本發(fā)明涉及診斷學(xué),具體涉及一種基于母體的胎兒外膜滋養(yǎng)層細胞的胎兒遺傳檢測方法。
背景技術(shù):
胎兒dna的獲得主要有兩種方式:一是傳統(tǒng)的侵入性方法,包括羊膜穿刺術(shù)(amniocentesis),絨毛膜取樣(chorionicvillussampling,cvs),臍血取樣等,這些方法雖能準確地診斷,但可能造成胎兒損傷,導(dǎo)致產(chǎn)婦流產(chǎn)等不良后果,而且在孕期較晚時間(8~20周,或者更晚)才能檢測;二是非侵入性方法,非侵入性方法獲取胎兒dna的是從母體血漿和循環(huán)的胎兒細胞,在懷孕的早期,可在母體的血液中檢測到胎兒的遺傳物質(zhì)的一種基于無細胞的胎兒游離dna(cfdna)開發(fā)的非侵入性診斷策略,然而,根據(jù)研究分析,在妊娠的早期和妊娠晚期,cfdna分別僅占總血漿dna的大約3.4%和6.2%,而且,其含量受到孕婦的年齡,體重,懷孕的時間影響,此外,cfdna是短片段的dna,這對精確的分析來說是很大的挑戰(zhàn)。另外一種技術(shù)是基于母體血液的胎兒有核紅細胞,以及評估獲取細胞的核苷酸序列。
在母體樣本中富集胎兒有核紅細胞的方法中:首先,通過密度梯度離心,去除母體血液中多種無核的細胞,之后通過親和力的原理富集與純化胎兒有核紅細胞;例如,有核紅細胞的前體細胞表面大量表達半乳糖分子,其可被凝集素捕獲;此外,可利用細胞表面特異性的抗原,富集胎兒有核紅細胞;例如,胎兒有核紅細胞大量表達基質(zhì)金屬蛋白酶14前體或轉(zhuǎn)鐵蛋白前體。但該細胞在血液中的含量非常稀少,在106~107的母體細胞中可能只含有1個胎兒的有核紅細胞,這對于分離來說,是非常困難,而且這些方法只能在孕期較晚時間(12~26周)才能檢測,存在局限性。評估獲取細胞的核苷酸序列方法中:評估富集胎兒細胞的核苷酸序列的包括:靶核苷酸測序方法和基因組dna測序、使用特定的檢測探針與感興趣的序列雜交、細胞里某些基因rna表達水平的評估等。
目前廣泛使用的三種檢測方法存在局限性:羊水穿刺術(shù)和絨毛膜絨毛取樣(cvs)技術(shù)具有侵入性,而且在孕期較晚時間(8~20周,或者更晚)才能檢測;胎兒游離dna(cfdna)檢測存在胎兒dna含量過低的問題,而且在孕期較晚時間(12~26周)才能檢測。此外,基于母體血液的胎兒有核紅細胞的方法,但該細胞在血液中的含量非常稀少,在106~107的母體細胞中可能只含有1個胎兒的有核紅細胞,這對于分離來說,是非常困難。
在胚胎發(fā)育成桑椹胚后,桑椹胚進一步發(fā)育,細胞開始出現(xiàn)分化。聚集在胚胎的一端,個體較大的細胞,稱為內(nèi)細胞團(innercellmass,icm),將來發(fā)育成胎兒的各種組織,而沿透明帶內(nèi)壁擴展和排列的,個體較小的細胞,稱為滋養(yǎng)層細胞,它們將來發(fā)育成胎膜和胎盤。滋養(yǎng)層細胞有囊胚外圍的滋養(yǎng)外胚層發(fā)育分化而來,覆蓋于絨毛的表面,內(nèi)層為細胞滋養(yǎng)層細胞,外層為合體滋養(yǎng)層細胞。在胚胎發(fā)育過程中,絨毛表面的細胞滋養(yǎng)層細胞不斷增加,逐步發(fā)育成胎膜和胎盤。近年來,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)有少量的滋養(yǎng)層細胞會遷移到孕婦的子宮頸口。這類細胞保持與胎兒相同的dna序列,可用于胎兒診斷,但現(xiàn)有技術(shù)中的流程需要將hla-g的抗體與磁珠上的二抗過夜孵育,流程繁瑣,耗時,且存在磁珠表面的二抗與樣本里面的細胞非特異性結(jié)合,降低檢測的準確性。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
