專利名稱：在母體樣品中鑒定胎兒dna的診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在諸如血液或陰道樣品的母體樣品中鑒定胎兒DNA的方法。用這種方法鑒定的胎兒DNA然后可以用于，例如產(chǎn)前診斷。
染色體疾病是人類最常見的基因疾病。組成型(constitutional)染色體疾病發(fā)生率在妊娠第一個(gè)三月期占流產(chǎn)相關(guān)致死率的50％以上，占宮內(nèi)或圍產(chǎn)期死亡率的大約5％。另外至少0.5％的活產(chǎn)兒童有與智力和/或體格障礙相關(guān)的組成型染色體異常。
染色體異?？梢允菙?shù)量上的或結(jié)構(gòu)上的。數(shù)量異常指體細(xì)胞組織中正常二倍體46條染色體數(shù)目的改變，包括三體(一條額外的染色體)，單體(一條染色體缺失)和多倍體(整套額外的染色體)。由染色體斷裂及隨后斷裂的染色體末端在異常的位置愈合導(dǎo)致結(jié)構(gòu)重排，包括所謂的易位、倒位和插入。結(jié)構(gòu)染色體重排可以以平衡方式發(fā)生，在這種情況下基因物質(zhì)通常保持如常。
平衡的結(jié)構(gòu)染色體重排的攜帶者體格和智力是正常的但可能遇到生殖問題，生育力下降的危險(xiǎn)提高和染色體不平衡后代的危險(xiǎn)提高，導(dǎo)致流產(chǎn)，宮內(nèi)或圍產(chǎn)期死亡和/或體格和/或智力障礙的活產(chǎn)兒童。
在人群中作為一個(gè)整體發(fā)生的最常見的染色體異常是與唐氏綜合征相關(guān)的21三體。普遍被接受的是大約1/650活產(chǎn)兒童有21三體唐氏綜合征，其特點(diǎn)是或多或少的嚴(yán)重精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩。在世界范圍內(nèi)不同國家之間21三體唐氏綜合征的發(fā)生率沒有本質(zhì)差別。
兒童和成人中21三體唐氏綜合征的診斷通常通過血淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)之后的染色體分析進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)過程需要2-3天以便足夠的細(xì)胞集中在細(xì)胞周期的中期階段，該時(shí)期染色體足夠濃縮能夠用標(biāo)準(zhǔn)染色體顯帶技術(shù)鑒定單個(gè)染色體。
唯一清楚證明的產(chǎn)生具有規(guī)律的21三體唐氏綜合征兒童的臨床危險(xiǎn)因素涉及母親年齡。因此通常接受的是隨母親年齡增長生產(chǎn)21三體兒童的危險(xiǎn)增高，其中在45歲以上的最高年齡組中可能超過懷孕者的10％。這種狀況導(dǎo)致對妊娠婦女實(shí)行加強(qiáng)的篩查方案以鑒定那些最可能具有21三體兒童的婦女。這些篩查方案包括分析母體血液樣品的生化特征和胎兒超聲，目的是特別觀察頸部皮下聚積的液體，它在唐氏綜合征和其他一些常見的非整倍體胎兒中特征性地增加。
另外超過一定年齡的妊娠婦女，通常35歲，常規(guī)被提供有創(chuàng)操作(絨毛取樣和/或羊膜穿刺術(shù))以允許進(jìn)行胎兒細(xì)胞取樣用于染色體分析。目前最常見的染色體病產(chǎn)前診斷方法涉及羊水樣品體外培養(yǎng)之后的核型分析。這包括顯微鏡分析染色體足夠濃縮的有絲分裂細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)大約需1-3周，診斷的長期拖延被認(rèn)識(shí)到與相當(dāng)大的父母焦慮相關(guān)。
可選擇的更迅速的產(chǎn)前染色體診斷技術(shù)包括(1)來自未培養(yǎng)的羊水樣品的靜止(間期)細(xì)胞核的熒光原位雜交(FISH)，和(2)DNA診斷，使用分離自羊水樣品的DNA，通過例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，并且通過Q-PCR技術(shù)對染色體特異性引物定量。
用于染色體疾病產(chǎn)前診斷的這兩種可選擇的技術(shù)，使用羊水樣品，可能意味著在樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室的當(dāng)天或第二天報(bào)告就可以迅速完成。到目前為止它們局限于最常見的染色體異常的快速診斷，即那些包括21、13、18三體和性染色體非整倍體的染色體異常。
無論如何，諸如羊膜腔穿刺術(shù)、絨毛膜取樣和對于母親來說不舒適的有創(chuàng)性檢查方法，與大約1-1.5％的流產(chǎn)率增加有關(guān)。因此有必要提供不需要采取這種有創(chuàng)取樣方法即可開展產(chǎn)前診斷的更有效的方法。
應(yīng)用創(chuàng)傷性更小的方法從懷孕母親獲得的樣品通常包含很大部分的母體細(xì)胞，胎兒細(xì)胞數(shù)量相對少，數(shù)量級(jí)為1/10000到1/1千萬。目前胎兒細(xì)胞分離的方法包括使用抗體、梯度分離，優(yōu)選母體細(xì)胞溶解，磁激活細(xì)胞分類術(shù)(MACS)，用磁力進(jìn)行鐵磁流體懸浮，單個(gè)細(xì)胞的顯微操作，帶電流體分離和熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)。然而，母體細(xì)胞仍比任何回收的胎兒細(xì)胞占優(yōu)勢。另外，這些技術(shù)中的許多是費(fèi)時(shí)和勞動(dòng)密集型的。
最近認(rèn)識(shí)到母體血液樣品，特別是血漿或血清含相對大量的胎兒DNA(Lo et al.，Lancet 1997，350，485-487，WO98/39474)。已進(jìn)一步顯示這種胎兒DNA，在通過諸如PCR的技術(shù)進(jìn)行體外擴(kuò)增之后，可以通過胎兒特異性序列鑒定。這種技術(shù)已被應(yīng)用于一些情況下通過Y染色體特異性引物進(jìn)行胎兒性別診斷，和諸如血紅蛋白病的其產(chǎn)前診斷基于胎兒DNA特異性突變的其他情況。
另外已顯示使用上文示例的胎兒特異性引物諸如21三體的胎兒染色體異常與母體血清/血漿中相比正常情況升高的胎兒DNA有關(guān)。另外諸如先兆子癇、早產(chǎn)和產(chǎn)后發(fā)生自身免疫病的妊娠并發(fā)癥，可能也以增加的胎兒母體輸血、導(dǎo)致母體血液中胎兒細(xì)胞水平更高為特征(綜述見Pertl and Bianchi Semin Perinatol23，5.393-402，1999；Bianchi Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol92，1，103-82000)。
已有結(jié)論，通過胎兒特異性DNA引物(例如男胎兒的Y染色體特異性引物)確定的胎兒DNA數(shù)量可以作為檢測胎兒染色體非整倍體危險(xiǎn)增加的妊娠的篩查方法。然而最重要的是，尚不能通過所述方法診斷胎兒非整倍體本身。因而這些方法來衡量胎兒DNA的差別，以確定胎兒是否正?；?yàn)榉钦扼w不夠靈敏。這些測試結(jié)果種類的例子顯示于下文中的

圖1。在圖1a中，胎兒正常，有兩個(gè)峰相應(yīng)于母體等位基因。其中一個(gè)(M2)比另一個(gè)(M1)大并且有額外量的起源于胎兒DNA(F)的DNA。它的大小與源于父本來源(F-Pat)的胎兒等位基因的峰一樣。
