一種達(dá)氏鱘脾臟組織細(xì)胞系的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞系的構(gòu)建方法，屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]達(dá)氏鋳(Acipenser dabryanus)又名長(zhǎng)江鋳，主要分布在長(zhǎng)江中上游干流及金沙江下游，為我國(guó)特有魚(yú)類(lèi)，具有重要的物種價(jià)值，被列為國(guó)家I級(jí)保護(hù)的水生野生動(dòng)物。由于過(guò)度捕撈、水體污染、水利工程興建等原因，長(zhǎng)江流域中達(dá)氏鋳的資源已極為稀少，隨著長(zhǎng)江上游及金沙江水電工程的建設(shè)，其天然資源將受到更加嚴(yán)峻的威脅，如能冷凍保存其卵子或者胚胎，無(wú)疑對(duì)保護(hù)瀕危達(dá)氏鋳物種是很有意義的。但通常由于野生達(dá)氏鋳很難獲得成對(duì)的成熟親本，甚至很難得到存活的個(gè)體，且卵子或者胚胎的冷凍保存技術(shù)難以攻克，迫切需要其它技術(shù)來(lái)彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。對(duì)于魚(yú)類(lèi)來(lái)說(shuō)，保存的細(xì)胞既可以長(zhǎng)期傳代，又可以通過(guò)凍存來(lái)減少保藏帶來(lái)的物資消耗。在細(xì)胞水平保存物種為未來(lái)瀕危物種的復(fù)活提供了可能。因此，構(gòu)建瀕危魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系顯得十分必要，既是解決魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源保存、可持續(xù)繁衍和挽救瀕危物種的有效途徑之一，也對(duì)探索珍稀瀕危水生物種種質(zhì)資源保存具有重要的指導(dǎo)意義，目前，有關(guān)脾臟細(xì)胞系的構(gòu)建僅在花鱸、石斑魚(yú)、高首鋳等少數(shù)魚(yú)類(lèi)中有過(guò)相關(guān)報(bào)道，而本發(fā)明針對(duì)像達(dá)氏鋳這種瀕危鋳魚(yú)類(lèi)物種，以達(dá)氏鋳脾臟組織為材料，提供了一種適用于達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞系的構(gòu)建方法，此法也可供中華鋳、白鋳等鋳魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)提供參照。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是利用達(dá)氏鋳脾臟組織，提供一種達(dá)氏鋳脾臟細(xì)胞系的構(gòu)建方法，以滿足對(duì)達(dá)氏鋳及其它瀕危魚(yú)類(lèi)物種保護(hù)研宄的需要。
[0004]本發(fā)明的構(gòu)建方法，包括以下步驟:制備專(zhuān)用培養(yǎng)液，細(xì)胞的原代培養(yǎng)，細(xì)胞的傳代培養(yǎng)以及細(xì)胞的冷凍保存和復(fù)蘇，
[0005](I)專(zhuān)用培養(yǎng)液制備的具體步驟為:選取健康的達(dá)氏鋳，尾靜脈取血，分離出的血清過(guò)濾除菌后將該達(dá)氏鋳魚(yú)血清、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B、人表皮生長(zhǎng)因子和人堿性成纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)因子添加到Minimum Essential Medium的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，制備成達(dá)氏鋳脾臟細(xì)胞完全培養(yǎng)液，置于4°C保存?zhèn)溆?；所述的達(dá)氏鋳魚(yú)血清的體積濃度為0.5%，胎牛血清的體積濃度為30%、青霉素的濃度為200IU/ml、鏈霉素的濃度為200IU/ml、兩性霉素B濃度為0.5 μ g/ml、人表皮生長(zhǎng)因子濃度為20ng/ml、人堿性成纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度為20ng/ml。步驟I)中，所述的達(dá)氏鋳魚(yú)血清的體積濃度為0.5%，胎牛血清的體積濃度為30%、青霉素的濃度為200IU/ml、鏈霉素的濃度為200IU/ml、兩性霉素B濃度為0.5 μ g/ml、人表皮生長(zhǎng)因子濃度為20ng/ml、人堿性成纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度為20ng/ml ο
