熒光圖。

2流式細(xì)胞術(shù)分選陽性細(xì)胞

首先將細(xì)胞消化下來，用pbs洗2次，準(zhǔn)備含10％胎牛血清的pbs到滅好菌的流式管中，上機(jī)前輕輕混勻。流式細(xì)胞儀開始分選的時候選擇single模式，然后根據(jù)陰性對照調(diào)節(jié)電壓，設(shè)置陽性門后，開始將帶有綠色熒光的細(xì)胞單個打到96孔板中。

3單細(xì)胞培養(yǎng)

將篩選出來的細(xì)胞用含有20％血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)在96孔板中，大約15天就可以將培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)到24孔板中，等細(xì)胞密度長到80％就可以將細(xì)胞轉(zhuǎn)入12孔板中，最后將細(xì)胞轉(zhuǎn)到6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

4測序檢測

收取6孔板中的細(xì)胞提基因組，測序。測序結(jié)果如圖2和圖3所示。篩選出編輯過的細(xì)胞系，并將該細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存一批，然后進(jìn)行后續(xù)相關(guān)的實驗研究。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種基于流式細(xì)胞術(shù)的構(gòu)建基因敲除細(xì)胞系的方法，包括以下步驟：(1)、細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染：構(gòu)建帶有GFP的序列的PX458?sgRNA重組質(zhì)粒，然后將PX458?sgRNA重組質(zhì)粒用lipo3000轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，使細(xì)胞帶上綠色熒光；(2)、流式細(xì)胞術(shù)分選陽性細(xì)胞：然后利用流式細(xì)胞儀將帶綠色熒光的細(xì)胞分選為單細(xì)胞；(3)、單細(xì)胞培養(yǎng)：將分選后的帶有綠色熒光的單細(xì)胞用細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)；(4)、測序檢測：將培養(yǎng)完畢后的細(xì)胞提取基因組并測序，篩選出基因敲除后的細(xì)胞系。本發(fā)明中解決了現(xiàn)有技術(shù)中構(gòu)建敲除細(xì)胞系過程中的轉(zhuǎn)染效率及慢病毒包裝兩個瓶頸，更為簡便、省時。

技術(shù)研發(fā)人員：薛璐;歐陽聰;周婉;劉慶華;沈金花;彭勇波;趙平;馬立群;于孟飛;陳微微
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中南民族大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：2017.06.26
技術(shù)公布日：2017.10.10