本發(fā)明目的是提供一種基于母體的胎兒外膜滋養(yǎng)層細胞的胎兒遺傳檢測方法。本發(fā)明所述方法簡便、快速、特異性高。
為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明所采用的技術(shù)手段為:
一種基于母體的胎兒外膜滋養(yǎng)層細胞的胎兒遺傳檢測方法,包括如下步驟:
1)提供含有胎兒滋養(yǎng)層細胞的樣本;
2)將樣品固定,加冰醋酸消化,離心,緩沖液重懸,胰酶消化,緩沖液重懸;
3)加入磁性納米顆粒偶聯(lián)的hla-g單克隆抗體,孵育;
4)磁力架收集,緩沖液沖洗離心,純化磁性納米顆粒捕獲的細胞;
5)dna酶處理,挑取單個細胞,進行單細胞基因組擴增,對基因組dna進行打斷建庫;
6)測序分析。
本發(fā)明還提供一種胎兒外膜滋養(yǎng)層細胞的純化方法,包括以下步驟:
1)提供含有胎兒滋養(yǎng)層細胞的樣本;
2)將樣品固定,加冰醋酸消化,離心,緩沖液重懸,胰酶消化,緩沖液重懸;
3)加入磁性納米顆粒偶聯(lián)的hla-g單克隆抗體,孵育;
4)磁力架收集,緩沖液沖洗離心,純化磁性納米顆粒捕獲的細胞。
本發(fā)明還提供所述胎兒外膜滋養(yǎng)層細胞的純化方法在胎兒遺傳中的應(yīng)用。
本發(fā)明步驟1)所述的樣品,妊娠5周或5周以上即可獲得,可以通過巴氏涂片獲得含有完整的胎兒滋養(yǎng)層細胞的母體(孕婦)宮頸管的樣本;更具體的,可以將細胞刷深入到宮頸內(nèi)管大約2cm,并旋轉(zhuǎn)360度;如果第一次沒有得到宮頸黏液,可再次采集樣本。盡量減少與宮頸壁接觸,以減少母親的細胞的污染。
本發(fā)明步驟2)樣品固定可以用本領(lǐng)域常用的細胞固定液,如:95%的乙醇、甲醇、5%的冰醋酸、carnoy固定液(配方:無水乙醇60ml,氯仿30ml,冰醋酸10ml)、丙酮、4%的多聚甲醛溶液、10%的甲醛溶液等;優(yōu)選carnoy固定液,carnoy固定液能固定胞漿和胞核,尤其適宜于染色體等。
本發(fā)明步驟2)所采用的具體方法可以為:將采集到的樣品轉(zhuǎn)移到固定液中,加入冰醋酸,室溫放置4-6min;離心去上清,緩沖液清洗,離心去上清,緩沖液重懸,加入胰酶35-38℃消化10-20min,離心去上清,緩沖液重懸。
本發(fā)明步驟2)中離心選用的條件優(yōu)選為1000-2000rpm離心4-6min;緩沖液優(yōu)選pbs。步驟2)中加冰醋酸可以消化樣本的黏液,同時使紅細胞膨脹而破碎。加胰酶的處理有利于消化成單個細胞,便于后面的質(zhì)控以及細胞捕獲實驗。
本發(fā)明步驟3)中的hla-g單克隆抗體為兔源hla-g單克隆抗體。
本發(fā)明步驟4)純化磁性納米顆粒捕獲的細胞之后,可以取部分細胞,質(zhì)控富集細胞的純度。質(zhì)控方法可以為本領(lǐng)域常用的方法,如:取部分富集細胞轉(zhuǎn)移到載玻片上,38-42℃處理樣本4-6min,按照免疫熒光的方法,用cy3偶鏈的hcg的抗體檢測細胞是否表達hcg(正常情況下,凡是表達hla-g的細胞都會表達hcg),質(zhì)控富集細胞的純度。
本發(fā)明步驟5)dna酶處理可以消化外源的母體dna,避免母體細胞dna的影響,具體方法可以為:dna酶室溫處理4-6min。
