本發(fā)明涉及物種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鯰魚dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測序列及其在物種鑒定中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鯰魚(學(xué)名：silurusasotus)屬于輻鰭魚亞綱鯉形目鯉科鯽屬，是中國的特有物種。鯰魚的同類幾乎是分布在全世界，多數(shù)種類是生活在或河川等的淡水中，但部分物種生活在海洋里。目前，對鯰魚的物種識別僅局限于形態(tài)學(xué)鑒定，而且專業(yè)鑒定人員很少。由于長江上游水壩修筑導(dǎo)致產(chǎn)卵地遭到破壞；加之外來物種的入侵及水體污染導(dǎo)致鯰魚的生存環(huán)境遭受嚴(yán)重破壞，所以鯰魚的種群數(shù)量日益下降。因此，對鯰魚地方特有種進(jìn)行有效鑒定以及物種保護(hù)已經(jīng)刻不容緩。

dna條形碼技術(shù)(dnabarcoding)是指用基因組內(nèi)一段標(biāo)準(zhǔn)的、短的dna片段來鑒定物種的一項(xiàng)分子鑒定新技術(shù)，可以快速、準(zhǔn)確的進(jìn)行物種鑒定。目前在動物中最常見的分子標(biāo)記是線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基i(cytochromecoxidasei,coi)基因的部分序列。dna條形碼具有廣泛的應(yīng)用前景，在物種鑒定、分子進(jìn)化、種群遺傳、瀕危物種保護(hù)等研究領(lǐng)域具有一定的發(fā)展?jié)摿?。dna條形碼不同于以往的傳統(tǒng)鑒別方法，對研究人員的專業(yè)技能并無較高要求，上至生物學(xué)家，下至普通生物愛好者，都可在短時(shí)間內(nèi)掌握該技術(shù)。dna條形碼技術(shù)擺脫了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法依賴長期經(jīng)驗(yàn)的障礙，可實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確的鑒定，是分子鑒定方法學(xué)上的創(chuàng)新，操作簡單、效率高、應(yīng)用廣等特點(diǎn)無疑將改變整個(gè)物種鑒定領(lǐng)域的發(fā)展方向。運(yùn)用dna條形碼技術(shù)，可以很好的對鯰魚進(jìn)行快速、有效的鑒定。

物種鑒定一直是分類學(xué)乃至幾乎所有生物領(lǐng)域上的研究至關(guān)重要的基礎(chǔ)步驟。因此，準(zhǔn)確的對物種鑒定，特別是對那些稀有物種和具有保護(hù)意義的種類，分類鑒定工作就顯得尤其重要。自從2003年，加拿大科學(xué)家hebert提出以coi基因做為dna條形碼以來，越來越多的研究表明dna條形碼在物種分類上具有高效可行性。大量的研究結(jié)果顯示以coi基因?yàn)闃?biāo)記的dna條形碼能夠準(zhǔn)確的對各類動物進(jìn)行物種鑒定，可以選用coi基因作為各種動物條形碼數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)條形碼。

該方法與傳統(tǒng)的分類學(xué)方法互為佐證，不僅可以解決鑒定中標(biāo)本殘缺不全無法準(zhǔn)確鑒定等問題，而且有利于快速鑒定。目前已有專門的魚類數(shù)據(jù)庫，其中包括1.5萬多種魚類的條形碼數(shù)據(jù)。但是我國許多魚類由于其特有性，沒有足夠的相關(guān)數(shù)據(jù)。也沒有鯰魚的相關(guān)基因序列。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提出一種鯰魚dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測序列及其在物種鑒定中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的鯰魚dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測序列有利于實(shí)現(xiàn)鯰魚的分子鑒定，能有效縮短鑒定時(shí)間。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種鯰魚dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測序列，所述條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測序列為coi基因，其序列如seqidno:1所示(160bp)：

cctccttcctactactattagcctcctctggagttgaagcaggagcaggaacagggtggacagtttacccccctcttgcaggaaaccttgcccacgcaggagcttctgtagatttaacaatcttttcattacatctcgcaggggtgtcctccattcttgg。

用于擴(kuò)增上述的鯰魚dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測序列的引物對，所述引物對的正向引物序列如seqidno:2所示，反向引物對序列如seqidno:3所示。

上述的鯰魚dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測序列、上述的引物在制備用于鑒定鯰魚的試劑盒中的應(yīng)用。

一種用于鑒定鯰魚的試劑盒，它包括上述的引物對。該試劑盒還包括pcr技術(shù)常用試劑。

一種重組載體，包含上述的鯰魚dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測序列。

上述的鯰魚dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測序列、引物對、試劑盒在鑒定鯰魚中的應(yīng)用。

一種鯰魚的分子鑒定方法，包括以下步驟：

(1)從待鑒定組織樣本中分離提取基因組dna；

(2)以步驟(1)所得基因組dna為模板，采用一對引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增；

