中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和超低溫冷凍保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和超低溫冷凍保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中華鱉(Pelodiscus sinensis)又名水魚、甲魚、團(tuán)魚，隸屬爬行綱、龜鱉目、鱉科，在中國(guó)、日本、越南北部、韓國(guó)以及俄羅斯東部均有野生中華鱉分布，是一種珍貴的、經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的水生動(dòng)物。近年來，中華鱉的養(yǎng)殖量有逐年增加趨勢(shì)，然而，由于人工控溫、高密度集約化等養(yǎng)殖方式改變了中華鱉的自然生活習(xí)性，同時(shí)中華鱉商品和種苗交易頻繁，各種疾病頻繁發(fā)生，鱉病已經(jīng)嚴(yán)重威脅著我國(guó)養(yǎng)鱉業(yè)，年經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)億元，制約了養(yǎng)鱉業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。因此，疾病防治是中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的重要研究方向。
[0003]中華鱉疾病的研究，起步較晚，基礎(chǔ)研究薄弱，且該類動(dòng)物的疾病具有潛伏期長(zhǎng)、病程長(zhǎng)、易導(dǎo)致并發(fā)癥等特點(diǎn)，嚴(yán)重阻礙了中華鱉疾病防治的開展。近年來相繼報(bào)道的中華鱉疾病有紅脖子病、赤斑病、癤瘡病、嗜水氣單胞菌病、腐皮病、敗血癥、皰疹病、水泡病、穿孔病、白點(diǎn)病、虹彩病毒病等，引起這些疾病的因素，既有病毒性的也有細(xì)菌性的，其中病毒是一些疾病如粘液性鼻炎、壞死性腸炎和各種肺炎及肝炎的原發(fā)病因之一，如引起白點(diǎn)病的病毒為皰疹樣病毒(Herpesvirus);紅脖子病病毒為彈狀病毒(Rhabdovirus);紅底板病病毒與腺病毒(Adenovirius)類似；白底板病有兩種病毒，一種類似腺病毒，另一種類似呼腸孤病毒(Reovirus)，分別寄生于脾臟和腎臟中。
[0004]細(xì)胞系是指原代細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后所繁殖的細(xì)胞群體，其中能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞叫做連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系，而不能連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系稱為有限細(xì)胞系。目前，龜鱉動(dòng)物的病毒性傳染病的研究一般選用草魚卵巢細(xì)胞等細(xì)胞系作為研究載體，還沒有合適的中華鱉細(xì)胞系作為載體來研究中華鱉病毒性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，感染了病毒的中華鱉的肝、脾、腎、心、腸、肺等器官的組織和細(xì)胞均有不同程度地受損，可見心是中華鱉病毒感染的重要靶組織之一。正常的心臟細(xì)胞的細(xì)胞核呈棒狀，其周圍有少量原生質(zhì)，感染病毒后的中華鱉心臟切片可見:心臟細(xì)胞細(xì)胞核消失、肌纖維排列紊亂、斷裂，呈變形和壞死變化?？梢?，中華鱉心臟細(xì)胞系是較理想的用于研究中華鱉病毒性疾病的載體，然而，目前中華鱉心臟細(xì)胞培養(yǎng)研究鮮有報(bào)道，商品化的中華鱉心臟細(xì)胞系至今沒有介紹，中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系更是至今未見報(bào)道，因此中華鱉細(xì)胞的研究成為制約中華鱉病毒性疾病深層次研究的瓶頸，研究中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系對(duì)打破中華鱉病毒性疾病的研究瓶頸具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而提供一種中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系，該細(xì)胞系可作為中華鱉病毒性疾病研究的載體。
[0006]本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而提供一種簡(jiǎn)單易行的上述中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系的構(gòu)建方法。
[0007]本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)而提供一種有效保存上述中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系的超低溫冷凍保存方法。
[0008]本發(fā)明解決第一個(gè)技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏時(shí)間為2015年5月18日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.10597。
[0009]本發(fā)明解決第二個(gè)技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:上述中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系的構(gòu)建方法包括以下步驟:
[0010]⑴原代培養(yǎng)
[0011]清洗、消毒中華鱉體后將其置于超凈工作臺(tái)中，取其心臟并清洗除去血塊組織以及結(jié)締組織，將心臟剪成Imm3及以下的組織小塊，0.125%?0.25%的胰蛋白酶室溫消化20min?25min，然后將消化后的組織塊接種于培養(yǎng)瓶中，加入原代培養(yǎng)液倒置放置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h之后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶并添加原代培養(yǎng)液至適量，每3d更換一次培養(yǎng)液，約一周后細(xì)胞開始從組織塊中迀移，約兩周后迀出的細(xì)胞在組織塊周圍匯合成單層，此時(shí)移除組織塊，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底至90%以上時(shí)，開始傳代培養(yǎng)；
[0012]⑵傳代培養(yǎng)