在圖1b中，胎兒有21三體，在每一個(gè)母體等位基因M1和M2上有一拷貝F，加上一拷貝父本來源(F-Pat)。與圖(a)所示正常情況相比，這會(huì)降低等位基因M1和M2之間的熒光差異。在圖1c中，胎兒有21三體，在母體等位基因M2上有兩拷貝F，加上一拷貝父本來源(F-Pat)。與圖1a所示正常情況相比，這增加了等位基因M1和M2之間的熒光差異。最后在圖1d中，胎兒有21三體，含兩拷貝父本來源F-Pat。這不造成母體等位基因M1和M2之間的熒光差異，但父本等位基因的熒光加倍。這樣的結(jié)果很難解釋，并且就我們所了解的，尚無公開的病例以此種方法，使用母體血液或陰道樣品進(jìn)行21三體(或任何其他非整倍體)的產(chǎn)前診斷。
因此迫切需要新方法以在含母體DNA的樣品，諸如血液或陰道樣品中鑒定胎兒DNA，包括無創(chuàng)性的產(chǎn)前診斷新方法。
公知組成重復(fù)DNA序列的位于染色體末端的端粒變化多樣，以至年輕人比年紀(jì)大的人重復(fù)數(shù)量更高。DNA復(fù)制被認(rèn)為不發(fā)生在端粒重復(fù)的最末端。這意味著每次細(xì)胞分裂，端粒變得比以前更短。這種縮短也被認(rèn)為最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
所有人類染色體的端粒包含同樣的DNA核心重復(fù)TTAGGG。隨個(gè)體年齡增加的端粒長度變化是在所有染色體中觀察到的普遍現(xiàn)象。根據(jù)個(gè)體的年齡，估測端粒重復(fù)長度的變化數(shù)量級(jí)在4-200Kb DNA。
可以使用特殊軟件和顯微圖象分析與端粒探針或商業(yè)可獲得的肽核酸探針(PNA，DAKO Ltd)雜交的染色體來測量染色體特異性端粒長度。這些研究指出在每個(gè)細(xì)胞核之間可能存在個(gè)體染色體端粒成分的差異。然而，正如已經(jīng)提及的，隨受試者年齡的增長端粒長度有顯著縮短。
在此基礎(chǔ)上，胎兒細(xì)胞中各個(gè)染色體的端粒長度應(yīng)當(dāng)比新生兒長，比成人的更長。因此這意味著胎兒細(xì)胞比來自母體的細(xì)胞具有更長的端粒，即每一染色體具有更高拷貝數(shù)量的端粒DNA重復(fù)(Butler etal.，Cancer Genetics and Cytogenetics 105，138-144，1998；Krejiand Koch，Chromosoma 107，198-203，1998)。
申請者已發(fā)現(xiàn)這一特征可作為鑒別母體和胎兒DNA的基礎(chǔ)，特別是出現(xiàn)在含母體DNA的樣品，諸如血液(包括血漿或血清)或陰道樣品中的DNA。
因此根據(jù)本發(fā)明，提供了一種在含母體DNA的樣品中鑒定胎兒DNA的方法，所述方法包含(a)從所述樣品中分離DNA，(b)使用一種酶對所述DNA進(jìn)行核酸外切消化以便去掉所述DNA的末端區(qū)域，和(c)檢測作為所述消化過程結(jié)果的胎兒DNA中保留但母體DNA缺少的DNA序列的存在。
步驟(a)和(b)可以按任何順序進(jìn)行。例如，首先將DNA從細(xì)胞中分離，然后按照步驟(b)進(jìn)行酶消化。然而，作為選擇，消化可以直接在細(xì)胞中進(jìn)行，并且通過諸如PCR擴(kuò)增的方法分離被消化的DNA，此后用于步驟(c)的分析。
含母體DNA的合適樣品是血液或陰道樣品。優(yōu)選使用母體血液樣品進(jìn)行此方法。此處所用的“血液樣品”的表述包括全血，或由其來源的血清或血漿。
在一種特別的優(yōu)選實(shí)施方案中，首先從母體血漿分離細(xì)胞，并按此程序的步驟(a)從中提取DNA，或如果合適的話在步驟(b)的過程中或之后進(jìn)行。這種DNA擴(kuò)增的例子，在只能獲得少量材料時(shí)有利，對其描述見于例如Findlay et al Mol Pathol 51(3)，164-167，1998，Klein et al Proc Natl Acad Sci USA 96(8)，4494-4499，1999.
然而可能存在這樣的病例，其中本發(fā)明被方便地用于其他產(chǎn)前樣品類型的分析，例如羊水。通常羊水樣品含相對少的母體DNA，鑒定胎兒DNA不困難。然而在某些情況，樣品被母體血液污染，并且當(dāng)例如用Q-PCR方法分析時(shí)產(chǎn)生復(fù)雜的熒光模式。使用本方法作為從這樣的樣品分離胎兒DNA的初步步驟可能有用。
可以使用傳統(tǒng)方法從樣品分離DNA。優(yōu)選采用使長DNA片段分離的技術(shù)。這種方法的一個(gè)例子是使用瓊脂糖栓(agarose plug)，描述于Heiskanen et al.，Biotechniques 17，5，928-929；9320933，1994。
在一種實(shí)施方案中，在步驟(b)之前將來自步驟(a)的DNA用限制性酶切成片段。這樣核酸外切消化去掉了DNA片段的末端區(qū)域(見下文中的圖2)。[然而，并不總需要這樣，特別是從血漿分離的細(xì)胞自身直接進(jìn)行核酸外切消化，并且在分析前將產(chǎn)生的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。]在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在核酸外切消化之前，保護(hù)DNA片段的切端使得它們不易被諸如Bal31的核酸外切酶消化。這將意味著來源于DNA末端區(qū)域的片段的消化將會(huì)是單向的，從端粒區(qū)向內(nèi)。近端和來源于DNA內(nèi)部區(qū)域的片段會(huì)受保護(hù)不被消化。結(jié)果是消化只會(huì)發(fā)生在端粒區(qū)(見下文中的圖3)。
適當(dāng)?shù)氖牵糜谛纬蒁NA片段的限制性酶是進(jìn)行切割以便為諸如連接體(adaptor)的保護(hù)性部分提供結(jié)合位點(diǎn)的酶。然后保護(hù)可以通過適當(dāng)?shù)倪B接體的連接實(shí)現(xiàn)。適當(dāng)?shù)倪B接體可以是2’-O-甲基-核糖核苷酸DNA(Mukai et al.Nucleic Acid Research Symposium Series19，1998)或包含硫代磷酸酯鍵的互補(bǔ)寡核苷酸。
可以在步驟(c)中檢測到的胎兒DNA中保留的適當(dāng)?shù)腄NA序列是端粒序列或位于端粒區(qū)域近端的染色體標(biāo)記，并且最優(yōu)選是亞端粒序列(subtelomeric sequence)，特別是對特異染色體獨(dú)特的序列。
步驟(c)中的檢測可以通過任何已知技術(shù)實(shí)現(xiàn)。然而在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，使用磁分離技術(shù)分離和純化胎兒DNA?？梢酝ㄟ^它實(shí)現(xiàn)的一種特別方法包括使用生物素化的引物作為端粒特異性探針。引物雜交將意味著胎兒DNA會(huì)具有一個(gè)能夠使用鏈親和素包被的順磁顆粒(PMPS)或珠子進(jìn)行磁力分離的生物素標(biāo)記(例如見圖4)。