[0006]按體積分?jǐn)?shù)計(jì)體積濃度為0.5%的達(dá)氏鋳魚(yú)血清200-300 μ 1、體積濃度為30%的胎牛血清 10-18ml、10000IU/ml 的青霉素 0.6-1.4ml、10000IU/ml 的鏈霉素 0.6-1.4ml、12.5 μ g/ml 的兩性霉素 B 0.6-1.4ml、10 μ g/ml 的人表皮生長(zhǎng)因子 80-120 μ 1、10 μ g/ml 人喊性成纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)因子80-120 μ KMinimum Essential Medium基礎(chǔ)培養(yǎng)液30_33ml。進(jìn)一步優(yōu)選為:體積濃度為0.5%的達(dá)氏鋳魚(yú)血清250 μ 1、體積濃度為30%的胎牛血清15ml、10000IU/ml 的青霉素 lml、10000IU/ml 的鏈霉素 lml、12.5 μ g/ml 的兩性霉素 B 1ml、10 μ g/ml的人表皮生長(zhǎng)因子100yl、10yg/ml人堿性成纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)因子100 μ 1、Minimum Essential Medium 基石出培養(yǎng)液 31.55ml。
[0007](2)細(xì)胞原代培養(yǎng)的具體步驟為:選取健康的達(dá)氏鋳，在20ppm高錳酸鉀溶液中藥浴30分鐘，再用70%乙醇擦拭魚(yú)體表面2分鐘，置于超凈工作臺(tái)中解剖取脾臟組織，用過(guò)量的的青霉素和鏈霉素，兩性霉素B的高三抗杜氏磷酸緩沖液連續(xù)漂洗若干次后，將脾臟組織剪成Imm3的小塊，在25°C下，采用胰蛋白酶和膠原酶的混合物對(duì)脾臟組織消化5_8分鐘，再將脾臟組織置于步驟(I)的專(zhuān)用培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮，收集脾臟組織塊均勻接種于培養(yǎng)瓶中，25°C下倒置干貼6小時(shí)后加步驟(I)制備的專(zhuān)用培養(yǎng)液?jiǎn)?dòng)脾臟組織原代培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3d后，顯微鏡鏡下可見(jiàn)大量細(xì)胞從組織塊中迀移出來(lái)并貼壁，剛貼壁的細(xì)胞形態(tài)呈上皮樣或成纖維樣(圖1-A)，及得到原代培養(yǎng)的脾臟組織細(xì)胞。
[0008]該步驟中，所述的青霉素和鏈霉素的濃度均為500IU/m，兩性霉素B的高三抗杜氏磷酸的濃度為1.25 μ g/ml O所述的胰蛋白酶和膠原酶的混合物為質(zhì)量濃度為0.0625% -0.25%胰蛋白酶與質(zhì)量濃度為0.08% -0.1 %膠原酶II按體積為1:1的混合物。
[0009](3)細(xì)胞傳代培養(yǎng)的具體步驟為:待脾臟組織細(xì)胞從組織塊周?chē)|出形成單層，培養(yǎng)瓶底部覆蓋率達(dá)70%以上時(shí)，開(kāi)始第I次傳代，先吸出所有組織塊和培養(yǎng)液，用無(wú)菌磷酸緩沖液洗滌兩次，再加入質(zhì)量濃度0.25%胰酶溶液，25°C培箱中消化1-3分鐘，待細(xì)胞單層解離成單個(gè)細(xì)胞后，加入步驟(I)中的專(zhuān)用培養(yǎng)液以中和過(guò)量的胰酶溶液，1200r/min離心3-6分鐘，收集細(xì)胞并用專(zhuān)用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，將重懸后得到的細(xì)胞懸液分別等量接種于兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，25°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4d后，可見(jiàn)脾臟組織細(xì)胞的形態(tài)多呈成纖維樣，為長(zhǎng)條形或梭形(圖1-B)。之后，每隔3-4d，重復(fù)一次按照(3)中傳代培養(yǎng)的步驟，得到傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。
[0010](4)細(xì)胞的冷凍保存和復(fù)蘇具體步驟為:在MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中二甲基亞砜，胎牛血清，I青霉素、鏈霉素、兩性霉素B，配制成細(xì)胞冷凍保存液，置冰上預(yù)冷，取傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，加入胰酶溶液消化2分鐘后按照(3)中傳代培養(yǎng)的步驟操作得到細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞沉淀用預(yù)冷的冷凍保存液重懸，再轉(zhuǎn)入凍存管中，將凍存管放入凍存盒中先在40C冰箱中平衡10分鐘，然后在-80°C超低溫冰箱中置4小時(shí)以上，再將凍存管放入液氮面平衡5分鐘，最后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮中，長(zhǎng)期保存。細(xì)胞在液氮中保存一個(gè)月后，將細(xì)胞凍存管從液氮中取出，直接投入37°C水浴解凍，離心重懸細(xì)胞沉淀，將該細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入步驟