本發(fā)明的步驟5)挑取單個細胞,裂解細胞,之后用dna聚合酶擴增基因組。優(yōu)選高保真的dna聚合酶??梢允悄蜔岬母弑U鎑na聚合酶,也可以是常溫的dna聚合酶。
本發(fā)明一種更為具體的基于母體的胎兒外膜滋養(yǎng)層細胞的胎兒遺傳檢測方法,包括以下步驟:
1)妊娠5周或5周以上的孕婦,利用巴氏涂片捕獲得含有完整的胎兒滋養(yǎng)層細胞的孕婦宮頸管的樣本;
2)將步驟1)捕獲的細胞轉(zhuǎn)移到細胞固定液中,3-5℃保存;向樣本中加入冰醋酸,室溫放置4-6min,1000-2000rpm離心4-6min收集細胞樣本;
3)緩沖液重懸細胞樣本,離心,去上清,重復(fù)3次;
4)緩沖液重懸細胞樣本,加入胰酶35-37℃消化處理細胞10-20min,1000-2000rpm離心4-6min收集細胞樣本;
5)緩沖液重懸細胞樣本,離心,去上清,重復(fù)3次;
6)加入磁性納米顆粒偶聯(lián)的hla-g單克隆抗體,3-5℃孵育過夜;
7)磁力架收集之后再用冷的緩沖液重懸,重復(fù)收集-重懸3次,純化磁性納米顆粒捕獲的細胞;
8)取一部分細胞,轉(zhuǎn)移到載玻片上,38-42℃處理樣本4-6min,按照免疫熒光的方法,用cy3偶鏈的hcg的抗體檢測細胞是否表達hcg;
9)剩余細胞用dna酶室溫處理4-6min,離心收集細胞,加入緩沖液,再離心,反復(fù)洗3次,進一步洗掉磁珠和母體dna;
10)挑取單個的細胞,進行單細胞基因組擴增,對基因組dna進行打斷建庫;
11)測序分析。
本發(fā)明所述技術(shù)方案的有益效果:
1)滋養(yǎng)層細胞發(fā)育形成胎盤,它們攜帶有與發(fā)育的胚胎和胎兒相同的基因組。因此,檢測巴氏涂片上滋養(yǎng)層細胞中的dna,可以提供與其他檢測方法相同的信息,而且檢測時間更早,侵入性更小;本發(fā)明所述方法可以在妊娠更早期(5周)進行的可靠檢測;它是非侵入性的,可以讓很多患者更放心;
2)本發(fā)明選用兔源hla-g單克隆抗體,結(jié)合本發(fā)明捕獲方法的改進,相對于傳統(tǒng)的方法,使抗體的親和力提高100-1000倍,顯著性的提高捕獲的效率,提高靈敏度、準確度;
3)另外一方面,將hla-g單克隆抗體偶聯(lián)在磁珠上,減少二抗的非特異性結(jié)合,進一步提高結(jié)果的準確度;
4)直接用捕獲的細胞做單細胞擴增,避免了現(xiàn)有技術(shù)中把細胞貼在載玻片上,分離細胞核,去除粘附的母源dna,裂解滋養(yǎng)層細胞的細胞核,釋放出的胎兒dna等繁瑣的步驟,操作更簡便,不需要極高的技術(shù)要求,時間更短。
附圖說明
圖1是hla-g陽性細胞捕獲的流程圖;
圖2是捕獲細胞的質(zhì)控與單細胞建庫分析;
圖3是實施例1捕獲細胞的質(zhì)控結(jié)果;
圖4是實施例2捕獲細胞的質(zhì)控結(jié)果;
圖5是實施例1和實施例2樣品中捕獲的陽性細胞與對比例的比例對比;
圖6是實施例3和對比例的流程示意圖。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明,下面實施例未注明具體條件的實驗方法,通常按照本領(lǐng)域的公知手段。
實施例1臨床樣本的采集和處理
1.1樣本收集:樣本孕婦選擇孕期超過5周女性,利用巴氏涂片捕獲得含有完整的胎兒滋養(yǎng)層細胞的孕婦宮頸管的樣本,具體的操作包括將細胞刷(購買于hologic公司)深入到宮頸內(nèi)管大約2cm,并旋轉(zhuǎn)360度;如果第一次沒有得到宮頸黏液,可再次采集樣本。盡量減少與宮頸壁接觸,以減少母親的細胞的污染。