在本發(fā)明方法的內(nèi)容中，經(jīng)常有引物被用作探針的情況。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來講這很清楚。因此本文所用的名詞“引物”應(yīng)被理解為除了指用作擴(kuò)增反應(yīng)的傳統(tǒng)引物的序列，還指可能具有探針功能的序列。
一旦按這種方式分離，可以對DNA片段分析。如果需要，可以首先對它們進(jìn)行擴(kuò)增。按這種方式獲得的純的擴(kuò)增的胎兒DNA在無創(chuàng)產(chǎn)前基因分析和診斷方面可以具有廣泛應(yīng)用。可以特別優(yōu)選開展定量分析，例如使用熒光Q-PCR方法，例如通過應(yīng)用生物系統(tǒng)DNA測序儀(Applied Biosystems DNA sequencers)和Genescan軟件，和高溫測序(Pyrosequencing)和其他這樣的包括微陣列(Microarrays)的方法。這些方法中的許多現(xiàn)在已經(jīng)變成全自動(dòng)化的。
在實(shí)行中，本發(fā)明使用胎兒和母體DNA端粒重復(fù)數(shù)量的差異作為在含母體DNA的樣品中鑒定胎兒DNA的基礎(chǔ)。在步驟(b)過程中，優(yōu)選為片段形式，最優(yōu)選為長片段的DNA被消化，優(yōu)選在切端保護(hù)之后從片段的端粒末端區(qū)域向內(nèi)單向性地消化。
存在于樣品中的所有染色體的端粒區(qū)域在此過程中首先被消化。核酸外切消化可以進(jìn)行足夠長時(shí)間以去掉至少所有的母體端粒DNA序列。
如果消化在此點(diǎn)停止，一些胎兒DNA片段會(huì)保留一些端粒DNA(圖3a)。然后使用例如對引物端粒DNA特異性的，因此只與胎兒DNA雜交的被標(biāo)記引物檢測這種DNA。
然而可以繼續(xù)消化以便去除母體DNA所有片段的亞端粒DNA序列(圖3b)。在這種情況下，因?yàn)楦L的胎兒端粒消化費(fèi)時(shí)更長，一些染色體特異性DNA會(huì)保留在胎兒DNA片段的相應(yīng)位點(diǎn)，并且因此是可以檢測的，例如使用該DNA的引物并因此用作標(biāo)記物。在這些情況下，引物不會(huì)與母體DNA雜交。
優(yōu)選地，檢測中使用的引物用諸如熒光標(biāo)記物的可見標(biāo)記物標(biāo)記。
當(dāng)步驟(c)中檢測的序列是染色體標(biāo)記時(shí)，它可能優(yōu)選是亞端粒多態(tài)性染色體標(biāo)記，因?yàn)檫@使標(biāo)記物本身易于在產(chǎn)前診斷中有用的可能性增加。
無論如何，胎兒DNA的鑒定可以被用作鑒定的DNA的產(chǎn)前診斷的初步步驟。
在一個(gè)特別的可供選擇的實(shí)施方案中，用端粒和/或亞端粒序列等所述DNA序列的特異性第一標(biāo)記(first labelled)的DNA引物對消化后樣品中存在的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。最優(yōu)選第一引物用可視標(biāo)記特別是熒光標(biāo)記物標(biāo)記，并檢測來自擴(kuò)增樣品的熒光。
進(jìn)行核酸外切消化的適當(dāng)?shù)拿赴˙al31?？梢詢?yōu)選使用僅消化DNA特定區(qū)域的酶，以確保更可控制的消化過程。具體地，消化按三步驟過程進(jìn)行，其中，第一步，去除3’延伸DNA(extension DNA)；第二步，切除3’-5’ss區(qū)域；第三步，消化ss區(qū)域。實(shí)現(xiàn)第一和第三步的適當(dāng)?shù)拿赴ňG豆核酸酶，對于第二步，合適的酶包括核酸外切酶III。
需要諸如酶濃度、緩沖系統(tǒng)、溫度和孵育時(shí)間的條件以便提供可靠的消化來允許區(qū)分母體和胎兒DNA，需要仔細(xì)選擇并依賴于諸如正使用的特定的酶等因子。
作為不同DNA末端之間端粒DNA序列重復(fù)數(shù)量變異的結(jié)果，首先需要“校準(zhǔn)”酶系統(tǒng)，優(yōu)選以染色體特異性方式?？赡芡ㄟ^分析在各種條件下分離DNA的核酸外切端粒消化的結(jié)果實(shí)現(xiàn)這種類型的校準(zhǔn)。
校準(zhǔn)特定酶系統(tǒng)的另一種方式是獲得母體和胎兒組織樣品中每個(gè)單獨(dú)的染色體末端端粒長度的基本信息。這可以通過在細(xì)胞周期的中期對端粒DNA序列使用熒光原位雜交(FISH)完成。在這個(gè)階段使用端粒特異性探針結(jié)合亞端粒DNA探針進(jìn)行FISH，每個(gè)染色體末端的各個(gè)端粒可以被加亮突出。端粒序列的測量可以通過顯微圖像分析術(shù)進(jìn)行，例如使用比較性基因組雜交(Comparative GenomicHybridisation)(CGH)軟件程序。
也可以使用來自接受臍帶穿刺術(shù)的胎兒的血液樣品和分娩時(shí)獲得的臍帶血樣品，目的是獲得關(guān)于母體和胎兒組織樣品中每個(gè)染色體臂的端粒DNA序列長度的正常變異的其他基本信息。
從母體DNA去除亞端粒標(biāo)記需要的酶濃度和暴露時(shí)間條件可以用類似方式確定。在這種情況下，可以使用例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對DNA產(chǎn)物的亞端粒標(biāo)記物進(jìn)行擴(kuò)增，以區(qū)分組成型母體染色體等位基因和胎兒DNA等位基因。此實(shí)驗(yàn)將提供在相應(yīng)的酶消化條件下亞端粒DNA序列去除速率的基本信息。
優(yōu)選的亞端粒標(biāo)記包括，例如小串連重復(fù)(STR)或微衛(wèi)星。為此目的，它們可以是或可以不是多態(tài)性標(biāo)記，因?yàn)樗鼈儍H用于測定被核酸外切消化時(shí)它們的消失率和鑒別組成型母親和胎兒DNA。
然而如果該分析接著被用于產(chǎn)前診斷可以優(yōu)選多態(tài)性診斷標(biāo)記物。21號(hào)染色體特異性多態(tài)四核苷酸重復(fù)標(biāo)記物的例子是D21S11，D21S1412，S21S1411和D21S1414。雙核苷酸重復(fù)IFNAR也顯示出簡單的擴(kuò)增模式，與大多數(shù)其他可能與掃描殘跡條帶(stutterband)相關(guān)的更小的重復(fù)標(biāo)記物不同。多態(tài)標(biāo)記物的其他例子包括單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，它在人類基因組中發(fā)生頻率很高，并且目前被確認(rèn)的數(shù)目正在增加。
在這種情況下，胎兒標(biāo)記物濃度可以隨后確定，例如使用諸如TAQMANTM的定量PCR方法。只有當(dāng)某種DNA序列在胎兒和母體之間的數(shù)量不同時(shí)，此信息可以在胎兒狀況的產(chǎn)前診斷中有用。使用母體血液樣品進(jìn)行常見胎兒狀況，包括非整倍體，例如21三體唐氏綜合征的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷，需要對染色體獨(dú)特性胎兒DNA數(shù)量進(jìn)行可靠的定量測定。
在一種優(yōu)選選擇中被關(guān)注的亞端粒標(biāo)記物應(yīng)定位在每一個(gè)染色體臂上的染色體獨(dú)特性DNA序列中盡可能遠(yuǎn)端的地方。分別根據(jù)研究人群中位置和多態(tài)性程度，預(yù)先選定每一個(gè)染色體末端的標(biāo)記物。