所述引物的正向引物序列和反向引物序列分別如seqidno:2和seqidno:3所示；

seqidno:2如下：

5’-cctccttcctactactat-3’；

seqidno:3如下：

5’-ccaagaatggaggacacc-3’；

(3)將步驟(2)所得聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果，如果能特異性擴(kuò)增出170±10bp的條帶，則將其進(jìn)行測序分析；

(4)根據(jù)測序結(jié)果，如果與如seqidno:1所示的核苷酸序列的同源性在98％以上，即可判斷該待鑒定組織為鯰魚。

步驟(2)中所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的條件為：95℃變性5min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

步驟(2)中所述pcr反應(yīng)體系(25μl)：10×pcrbuffer2.5μl，dntps0.5μl，taq(5u/μl)0.2μl，mgcl21.5μl，nycoi-f2引物(10μm)1μl，nycoi-r2引物(10μm)1μl，dna模板(約10ng/μl)1μl，ddh2o補(bǔ)足25μl。

上述鯰魚的分子鑒定方法流程圖如圖1所示。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明提供了一種用于鑒定鯰魚的dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測序列。該dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測序列的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了對較小的鯰魚無法準(zhǔn)確鑒定的個(gè)體以及形態(tài)相近的個(gè)體采用可靠的dna分子鑒定技術(shù)，快速、準(zhǔn)確的鑒定鯰魚；克服了現(xiàn)有技術(shù)中的如下不足：對完整的個(gè)體鑒定需要對鯰魚形態(tài)非常熟悉的專業(yè)人員；與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法相比，有效的縮短了鑒定時(shí)間。

(2)本發(fā)明提供的分子鑒定方法中的pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，重復(fù)性高，經(jīng)多次試驗(yàn)穩(wěn)定性好。

附圖說明

圖1是本發(fā)明提供的鯰魚的分子鑒定方法的流程示意圖。

圖2是實(shí)施例1中的鯰魚肌肉組織的coi基因pcr擴(kuò)增結(jié)果電泳鑒定圖；其中，泳道m(xù)為dna標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)，泳道1,2為空白對照，泳道3,4為目的片段鯰魚肌肉組織的coi基因，檢出大小為170bp左右的條帶，泳道5,6為陰性對照。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1：

1、待測樣本的采集、保存與處理

從浸泡標(biāo)本中剪取鯰魚的部分肌肉組織，保存在95％酒精中于-20℃冰箱中存放。

2、dna提取

生物公司試劑盒方法提取樣品中的dna，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、pcr引物合成

本方法選取1對引物：

nycoi-f2:5’-cctccttcctactactat-3’(seqidno:2)；

nycoi-r2:5’-ccaagaatggaggacacc-3’(seqidno:3)；

4、pcr反應(yīng)體系(25μl)

5、pcr反應(yīng)程序

反應(yīng)結(jié)束后，打開pcr儀，取出完成擴(kuò)增的樣品，于4℃保存

6、pcr產(chǎn)物檢測

取2μlpcr產(chǎn)物，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳(120v，200ma，25min)，genegreen染料染色。凝膠成像系統(tǒng)檢測，電泳圖譜如圖2所示，檢出大小約為170±10bp的條帶，可初步判定待測樣本可能是鯰魚。

7、基因序列測定

選取效果較好的pcr產(chǎn)物送至生物公司純化后測序，測序結(jié)果顯示其序列如seqidno:4所示，seqidno:4序列如下：

cctccttcctactactattagcctcctctggagttgaagcaggagcaggaacagggtggacagtttacccccctcttgcaggaaaccttgcccacgcaggagcttctgtagatttaacaatcttttcattacatctcgcaggggtgtcctccattcttgg

經(jīng)同源性比對發(fā)現(xiàn)，seqidno:4所示核苷酸序列與如seqidno.1所示核苷酸序列的同源性為99％，因而可判定該待測樣本即為鯰魚的組織樣本。

實(shí)施例2：

從魚類組織樣本(殘缺不全，無法進(jìn)行生物學(xué)鑒定)中選取2組肌肉組織樣，保存在95％酒精中。選取的肌肉組織分屬兩組不同品種的魚類，其中一組為鯰魚(10個(gè)樣品)，另一組為其他品種(10個(gè)樣品)，取樣人根據(jù)具體信息做好品種記錄并編號，實(shí)驗(yàn)操作人員在不清楚2組樣本品種歸屬的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用與實(shí)施例1相同的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，pcr產(chǎn)物測序結(jié)果顯示其中一組的10個(gè)樣品為鯰魚的組織樣本，另一組的10個(gè)樣品為非鯰魚的組織樣本，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同取樣人記錄信息完全一致。

上述實(shí)施例為本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>鎮(zhèn)江華大檢測有限公司

<120>一種鯰魚dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測序列及其應(yīng)用

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<213>未知

<221>樣品pcr擴(kuò)增產(chǎn)物序列

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