(I)中的專(zhuān)用培養(yǎng)液，且每12-24小時(shí)后更換新鮮達(dá)氏鋳脾臟細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液，直到得到達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞，即可完成達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞系的構(gòu)建。
[0011]該步驟中，所述的二甲基亞砜的體積濃度為10%，胎牛血清的體積濃度為30%，青霉素的濃度為200IU/ml，鏈霉素的濃度為200IU/ml，兩性霉素B的濃度為0.5yg/ml，胰酶的質(zhì)量濃度為0.25%，所述的二甲基亞砜的體積濃度為10%，胎牛血清的體積濃度為30%，青霉素的濃度為200IU/ml，鏈霉素的濃度為200IU/ml，兩性霉素B的濃度為0.5 μ g/ml，胰酶的質(zhì)量濃度為0.25%。
[0012]按體積比計(jì)，體積濃度為10%的二甲基亞砜80-120 yl、10000IU/ml的青霉素15-23yl、10000IU/ml 的鏈霉素 15-25 μ 1、12.5 μ g/ml 的兩性霉素 B 15-23 μ 1、質(zhì)量濃度為0.25%胰酶1.8-2.5ml。進(jìn)一步優(yōu)選為體積濃度為10%的二甲基亞砜100 μ 1U0000IU/ml的青霉素20yl、10000IU/ml的鏈霉素20 μ 1、12.5 μ g/ml的兩性霉素B 20 μ 1、質(zhì)量濃度為0.25%胰酶2ml。
[0013]技術(shù)原理:該培養(yǎng)方法是指從達(dá)氏鋳體內(nèi)組織取出細(xì)胞，模擬體內(nèi)出現(xiàn)的環(huán)境，在無(wú)菌，適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使其生長(zhǎng)繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。不同物種，即便同一種物種不同組織的細(xì)胞及原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞之間在培養(yǎng)基及培養(yǎng)的環(huán)境條件都有所差異。
[0014]本發(fā)明與已有技術(shù)對(duì)比，其優(yōu)點(diǎn)在于:
[0015](I)目前除本發(fā)明外，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)達(dá)氏鋳脾臟細(xì)胞培養(yǎng)的報(bào)道，本發(fā)明建立的達(dá)氏鋳脾臟細(xì)胞培養(yǎng)方法也適用于中華鋳、白鋳等其它鋳魚(yú)。
[0016](2)本發(fā)明方法，其所述的制備的培養(yǎng)液中添加了 20ng/ml人表皮生長(zhǎng)因子和20ng/ml人堿性成纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及5%的達(dá)氏鋳魚(yú)血清。
[0017](3)本發(fā)明構(gòu)建的方法，其所述的原代培養(yǎng)步驟中需對(duì)組織塊用濃度為0.0625% -0.25%的胰蛋白酶和0.08% -0.1 %膠原酶II聯(lián)合消化5-8分鐘。
[0018](4)本發(fā)明構(gòu)建的達(dá)氏鋳脾臟細(xì)胞系增殖速度快，可以連續(xù)傳代，并可超低溫凍存和復(fù)蘇，既可為鋳魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源保存的相關(guān)研宄奠定技術(shù)基礎(chǔ)，又可作為鋳魚(yú)病毒病體外研宄的理想材料。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為實(shí)施例1脾臟組織細(xì)胞，其中，圖1-A為達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞原代培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)；
[0020]圖1-B為第I次傳代后脾臟細(xì)胞的形態(tài)。
[0021]圖2為實(shí)施例1達(dá)氏鋳脾臟組織細(xì)胞密度。
[0022]圖3為