適當(dāng)?shù)氖沁x擇的DNA標(biāo)記策略上位于亞端粒染色體位置，包含染色體特異性獨(dú)特DNA。因?yàn)閮蓚€(gè)原因優(yōu)選這些位置。
首先，位于端粒附近但也包含獨(dú)特的染色體特異性DNA的標(biāo)記物，將促進(jìn)消化過程，因?yàn)榕c選擇性去除母體更近端，中間(interstitial)DNA所需的相比，它只需要有限的核酸外切消化。當(dāng)進(jìn)行上文所述的單方向消化時(shí)這會(huì)特別有用。
第二，多態(tài)亞端粒染色體/DNA標(biāo)記物的使用將不僅允許定量測定染色體數(shù)量畸變(例如三體)，也允許定量測定不平衡的染色體結(jié)構(gòu)重排，例如不平衡易位。不平衡易位可以被鑒別為一種亞端粒標(biāo)記物劑量重復(fù)同時(shí)另一種亞端粒標(biāo)記物劑量缺失，這取決于哪種染色體進(jìn)行了易位。另外，其他相對常見的染色體畸變按這種方式應(yīng)該可以鑒定。這些包括額外的標(biāo)記染色體，例如胎兒等臂12p(iso 12p)，或等臂18p(iso 18p)，二者都與嚴(yán)重的胎兒畸形相關(guān)，這可能導(dǎo)致與正常情況相比額外的雙倍劑量。
可能需要特殊的核酸外切程序用于額外染色體標(biāo)記物的診斷，例如15逆向重復(fù)，因?yàn)檫@包括兩個(gè)額外劑量的15p端粒DNA序列。這樣的端粒序列重復(fù)自身對于胎兒發(fā)育是無害的，然而也包括15號(hào)染色體特異性DNA、位于q臂近端部分的標(biāo)記物與胎兒精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩相關(guān)，這可以是嚴(yán)重的。
通過適當(dāng)選擇用于產(chǎn)前胎兒診斷的亞端粒標(biāo)記物，導(dǎo)致胎兒發(fā)育障礙的大多數(shù)染色體異?？梢酝ㄟ^此方法確定。使用此方法，單獨(dú)采用亞端粒DNA標(biāo)記物不能檢測的僅有的染色體異常是預(yù)料不到并且因此確切位置不能被確定的更近端的(中間)缺失和重復(fù)。此方法也需要特殊修改以診斷因?yàn)楦改钢械拿恳粋€(gè)都是攜帶者而預(yù)料到的特定缺失和重復(fù)。
一旦使用本發(fā)明的方法鑒定，胎兒DNA可以被用于產(chǎn)前診斷，例如確定諸如非整倍體、唐氏綜合征、Edward綜合癥或先天性睪丸發(fā)育不全癥(Klinefelter綜合征)的染色體畸變的存在或其他諸如胎兒性別的信息。
適當(dāng)?shù)氖牵诜治銮胺蛛xDNA，例如使用磁分離方法。具體地，使用諸如特異性生物素化引物的標(biāo)記引物擴(kuò)增DNA。如果說在此處使用一種端粒引物，那么只有含端粒的，即胎兒DNA片段會(huì)被測量和標(biāo)記，前提是所有相應(yīng)的母體DNA在消化過程中已被去掉。
然后可以使用例如鏈親和素包被的順磁顆粒或珠子捕獲所述DNA片段。在從上清液中分離磁性顆粒后，通過洗脫顆?？梢葬尫虐蠨NA(圖4)。
一旦分離，可以在引物擴(kuò)增樣品內(nèi)DNA的條件下用特異于特定染色體或DNA診斷區(qū)的被標(biāo)記引物擴(kuò)增所述DNA。在被鑒定為胎兒來源的DNA中檢測這一引物將因此提供有關(guān)胎兒的信息。根據(jù)特定的診斷目的，如果第二引物對染色體18、21或13，或X或Y染色體特異，這可能有用。這些染色體的染色體數(shù)目異常(非整倍體)是最常見的。
在本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，從母體血液樣品，例如從母體血漿中的細(xì)胞分離DNA，用限制性酶切成片段，然后連接到連接體上。將修飾片段用諸如Bal31的核酸外切酶孵育足夠長的時(shí)間以完全消化母體端粒，但保留一些胎兒端粒DNA。含端粒(胎兒)的DNA片段的進(jìn)一步純化可以通過使用生物素化的端粒探針或用作探針的端粒引物和鏈親和素順磁顆粒(PMPS)的磁分離實(shí)現(xiàn)(圖4)。
然后將分離的含端粒(胎兒)DNA片段用諸如PCR的方法擴(kuò)增，使用染色體特異性引物。然后可以使用諸如Q-PCR的熒光方法進(jìn)行分析，例如使用DNA測序儀和Genescan軟件(Applied Biosystems)，實(shí)時(shí)PCR或高溫測序。
另外，使用本發(fā)明的方法可獲得的信息，特別是有關(guān)母體樣品中胎兒DNA濃度數(shù)量的信息，可能在產(chǎn)前篩查/診斷和一些母體狀態(tài)的診斷中有用。這包括諸如先兆子癇的妊娠并發(fā)癥，預(yù)測早產(chǎn)和以后以后發(fā)生自身免疫病的風(fēng)險(xiǎn)。
根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供在含母體DNA的樣品中鑒定胎兒DNA的試劑盒，所述試劑盒包含從含DNA的樣品中分離DNA的工具，一種能夠消化DNA末端區(qū)域的核酸外切酶，和一種檢測位于DNA末端區(qū)域的特異性DNA序列的被標(biāo)記引物。
試劑盒可以包含一種或更多進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)上述方法需要的試劑或商品。特別是，試劑盒可能進(jìn)一步包含限制性酶，它切割DNA以便在DNA上產(chǎn)生一個(gè)連接體的結(jié)合位點(diǎn)，以及適于保護(hù)DNA片段的切端免受酶消化的連接體。
取決于測定進(jìn)行的方式，也可以包含生物素化的引物和特別是生物素化的端粒引物和鏈親和素順磁顆粒。
其他可能的試劑盒成分包括一種或更多其他的被標(biāo)記引物，例如一種不同的熒光標(biāo)記的引物，它診斷一種染色體狀況。
現(xiàn)在通過實(shí)施例并參考附錄圖解具體解釋本發(fā)明，其中圖1顯示從從母體血液提取的DNA的Genescan分析的比較性實(shí)例，(a)中胎兒是正常的，(b)、(c)和(d)中胎兒有21三體，這些用上文方法開展。
圖2用圖解說明諸如Bal31對DNA片段的核酸外切消化，其中片段兩端均被消化盡管母體序列(M)中端粒序列比胎兒序列(F)中少并因此允許鑒定胎兒DNA，如果位置如圖所示，區(qū)別M和F熒光標(biāo)記物信號(hào)是不可能的。
圖3用圖解說明使用符合本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的連接體對DNA片段的單向核酸外切消化；以致在最佳時(shí)程，酶會(huì)去除所有的M端粒序列(圖3a)和M熒光標(biāo)記信號(hào)(圖3b)。通過選擇性保留F熒光信號(hào)，在進(jìn)行DNA擴(kuò)增，例如Q-PCR之后允許計(jì)數(shù)關(guān)注的F染色體，這樣的系統(tǒng)將允許M和F片段的區(qū)分；和圖4用圖解說明使用生物素化的端粒探針進(jìn)行胎兒DNA的磁純化。
實(shí)施例1步驟1DNA提取各取5ml母體血液，放入兩個(gè)試管中，其中一個(gè)試管含EDTA。血液樣品在3000g下離心，分別從含和不含EDTA的試管中小心取出血漿和血清放入干凈試管。在3000g條件下再次將血漿和血清離心并將上清液轉(zhuǎn)移到干凈試管。