1.2樣本保存:將細胞刷在20ml的固定液(購買于hologic公司)中涮洗,將剛才采集到的細胞轉(zhuǎn)移到固定液中,4度保存。
1.3向上述的細胞樣本中加入500ul的冰醋酸,室溫放置5分鐘,用以消化樣本的黏液,同時使紅細胞膨脹而破碎。離心收集細胞樣本,離心條件可以選擇1000rpm5分鐘。
1.4去上清,將沉淀重懸在20ml的pbs的緩沖液中,離心,去上清。重復(fù)3次。離心步驟1000rpm5分鐘,選擇在4度的條件下進行;
1.5之后用1.5mlpbs重懸細胞,加入1.5毫升胰酶(購買于thermofisher公司)消化處理細胞15分鐘,在37度的條件下進行。用胰酶的處理有利于消化成單個細胞,便于后面的質(zhì)控以及細胞捕獲實驗。離心步驟1000-2000rpm5分鐘,選擇在4度的條件下進行;將沉淀重懸在1.5ml的pbs的緩沖液中,離心,去上清。重復(fù)3次.
實施例2模擬樣本的采集和處理
1.1將移液器和移液槍、15ml離心管、離心管架、100cm2新的細胞培養(yǎng)皿放于生物安全柜中,按照生物安全柜的標準操作規(guī)程,將生物安全柜的紫外開啟半小時。
1.2將含10%胎牛血清(購買于thermofisher公司)和100u/ml雙抗(購買于thermofisher公司)的mem((購買于thermofisher公司),添加nahco31.5g/l,sodiumpyruvate0.11g/l)及pbs放于37℃水浴鍋中預(yù)熱。
1.3將已長到80%-90%的人絨毛膜細胞株jeg-3細胞(購買于中國科學(xué)院細胞庫),培養(yǎng)皿從37℃,5%的co2培養(yǎng)箱中取出,先用75%的酒精噴灑于瓶表面,將細胞培養(yǎng)瓶旋轉(zhuǎn)放于生物安全柜中,用無菌的移液管吸凈其中的培養(yǎng)基,加5ml的預(yù)熱的pbs洗滌一次,吸凈pbs。同時,將已長到80%-90%的子宮頸癌細胞的細胞系hela細胞(購買于中國科學(xué)院細胞庫)培養(yǎng)皿從37℃,5%的co2培養(yǎng)箱中取出,先用75%的酒精噴灑于瓶表面,將細胞培養(yǎng)皿旋轉(zhuǎn)放于生物安全柜中,用無菌的移液管吸凈其中的培養(yǎng)基,加5ml的預(yù)熱的pbs洗滌一次,吸凈pbs。
1.4將含edta-0.25%tyption(購買于thermofisher公司)用pbs稀釋兩陪到五倍,向該100cm2培養(yǎng)皿中加入3ml稀釋好的edta-0.25%tyption,讓其充分平鋪于細胞表面。蓋好瓶蓋,將細胞瓶放在顯微鏡下觀察,直到細胞變圓,加含10%胎牛血清的mem培養(yǎng)基到15ml無菌的離心管中,1000rpm離心3分鐘。
1.5將離心上清吸棄掉,用手指輕輕拍打離心管底將底部細胞分散開,再加3ml
carnoy固定液(配方:無水乙醇60ml,購買于國藥,氯仿30ml,購買于國藥,冰醋酸10ml,購買于國藥)將分散的細胞重懸稀釋開,室溫固定5分鐘。