[0013]吸出培養(yǎng)瓶中的原代培養(yǎng)液，加入2?3ml胰蛋白酶濃度為0.125%?0.25%的胰蛋白酶-EDTA溶液，消化10?30s，待細(xì)胞與周圍組織鏈接出現(xiàn)松動(dòng)后，加入終止消化培養(yǎng)液體以中和胰酶反應(yīng)；吹打瓶底，使貼壁細(xì)胞脫落，800rpm?100rpm離心8?1min加入原代培養(yǎng)液進(jìn)行傳代，首次傳代按體積比1:1傳，此后按體積比1:2或1:3進(jìn)行傳代，于30°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；每5d?7d傳代一次，傳至第10代時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成傳代培養(yǎng)液，細(xì)胞系建立成功。
[0014]作為優(yōu)選，所述原代培養(yǎng)液的配置過程為:向MEM培養(yǎng)液中加入胎牛血清、細(xì)胞生長(zhǎng)因子EGF和抗生素，使胎牛血清體積占總體積的15%，EGF濃度為10ng/ml，青霉素濃度為100IU/ml，鏈霉素濃度為100 μ g/ml，兩性霉素B濃度為20 μ g/ml，pH值為7.0?7.2。
[0015]作為優(yōu)選，所述傳代培養(yǎng)液的配置過程為:向MEM培養(yǎng)液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清體積占總體積的15%，霉素濃度為100IU/ml，鏈霉素濃度為100yg/ml，兩性霉素B濃度為20 μ g/ml, pH值為7.0?7.2。
[0016]本發(fā)明解決第三個(gè)技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:上述中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系的超低溫冷凍保存方法包括以下步驟:
[0017](I)配制細(xì)胞凍存保護(hù)液:將胎牛血清與DMSO按體積比9:1混合，混合均勻制得細(xì)胞凍存保護(hù)液；
[0018](2)細(xì)胞凍存:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶濃度為0.25%的胰蛋白酶-EDTA溶液消化后，細(xì)胞懸液于800rpm?100rpm離心8min?lOmin，棄掉上清液，向細(xì)胞沉淀中加入配制的細(xì)胞凍存液，重懸，使細(xì)胞的濃度達(dá)到IX 16個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中，將凍存管置于程序降溫盒中，-80°C過夜，然后放入液氮中長(zhǎng)期保存。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明針對(duì)中華鱉心臟組織特點(diǎn)，采用胰蛋白酶消化法，避免了常規(guī)組織植塊法存在的細(xì)胞迀出困難等問題，獲得的原代心臟細(xì)胞能正常貼壁生長(zhǎng)并快速增值，連續(xù)傳代并成功建系，該心臟細(xì)胞系經(jīng)連續(xù)傳代后，仍能保持中華鱉心臟細(xì)胞的生物學(xué)特性，因此該細(xì)胞系可在分子細(xì)胞水平上進(jìn)行中華鱉以及其他龜鱉動(dòng)物的病毒性疾病的研究、預(yù)防以及相關(guān)治療藥物的研究，例如染色體分析、虹彩病毒研究等，并且也可以滿足對(duì)中華鱉種質(zhì)資源保存和理論研究與應(yīng)用的需要，本發(fā)明中的構(gòu)建方法除適用于中華鱉心臟細(xì)胞外，也適用于其他水產(chǎn)類、爬行類動(dòng)物心臟細(xì)胞系的構(gòu)建。
【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明中中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系原代培養(yǎng)7d后的細(xì)胞形態(tài)圖(10X10)；
[0021]圖2為本發(fā)明中中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系原代細(xì)胞第一次傳代前的細(xì)胞形態(tài)圖(10X10)；
[0022]圖3為本發(fā)明中中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系傳代培養(yǎng)至第10代的細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞形態(tài)圖(10X10);
[0023]圖4為本發(fā)明中中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系傳代培養(yǎng)至第33代的細(xì)胞形態(tài)圖(10X10)；
[0024]圖5為本發(fā)明中中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系經(jīng)蘇木精一伊紅染色法處理后的細(xì)胞形態(tài)圖(10X10);
[0025]圖6為本發(fā)明中中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線圖。
[0026]保藏說明:分類命名:中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏時(shí)間為2015年5月18日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.10597。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0028]實(shí)施例1:中華鱉心臟細(xì)胞連續(xù)細(xì)胞系的構(gòu)建
[0029]1.1PBS消毒液和細(xì)胞培養(yǎng)液的制備
[0030]PBS消毒液:向PBS中加入抗生素，使青霉素濃度為100IU/ml，鏈霉素濃度為100 μ g/ml，兩性霉素B濃度為20 μ g/ml。
[0031]原代培養(yǎng)液:向MEM培養(yǎng)液中加入胎牛血清、細(xì)胞生長(zhǎng)因子EGF和抗生素，使胎牛血清體積占總體積的15%，EGF濃度為10ng/ml，青霉素濃度為100IU/ml，鏈霉素濃度為100 μ g/ml，兩性霉素B濃度為20 μ g/ml，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值為7.0?7.2，放置于4度冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0032]傳代培養(yǎng)液:向MEM培養(yǎng)液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清體積占總體積的15%，霉素濃度為100IU/ml，鏈霉素濃度為100 μ g/ml，兩性霉素B濃度為20 μ g/ml ;終止消化培養(yǎng)液:向MEM培養(yǎng)液中加入胎牛血清，使胎牛血清體積占總體積的10%，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的PH值為7.0?7.2，放置于4度冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0033]1.2原代培養(yǎng)