根據(jù)制造商的推薦，采用來自Qiagen的QIAamp血液試劑盒從血漿和血清樣品中提取DNA。
步驟2限制性酶消化以提供連接體附著位點(diǎn)使用標(biāo)準(zhǔn)的限制性酶消化方案用諸如Not1的酶消化提取的DNA。
步驟3連接DNA模板和連接體以保護(hù)DNA片段的近端不受核酸外切酶的消化(例如Bal31)這一方法涉及使用Bal31核酸酶造成單向DNA缺失(MukaiS.，Shibahara S.，Morisawa H.Nucleic Acids Research SymposiumSeries no.19，1998)。原理建立在7bp的2’-O-甲基核糖核苷酸-DNA嵌合連接體形成更大的穩(wěn)定性這一事實(shí)基礎(chǔ)上并且也因?yàn)槲蛔枳柚购怂崦腹糇饔?。因此，連接到DNA片段上的Not1位點(diǎn)將允許僅從一端消化。
DNA和連接體以及連接酶和緩沖液在15℃孵育過夜。
步驟4用諸如Bal31的核酸外切酶消化連接的DNA模板和連接體30℃下20分鐘時(shí)間每微克DNA使用1單位Bal31產(chǎn)生單一梯度的缺失(1kb)。通過加入EDTA使終濃度達(dá)50mM.中止反應(yīng)(圖3)。用乙醇沉淀DNA，從Bal31反應(yīng)物中去除高濃度NaCl。針對每個(gè)染色體計(jì)數(shù)優(yōu)化濃度和/或暴露時(shí)間變異。在最佳條件下所有母體端粒序列將被消化，而一些胎兒端粒DNA序列會(huì)保留(圖3a)。這允許鑒別母體和胎兒DNA片段本身。
延長的消化將去除對應(yīng)于染色體特異性引物位點(diǎn)的DNA序列(圖3b)，這將允許Q-PCR之后胎兒DNA的陽性鑒定和相應(yīng)染色體的計(jì)數(shù)。
步驟5使用生物素化端粒探針進(jìn)行胎兒DNA的磁純化通過在65℃加熱DNA10分鐘，在溶液中雜交DNA片段和生物素化的端粒DNA引物，加入生物素化的引物，使溶液在室溫下冷卻。然后用0.5x SSC洗滌鏈親和素順磁顆粒(SA-PMP)。加入退火的DNA片段和生物素化的端粒引物，在室溫下孵育10分鐘。使用磁臺(tái)(magnetic stand)捕獲與生物素化引物結(jié)合的SA-PMPs，小心去掉上清液。用0.1x SSC洗滌顆粒4次。通過在去離子水中再懸浮最終的SA-PMP顆粒洗脫端粒陽性(胎兒)片段。
步驟6使用染色體特異性多態(tài)標(biāo)記物的Q-PCR使用如我們的出版物Verma et al.，The Lancet 352，9-12，1998描述的標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)進(jìn)行定量PCR。
實(shí)施例2下文中的示意圖1說明了使用本發(fā)明的方法進(jìn)行分析的流程。
步驟1在珀可梯度中制備血液樣品在珀可(Percoll)梯度中制備血液樣品并去除血漿。使用標(biāo)準(zhǔn)方案改進(jìn)的不連續(xù)珀可梯度通過離心回收血漿細(xì)胞(見例如Van Wijke etal.Clinical Chemistry 46，5，729-731，2000)具體地，在每個(gè)試管中制備溶于PBS中的各3ml 40％、45％和50％珀可溶液(Amersham Pharmacia)。3ml EDTA血液和3ml PBS在15ml聚苯乙烯試管中混合(Sarstedt，Roher 15ml試管，目錄號(hào)62553042)。使用連接到5ml注射器的小管(B.Braun，F(xiàn)ilter Straw目錄號(hào)415020)注入3ml 40％珀可作為底層。將小管尖端穿過血液放置在試管底部并緩慢注入珀可溶液。使用同一小管，分別用45％和50％珀可重復(fù)鋪底層過程兩次。在每種情況下，將小管尖端放置在試管底部并且小心注射以免擾亂梯度。
通常按這種方式對每一測試樣品準(zhǔn)備3-4個(gè)試管。然后將準(zhǔn)備的試管在18-20℃500g下離心30分鐘(不使用離心閘)。
之后，取出試管，取出血漿(頂)層，放入干凈試管。來自不同試管的同一樣品的血漿可以加在一起以確保每管中大約有6ml液體。然后在500g下再離心20分鐘，這次使用離心閘。將產(chǎn)生的細(xì)胞沉淀用6ml PBS洗滌幾次。
步驟2提取高分子量DNA在PBVS中再懸浮血漿細(xì)胞1達(dá)2×105細(xì)胞/50μl2。將等量的瓊脂糖溶液(1.9％NuSieve GTG)加入至細(xì)胞懸液—含1×105細(xì)胞。50μl分配到模子中并允許調(diào)定。然后在50℃下用0.5M EDTA，PH8.0，1％N-Laurylsarcrosine，2mg/ml蛋白酶K處理瓊脂糖栓24-72小時(shí)(盡管O/N孵育可能已經(jīng)足以進(jìn)行我們下游的應(yīng)用)。這一處理消化細(xì)胞膜，允許以后步驟中酶穿通。然后在水中洗滌瓊脂糖栓，在50℃下用PMSF(一種蛋白酶抑制劑)孵育以完全滅活任何存留的進(jìn)行酶處理的蛋白酶K。然后洗滌瓊脂糖栓并儲(chǔ)存在4℃。
注1. 3ml血液含約2×103血漿細(xì)胞2. 1×105細(xì)胞＝1μl DNA用酚∶氯仿(1∶1)提取血漿DNA，乙醇沉淀，用70％乙醇洗滌兩次并小心地再懸浮在水中。
步驟3連接抗核酸酶的連接體如果連接體的連接不必要，此過程可省略，因?yàn)檫@是受存在于瓊脂糖栓中的DNA影響的唯一步驟。Bal31消化和PCR反應(yīng)都不會(huì)受瓊脂糖栓影響。方案允許瓊脂糖被消化成醇可溶性寡糖，這使DNA在不被損害或剪切的情況下更易處理。融化瓊脂糖栓，加入等體積50x緩沖液和1U β-瓊脂糖酶，在45℃下孵育60分鐘。剩下的寡糖和β-瓊脂糖酶不影響隨后的酶反應(yīng)。
為了連接體的連接必須用一種少見的切割物(cutter)切割DNA，例如在人類基因組內(nèi)分別每隔670kb和310kb切割的Asc I或Not I。這將產(chǎn)生適合連接體連接的末端，必須檢查端粒和標(biāo)記物之間的限制性位點(diǎn)以確保這些酶不在此區(qū)域內(nèi)切割。
在100μl 1x限制性緩沖液中用10U酶平衡瓊脂糖栓，孵育2小時(shí)，然后用水漂洗。
含硫代磷酸酯鍵的互補(bǔ)的寡核苷酸將被退火產(chǎn)生抗核酸酶消化的連接體。它們也將包含與用于切割DNA樣品的限制性內(nèi)切酶互補(bǔ)的粘性末端。通過加入1x連接緩沖液，5U連接酶并在37℃下孵育2小時(shí)來連接連接體。
步驟4Bal31核酸酶消化端粒末端包含高分子量DNA的瓊脂糖栓在1ml 1x Bal 31緩沖液中平衡30分鐘，50U酶(NEBL)放置在冰上30分鐘。通過放置反應(yīng)物于30℃開始反應(yīng)，在0，30，60，90和120分鐘的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出瓊脂糖栓并加入1ml冰冷的TE。通過在冰上用水漂洗栓30分鐘去掉Bal31。Bal31在PCR熱變性步驟應(yīng)完全滅活。首先采集時(shí)間點(diǎn)確定去除需要長度的DNA需要的消化時(shí)間以允許區(qū)分有更長的端粒的胎兒DNA。
步驟5通過QF-PCR擴(kuò)增多態(tài)標(biāo)記物使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過QF-PCR擴(kuò)增多態(tài)標(biāo)記物(參見例如，Verma etal.，Lancet，352，9-12，1998；Pertl et al.，Amer.J.Obstet.Gynecol.177，4，899-906)。