1.6將上述樣本離心1000rpm,室溫3分鐘,去上清,加入5mlpbs重懸,再離心,去上清,反復(fù)洗三次,最后用10ml的pbs重懸該細胞。取一定量的細胞液進行10倍稀釋后計數(shù),按照細胞計數(shù)標準操作規(guī)程進行。計數(shù)方法:按圖計算計數(shù)板的四角大方格(每個大方格又分16個小方格)內(nèi)的細胞數(shù)。計數(shù)時,只計數(shù)完整的細胞,若聚成一團的細胞則按一個細胞進行計數(shù)。在一個大方格中,如果有細胞位于線上,一般計下線細胞不計上線細胞,計左線細胞不計右線細胞。二次重復(fù)計數(shù)誤差不應(yīng)超過±5%。鏡下觀察,凡折光性強而不著色者為活細胞,染上藍色者為死細胞。計數(shù)的換算:計完數(shù)后,需換算出每ml懸液中的細胞數(shù)。由于計數(shù)板中每一方格的面積為0.01cm2,高為0.01cm,這樣它的體積為0.0001cm3,即0.1mm3。由于1ml=1000mm3,所以每一大方格內(nèi)細胞數(shù)×10000=細胞數(shù)/ml,故可按下式計算:細胞懸液細胞數(shù)/ml=4個大格細胞總數(shù)/4×10000,如計數(shù)前已稀釋,可再乘稀釋倍數(shù)。
1.7計數(shù)好之后細胞,在1.5ml的pbs加入200000個hela細胞和200個jeg-3細胞,模擬臨床的樣本。
實施例3基于母體的胎兒外膜滋養(yǎng)層細胞的胎兒遺傳檢測方法
如圖1、圖2和圖6所示,包括如下步驟:
1)選擇實施例1或?qū)嵤├?采集或處理后的細胞;
2)將兔源hla-g(hla-g是滋養(yǎng)層和胎盤細胞特有的人類白細胞抗原)單克隆抗體(公司自產(chǎn)的)連接到磁性納米顆粒表面;
3)在步驟1)中的樣本中,加入偶聯(lián)兔源hla-g抗體的磁珠,4度孵育過夜,如圖1所示;
4)用磁力架收集磁珠之后在用冷的pbs重懸,用磁力架收集,再加入pbs,重復(fù)3次,去掉未結(jié)合的母體細胞;純化磁珠捕獲下來的細胞;如圖1所示,用磁力架回收hla-g的陽性細胞,用pbs洗掉hla-g的陰性細胞;
5)取一小部分細胞,轉(zhuǎn)移到載玻片上,40度處理樣本5分鐘。按照免疫熒光的方法,用cy3偶鏈的hcg的抗體(購買于thermofisher公司)檢測細胞是否表達hcg(正常情況下,凡是表達hla-g的細胞都會表達hcg),質(zhì)控富集的hcg細胞的認純度,如圖2所示。
免疫熒光的步驟:①pbs浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干pbs,在玻片上滴加正常山羊血清,室溫封閉30min;②吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量的稀釋好的cy3偶鏈的hcg一抗(1:300購買于thermofisher公司)并放入濕盒,4℃孵育過夜;后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行;③pbst浸洗3次,每次3min,吸水紙吸干玻片上多余液體后滴加dapi(購買于sigma公司),避光孵育5min,對標本進行染核,pbst5min×4次洗去多余的dapi;④用吸水紙吸干爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
6)剩余的細胞樣本用dna酶室溫處理5分鐘,離心收集細胞,加入pbs緩沖液,再離心,反復(fù)洗3次,進一步洗掉磁珠和母體dna。
7)挑取單個的細胞,利用本公司的單細胞擴增試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司,貨號n602)進行單細胞基因組擴增,具體方法參見產(chǎn)品說明書,如圖2所示。