X22標(biāo)記物(離端粒起約300kb)是可以用這種方式擴(kuò)增的特別的標(biāo)記物，但可以依靠診斷的特別目的選擇其他端粒多態(tài)性標(biāo)記物。例如，14號(hào)染色體上的兩個(gè)高度多態(tài)性標(biāo)記物D14S1419和D14S1420位于距端粒約210kb和95kb處。
實(shí)施例3使用本發(fā)明的方法進(jìn)行胎兒21三體唐氏綜合征的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷實(shí)施例3A
1.妊娠和血液樣品在書面知情同意并收到當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)的倫理批準(zhǔn)后，通過靜脈穿刺從一孕12周的懷孕婦女抽取12ml血液收集到2個(gè)依地酸(EDTA)試管中。
2.從核區(qū)室(nuclear compartment)和血漿分離細(xì)胞使用3倍密度梯度(Triple Density Gradient)從母體血液分離來自核區(qū)室和來自血漿的有核細(xì)胞，按照(Ganshirt etal.，Diagnostic Cytogenetics，Springer Lab Manual，1999 R.-D.Wagner，F(xiàn)etal Cells in Maternal blood，pp 401-415)所述方案的細(xì)微修改。
將12ml EDTA血液加入12ml磷酸鹽緩沖液(PBS)，通過倒置試管進(jìn)行混合。將6ml血液/PBS混合物移液至四個(gè)15ml的聚苯乙烯試管。使用與注射器連接的又長又細(xì)的小管將三層PercollR(AmershamPharmacia)鋪在底層。首先鋪3ml 40％珀可，隨后是3ml 45％和3ml 50％珀可。然后將懸浮液在500g下離心30分鐘。取出血漿層和淋巴細(xì)胞層并轉(zhuǎn)移到干凈試管中并再次在500g下離心10分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞沉淀并轉(zhuǎn)移到含5μl蛋白酶K溶液的微量管中(400mg/l蛋白酶K，20mmol/l二硫蘇糖醇，1.7μmol/l十二烷基硫酸鈉，10mmol/l Tris緩沖液，50mmol/l氯化鉀)。
3.提取高分子量DNA血漿細(xì)胞以2×105細(xì)胞/50μl重新懸浮在PBVS中。將等量瓊脂糖溶液(1.9％NuSieve GTG)加入細(xì)胞懸浮液—含1×105細(xì)胞。50μl分配給模子并允許設(shè)定。然后在50℃下用0.5M EDTA，PH8.0，1％N-Laurylsarcrosine，2mg/ml蛋白酶K處理瓊脂糖栓24-72小時(shí)。然后用水洗滌瓊脂糖栓，50℃下在PMSF(一種蛋白酶抑制劑)中孵育以完全滅活任何遺留的進(jìn)行酶處理的蛋白酶K。
4.連接耐核酸酶的連接體融化瓊脂糖栓，加入等量的50x緩沖液和1U β-瓊脂糖，并在45℃下孵育60分鐘。瓊脂糖栓在100μl 1x限制緩沖液中和10U酶一起平衡，孵育2小時(shí)，然后用水漂洗。
然后通過加入1x連接酶緩沖液，5U連接酶，并在37℃下孵育2小時(shí)連接連接體。
5.Bal31核酸酶消化端粒末端含高分子量DNA的瓊脂糖栓在1ml 1x Bal31緩沖液中平衡30分鐘，5U酶(NEBL)放置冰上30分鐘。通過放置反應(yīng)物在30℃下開始反應(yīng)，在0，30，60，90和120分鐘的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出栓并放入1ml冰冷的TE。通過在冰上用水漂洗栓30分鐘去掉Bal31。
6.通過QF-PCR擴(kuò)增多態(tài)標(biāo)記物通過常規(guī)技術(shù)使用D21S1411和D21S1446的引物進(jìn)行一種多重?zé)晒釶CR測定(參見例如Pertl et al 1997 Am.J.Obstet.Gynecol.177，899-906)。每一個(gè)前向引物用熒光燃料標(biāo)記(5’末端)以便能看見和分析PCR產(chǎn)物。在最初變性之后，進(jìn)行24個(gè)循環(huán)的95℃48秒，60℃48秒和72℃1分鐘，隨后72℃下延伸15分鐘。
7.分析將等位基因片段溶解在6％變性聚丙烯酰胺凝膠中，并運(yùn)行Genescan 672軟件在應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems)(Warrington)373 DNA測序儀上分析。測定擴(kuò)增產(chǎn)物尺寸，根據(jù)在電泳圖譜上看到的峰面積計(jì)算它們的熒光強(qiáng)度。分析(a)直接來自母體血液樣品中淋巴細(xì)胞的DNA，(b)酶消化后來自同一類型細(xì)胞的DNA，和(c)酶消化后來自母體樣品血漿成分中細(xì)胞的DNA(預(yù)期含富集的胎兒細(xì)胞)。
8.結(jié)果(a)來自母體血液樣品淋巴細(xì)胞DNA的PCR產(chǎn)物的電泳圖顯示相應(yīng)兩個(gè)引物D21S1411和D21S1446中的每一個(gè)有兩個(gè)大小相等的峰。對于正常女性中這一結(jié)果是預(yù)期的。
(b)來自母體血液樣品淋巴細(xì)胞DNA的PCR產(chǎn)物的電泳圖，在用2UBal31核酸外切酶消化20分鐘后，顯示最遠(yuǎn)端標(biāo)記物D21S1446的信號(hào)缺失，然而在近端標(biāo)記物D21S1411的位置見到兩個(gè)大小相等的信號(hào)。
這提示這些酶切條件對于我們鑒別母體和胎兒DNA的目的是最佳的。
(c)來自母體血漿中細(xì)胞的DNA的電泳圖，在與(b)一樣的條件下進(jìn)行酶消化后顯示近端標(biāo)記物D21S1411不清晰的信號(hào)，但遠(yuǎn)端標(biāo)記物D21S1446有3條清晰信號(hào)。
這些結(jié)果提示首先端粒DNA序列已完全被消除(同時(shí)從母體和胎兒DNA)。第二，近端標(biāo)記物D21S1411 DNA序列不清晰的信號(hào)被解釋為母體和胎兒DNA的混合引起。第三，我們推斷遠(yuǎn)端標(biāo)記物D21S1446的三個(gè)清晰信號(hào)(其中一個(gè)位于某位置，該位置與在來自母體血液樣品淋巴細(xì)胞DNA的電泳圖中見到的母體位置不同)是胎兒的，并且顯示胎兒有21三體。
9.總結(jié)本實(shí)施例說明通過酶消化端粒和亞端粒DNA序列之后進(jìn)行母體血液樣品的DNA分析，有可能常規(guī)計(jì)數(shù)21號(hào)染色體的數(shù)目并因此鑒定胎兒21三體唐氏綜合征。過程迅速，結(jié)果可在血液樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室的同一天內(nèi)獲得。另外，基本自動(dòng)化是可能的。
實(shí)施例3B1.妊娠和血液樣品在書面知情同意并收到當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)的倫理批準(zhǔn)后，通過靜脈穿刺從一孕12周的懷孕婦女抽取12ml血液收集到2個(gè)依地酸(EDTA)試管中。
2.從核區(qū)室(nuclear compartment)和血漿分離細(xì)胞使用3倍密度梯度(Triple Density Gradient)從母體血液分離來自核區(qū)室和來自血漿的有核細(xì)胞，按照(Ganshirt etal.，Diagnostic Cytogenetics，Springer Lab Manual，1999 R.-D.Wagner，F(xiàn)etal Cells in Maternal blood，pp 401-415)所述方案的細(xì)微修改。
將12ml EDTA血液加入12ml磷酸鹽緩沖液(PBS)，通過倒置試管進(jìn)行混合。將6ml血液/PBS混合物移液至四個(gè)15ml的聚苯乙烯試管。使用與注射器連接的又長又細(xì)的小管將三層PercollR(AmershamPharmacia)鋪在底層。首先鋪3ml 40％珀可，隨后3ml 45％和3ml 50％珀可。然后將懸浮液在500g下離心30分鐘。取出血漿層和淋巴細(xì)胞層并轉(zhuǎn)移到干凈試管中并再次在500g下離心10分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞沉淀并轉(zhuǎn)移到含5μl蛋白酶K溶液的微量管中(400mg/l蛋白酶K，20mmol/l二硫蘇糖醇，1.7μmol/l十二烷基硫酸鈉，10mmol/l Tris緩沖液，50mmol/l氯化鉀)。
3.核酸外切酶消化在30℃下經(jīng)過20分鐘時(shí)間每微克DNA使用1單位Bal31以產(chǎn)生單一梯度的缺失(＞1kb)。通過加入EDTA達(dá)終濃度50mM以終止反應(yīng)。
首先對淋巴細(xì)胞的DNA進(jìn)行酶消化以校準(zhǔn)最佳去除DNA序列以鑒別胎兒和母體DNA所需的濃度和時(shí)間。這種情況選擇的引物是位于21q22.3的D21S1446和D21S1411(D21S1411位于D21S1446近端)以及端粒DNA序列TTAGGG的引物。
設(shè)定區(qū)分母體和胎兒信號(hào)的最佳條件以去除端粒加母體血液樣品淋巴細(xì)胞(首先是母體細(xì)胞)DNA的標(biāo)記物D21S1446。按步驟4和5描述的進(jìn)行評價(jià)。然后在這些證實(shí)的最佳條件下用Bal31對從母體血漿分離的細(xì)胞(母體細(xì)胞和富集的胎兒細(xì)胞的混合物)進(jìn)行酶消化。
4.多重PCR通過常規(guī)技術(shù)(參見例如Pertl et al.，1997Am.J.Obstet.Gynecol.177，899-906)使用D21S1411和D21S1446的引物進(jìn)行多重?zé)晒釶CR測定。每一個(gè)前向引物用熒光染料標(biāo)記(5’端)以便能看見和分析PCR產(chǎn)物。最初變性之后，進(jìn)行24個(gè)循環(huán)的95℃48秒，60℃48秒和72℃1分鐘，隨后72℃下延伸15分鐘。
5.分析將等位基因片段溶解在6％變性聚丙烯酰胺凝膠中，并運(yùn)行Genescan 672軟件在應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems)(Warrington)373 DNA測序儀上分析。測定擴(kuò)增產(chǎn)物尺寸，根據(jù)在電泳圖譜上看到的峰面積計(jì)算它們的熒光強(qiáng)度。進(jìn)行分析(a)直接來自母體血液樣品中淋巴細(xì)胞的DNA，(b)酶消化后來自同一類型細(xì)胞的DNA，和(c)酶消化后來自母體樣品血漿成分中細(xì)胞的DNA(預(yù)期含富集的胎兒細(xì)胞)。
6.結(jié)果(a)來自母體血液樣品淋巴細(xì)胞DNA的PCR產(chǎn)物的電泳圖顯示相應(yīng)兩個(gè)引物D21S1411和D21S1446中的每一個(gè)有兩個(gè)大小相等的峰。對于正常女性中這一結(jié)果是預(yù)期的。
(b)來自母體血液樣品淋巴細(xì)胞DNA的PCR產(chǎn)物的電泳圖，在用2UBal31核酸外切酶消化20分鐘后，顯示最遠(yuǎn)端標(biāo)記物D21S1446的信號(hào)缺失，然而在近端標(biāo)記物D21S1411的位置見到兩個(gè)信號(hào)。
這提示這些酶切條件對于我們鑒別母體和胎兒DNA的目的是最佳的。
(c)來自母體血漿中細(xì)胞的DNA的電泳圖，在與(b)一樣的條件下進(jìn)行酶消化后顯示近端標(biāo)記物D21S1411不清晰的信號(hào)，但遠(yuǎn)端標(biāo)記物D21S1446有3條清晰信號(hào)。
這些結(jié)果提示首先端粒DNA序列已完全被消除(同時(shí)從母體和胎兒DNA)。第二，近端標(biāo)記物D21S1411 DNA序列不清晰的信號(hào)被解釋為母體和胎兒DNA的混合引起。第三，我們推斷遠(yuǎn)端標(biāo)記物D21S1446的三個(gè)清晰信號(hào)(其中一個(gè)位于某位置，該位置與在來自母體血液樣品淋巴細(xì)胞DNA的電泳圖中見到的母體位置不同)是胎兒的，并且顯示胎兒有21三體。
總結(jié)本實(shí)施例說明通過酶消化端粒和亞端粒DNA序列之后進(jìn)行母體血液樣品的DNA分析，有可能常規(guī)計(jì)數(shù)21號(hào)染色體的數(shù)目并因此鑒定胎兒21三體唐氏綜合征。在此實(shí)施例中，DNA降解程度低，并且因此有可能不需使用連接體就能進(jìn)行診斷分析。象實(shí)施例3A一樣，分析迅速，結(jié)果可在血液樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室的同一天內(nèi)獲得；并且基本自動(dòng)化是可能的。
權(quán)利要求
1.一種在含母體DNA的樣品中鑒定胎兒DNA的方法，所述方法包括(a)從所述樣品分離DNA，(b)使用酶將所述DNA進(jìn)行核酸外切消化以便去除所述DNA的末端區(qū)域，和(c)檢測作為所述消化過程的結(jié)果的保留在胎兒DNA中但母體DNA缺乏的一種DNA序列的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述含母體DNA的樣品是血液或陰道樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中在初步步驟中，首先從母體血漿分離細(xì)胞，然后按步驟(a)從這些細(xì)胞中分離DNA。
4.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(b)之前用限制性酶將來自步驟(a)的DNA切成片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中在核酸外切消化之前保護(hù)DNA片段的切端，使得它們不易被核酸外切酶消化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中用于形成DNA片段的限制性酶是進(jìn)行切割以便為保護(hù)性部分提供結(jié)合位點(diǎn)的酶，并且通過連接該保護(hù)性部分實(shí)現(xiàn)保護(hù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中保護(hù)性部分是連接體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中連接體是2’-O-甲基核糖核苷酸DNA或含硫代磷酸酯鍵的互補(bǔ)寡核苷酸。