8)擴增純化的基因組dna(南京諾唯贊生物科技有限公司,貨號nd602),利用本公司的nd604試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司,貨號nd604)建庫,具體方法參見產(chǎn)品說明書;
9)上機測序,利用二代測序的技術(shù),對胎兒dna進行分析。
對比實驗:如圖6所示,包括以下步驟:
1)同樣選擇實施例1或?qū)嵤├?采集或處理后的細胞樣品;加入5ug的鼠源hla-g抗體與樣本4度過夜孵育;
2)加入偶聯(lián)有羊抗鼠二抗抗體的磁珠加上到樣本中,4度孵育6小時;
3)用磁力架收集磁珠之后在用冷的pbs重懸,用磁力架收集,再加入pbs,重復(fù)3次,去掉未結(jié)合的母體細胞;純化磁珠捕獲下來的細胞;
4)取一小部分細胞,轉(zhuǎn)移到載玻片上,40度處理樣本5分鐘。按照免疫熒光的方法,用cy3偶鏈的hcg的抗體(購買于thermofisher公司)檢測細胞是否表達hcg(正常情況下,凡是表達hla-g的細胞都會表達hcg),質(zhì)控富集的hcg細胞的認純度,如圖2所示。
5)剩余的hla-g陽性的細胞轉(zhuǎn)移到載玻片上,40度處理樣本5分鐘。
6)用胃蛋白酶溶液(0.01g胃蛋白酶溶解在100ml0.1n的鹽酸)處理11分鐘,裂解細胞。pbs溶液洗3次,去掉細胞膜和母體dna。
7)用dna酶室溫處理5分鐘,用pbs緩沖液洗3次,進一步洗掉磁珠和母體dna。
8)加dna裂解液,65度過夜處理,裂解細胞核。95度30分鐘,失活。
9)最終,收集滋養(yǎng)層細胞釋放出的胎兒dna。
10)上機測序,利用二代測序的技術(shù),對胎兒dna進行分析。
實驗結(jié)果:
1)實施例3方法中純化的胎兒外膜滋養(yǎng)層細胞的質(zhì)控結(jié)果
實施例1樣品捕獲細胞的質(zhì)控結(jié)果如圖3所示,用標記cy3的hla-g抗體檢測表達hcg的細胞,用dapi染色統(tǒng)計總的細胞數(shù)目,利用熒光顯微鏡統(tǒng)計細胞總數(shù)與hcg的陽性細胞的數(shù)目,可以看到在富集之前,樣本中有大量的細胞,其中hcg的陽性細胞非常的少,幾乎看不到,在富集之后,所有的細胞都是hcg陽性的細胞。
實施例2樣品捕獲細胞的質(zhì)控結(jié)果如圖4所示,用標記cy3的hla-g抗體檢測表達hcg的細胞,用dapi染色統(tǒng)計總的細胞數(shù)目,利用熒光顯微鏡統(tǒng)計細胞總數(shù)與hcg的陽性細胞的數(shù)目;可以看到在富集之前,樣本中有大量的細胞,其中hcg的陽性細胞非常的少,幾乎看不到。在富集之后,所有的細胞都是hcg陽性的細胞。
結(jié)果表明,本發(fā)明所述方法,純化效果好,幾乎可以實現(xiàn)100%純化。
2)實施例1和實施例2的樣品經(jīng)過實施例3或?qū)Ρ葘嶒灥臋z測方法,捕獲的陽性細胞的比例如圖5所示。雖然實施例3中利用1μg兔源的hla-g抗體而對比實驗中用了5μg鼠源的hla-g抗體,但結(jié)果顯示通過實施例3所述方法用1ug的兔源的hla-g抗體捕獲的效果比對比實驗中5ug鼠源的hla-g抗體捕獲的陽性率高,且構(gòu)成顯著性差異。因此,本發(fā)明所述方法特異性更好,靈敏度更高,同時使用的抗體少,成本低。
3)實施例3所用方法相對于對比實驗流程更簡便,時間更短,從拿到樣本到提取樣本的基因組dna,現(xiàn)在的方法在13.5小時便可以完成,其中動手時間在1.5小時左右;而對比實驗流程需要長達33小時才能完成流程,其中動手時間需要2小時以上。