9.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中胎兒DNA從母體DNA分離。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中通過將消化后保留在胎兒DNA中的端粒DNA序列的特異性生物素化探針雜交到所述DNA上并隨后固定所述探針至鏈親和素覆蓋的載體上來分離胎兒DNA片段。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述鏈親和素覆蓋的載體包括順磁顆粒。
12.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中保留在胎兒DNA中的所述DNA序列是端粒序列或位于端粒區(qū)域近端的染色體標(biāo)記。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中保留在胎兒DNA中的所述DNA序列是端粒序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中保留在胎兒DNA中的所述DNA序列是亞端粒多態(tài)性染色體特異性標(biāo)記。
15.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述DNA序列用對所述序列特異的第一標(biāo)記的探針檢測。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記。
17.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中核酸外切酶是Bal31。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至16的任一項(xiàng)的方法，其中核酸外切消化按以下步驟實(shí)現(xiàn)第一步，去除3’延伸DNA；第二步，切除3’-5’ss區(qū)域和第三步，消化ss區(qū)域。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中第一步使用綠豆核酸酶實(shí)現(xiàn)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的方法，其中第二步使用核酸外切酶III實(shí)現(xiàn)。
21.根據(jù)權(quán)利要求18至20任一項(xiàng)的方法，其中第三步使用綠豆核酸酶實(shí)現(xiàn)。
22.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中樣品中胎兒來源的DNA的數(shù)量被確定。
23.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中樣品中的胎兒DNA被擴(kuò)增。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中PCR用于定量測定樣品中胎兒DNA的數(shù)量，或擴(kuò)增樣品進(jìn)行基因分析。
26.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中對鑒定的胎兒DNA進(jìn)行產(chǎn)前診斷。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中該診斷檢測染色體畸變。
28.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中在步驟(c)之前，根據(jù)大小分離DNA。
29.根據(jù)權(quán)利要求25至27中任一項(xiàng)的方法，其中用對特定染色體或DNA診斷區(qū)域特異的被標(biāo)記引物擴(kuò)增被鑒定為胎兒來源的分離的DNA。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述第二引物攜帶一個(gè)熒光標(biāo)記。
31.根據(jù)權(quán)利要求25或26的方法，其中使用熒光標(biāo)記的引物擴(kuò)增胎兒DNA，并且被擴(kuò)增序列對一種染色體或DNA狀況有診斷意義。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述引物擴(kuò)增對染色體18、21、13、X或Y特異的一種序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，它用于診斷母體狀況。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中該狀況是先兆子癇，預(yù)測早產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，和以后發(fā)生自身免疫病的危險(xiǎn)。
35.一種在母體血液或陰道樣品中鑒定胎兒DNA的試劑盒，所述試劑盒包含從血液或陰道樣品中提取DNA的工具，一種能消化DNA的核酸外切酶，和一種適于檢測位于DNA末端區(qū)域的特異性DNA序列的被標(biāo)記引物。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的試劑盒，它進(jìn)一步包含一種限制性酶，它切割DNA以便在DNA上產(chǎn)生連接體的結(jié)合位點(diǎn)，該連接體適于保護(hù)DNA片段的切端免受酶消化。
37.根據(jù)權(quán)利要求34或35的試劑盒，它進(jìn)一步包含適于保護(hù)DNA片段的切端免受酶消化的連接體。
38.根據(jù)權(quán)利要求34至37的任一項(xiàng)的試劑盒，它進(jìn)一步包含一個(gè)生物素化的端粒探針。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的試劑盒，它進(jìn)一步包含鏈親和素包被的順磁顆粒。
40.根據(jù)權(quán)利要求34至39的任一項(xiàng)的試劑盒，它包含診斷一種染色體狀況的被標(biāo)記引物。
41.一種基本上如前文所描述的在含母體DNA的樣品中鑒定胎兒DNA的方法。
42.一種基本上如前文所描述的在含母體DNA的樣品中鑒定胎兒DNA的試劑盒。
全文摘要
一種在含母體DNA的樣品，諸如血液或陰道樣品中鑒定胎兒DNA的方法，所述方法包括(a)從所述樣品分離DNA，(b)使用一種酶將所述DNA進(jìn)行核酸外切消化以去除每一種DNA分子的末端區(qū)域，和(c)檢測作為所述消化過程的結(jié)果的胎兒DNA中保留而母體DNA中缺少的一種DNA序列的存在。一旦鑒定，胎兒DNA可用于診斷，例如檢測染色體/DNA異常，特別是包括諸如胎兒21三體的非整倍體。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1452665SQ0181535
公開日2003年10月29日 申請日期2001年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月10日
發(fā)明者M·A·赫爾頓 申請人:賽姆格有限公司