本發(fā)明涉及一種熱穩(wěn)定性提高的β-淀粉酶突變體，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

β-淀粉酶又稱(chēng)為麥芽糖苷酶、糖原淀粉酶，其系統(tǒng)名為α-1,4-葡聚糖-4-麥芽糖水解酶(α-1,4-dglucanmaltohydrolase)，e.c.編號(hào)為3.2.1.2.作用于淀粉時(shí)，從其非還原性末端順次切下麥芽糖，水解產(chǎn)物是β-麥芽糖、β-極限糊精及非常少量的β-葡萄糖。β-淀粉酶具有相當(dāng)大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，長(zhǎng)期以來(lái)植物來(lái)源的大麥β-淀粉酶一直被廣泛用于多個(gè)領(lǐng)域。例如，在啤酒發(fā)酵業(yè)中部分代替大麥芽用于啤酒的生產(chǎn)，在食品業(yè)中用于水解淀粉制造麥芽糖漿和飴糖等。自1974年higashihara等人首次確定巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)胞外淀粉酶含有β-淀粉酶以來(lái)，相繼發(fā)現(xiàn)了幾種能夠產(chǎn)生該酶的微生物，這些菌株大都屬于細(xì)菌，如蠟狀芽孢桿菌(bacilluscereus)、多粘芽孢桿菌(bacilluspolymyxa)、環(huán)狀芽孢桿菌(bacilluscirculans)、高溫放線菌(thermeoactinomycessp.)和熱硫梭菌(clostridiumthermosulfurogenes)等。與植物β-淀粉酶相比，微生物來(lái)源的β-淀粉酶具有便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，因此篩選尋找理想的微生物β-淀粉酶源成為淀粉酶研究應(yīng)用領(lǐng)域的一個(gè)重要目標(biāo)。

定向進(jìn)化屬于蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計(jì)，不需要事先了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化機(jī)制、保守序列等因素，而是通過(guò)模擬自然進(jìn)化機(jī)制來(lái)為酶基因創(chuàng)造體外進(jìn)化的條件，進(jìn)而對(duì)目的蛋白進(jìn)行分子改造，并定向篩選研究進(jìn)化酶的酶學(xué)性質(zhì)。易錯(cuò)pcr技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的定向進(jìn)化方法之一，具有操作方便、快速、高效的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于微生物來(lái)源β-淀粉酶的研究，目前主要是圍繞不同宿主的克隆表達(dá)、酶學(xué)定性，而針對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)的分子改造顯得較少，在定向進(jìn)化研究其熱穩(wěn)定性方面，尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明人在前期的研究中從菜地土壤中成功的篩選到了一株高產(chǎn)β-淀粉酶的彎曲芽孢桿菌(bacillusflexus)cctcc2015368的菌株，并將該菌株的β-淀粉酶基因序列克隆出來(lái)，成功的在大腸桿菌(escherichiacoli)宿主中表達(dá)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種熱穩(wěn)定性提高的β-淀粉酶突變體。

所述熱穩(wěn)定性提高的β-淀粉酶突變體，是對(duì)親本彎曲芽孢桿菌(bacillusflexus)cctcc2015368β-淀粉酶進(jìn)行定向進(jìn)化，通過(guò)分子進(jìn)化的手段之一易錯(cuò)pcr技術(shù)，獲得β-淀粉酶突變體。親本β-淀粉酶氨基酸序列如seqidno：1所示。采用“原始氨基酸-替換位置-突變后氨基酸”來(lái)表示β-淀粉酶突變體，β-淀粉酶突變體為thr461tyr/asp506asn/asp519lys，氨基酸序列為seqidno:2。

用于表達(dá)所述的β-淀粉酶突變體的表達(dá)載體為pet24a(+)；

用于所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物宿主為大腸桿菌(escherichiacoli)。

與親本彎曲芽孢桿菌β-淀粉酶相比(55℃下的半衰期t50為18.0min)，所述β-淀粉酶突變體在55℃下的半衰期t50提高了3倍，達(dá)到54min。本發(fā)明的有益效果：運(yùn)用了分子生物學(xué)的方法對(duì)親本彎曲芽孢桿菌β-淀粉酶進(jìn)行了定向進(jìn)化研究，通過(guò)易錯(cuò)pcr技術(shù)獲得了β-淀粉酶突變體，與親本彎曲芽孢桿菌β-淀粉酶相比(55℃下的半衰期t50為18.0min)，β-淀粉酶突變體在55℃下的半衰期t50提高了3倍，達(dá)到54min。

附圖說(shuō)明

圖1：野生型β-淀粉酶與突變體bea-10的最適溫度比較；

圖2：野生型β-淀粉酶與突變體bea-10在55℃下的熱穩(wěn)定性比較。

具體實(shí)施方式

實(shí)例中涉及到的培養(yǎng)基及試劑配方如下：

lb液體培養(yǎng)基：酵母粉5.0g/l，胰蛋白胨10.0g/l，nacl10.0g/l。

lb固體培養(yǎng)基：在lb液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方上，添加1.0％-2.0％(m/v)的瓊脂。

tb培養(yǎng)基：酵母粉24.0g/l，甘油5.0g/l，胰蛋白胨12.0g/l，k2hpo4·3h2o16.43g/l，kh2po42.31g/l。

sob培養(yǎng)基：胰蛋白胨20.0g/l，酵母粉5.0g/l，mgcl20.952g/l，nacl0.5g/l，kcl0.186g/l。

lb瓊脂淀粉板：在lb液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加可溶性淀粉1g/l，用于突變體的初步篩選。

實(shí)施例1：基于易錯(cuò)pcr技術(shù)構(gòu)建β-淀粉酶突變體文庫(kù)

運(yùn)用易錯(cuò)pcr技術(shù)向彎曲芽孢桿菌β-淀粉酶基因中引入核苷酸突變。易錯(cuò)pcr的反應(yīng)條件如下：

其中上游引物f和下游引物r的序列分別為：

f：(5′-aaccatggcggtaaatggacagtcgtt-3′)；

r：(5′-aactcgagttaccaattattcgtatacgttg-3′)。

pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃4min；98℃10s，53℃10s，72℃1min40s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，并于4℃下保溫。

易錯(cuò)pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠試劑盒膠回收，目的基因與載體pmd-18t連接轉(zhuǎn)化jm109，克隆培養(yǎng)后，用限制酶ncoi和xhoi將目的基因片段回收與經(jīng)過(guò)ncoi和xhoi雙酶切消化后的表達(dá)載體pet24a(+)相連，轉(zhuǎn)化至e.colijm109感受態(tài)細(xì)胞。涂布lb抗性平板(kan)，37℃培養(yǎng)8-10個(gè)小時(shí)，將轉(zhuǎn)化子全部轉(zhuǎn)移至lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并抽提重組突變體質(zhì)粒。

將重組突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化e.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞。在lb平板上(kan)培養(yǎng)獲取β-淀粉酶突變體文庫(kù)。

實(shí)施例2：熱穩(wěn)定性提高的β-淀粉酶突變體的篩選

以pet24a(+)表達(dá)親本β-淀粉酶的大腸桿菌作為對(duì)照菌。

lb瓊脂淀粉板初篩：重組菌e.colibl21(de3)/pet24a(+)-bfa于tb發(fā)酵培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)48h，離心獲得胞外上清，利用高通量篩選系統(tǒng)將96空板中每一個(gè)突變體的發(fā)酵液一一轉(zhuǎn)移到lb瓊脂淀粉板上。37℃下過(guò)夜培養(yǎng)8h左右，用碘液(0.03％w/v)涂布瓊脂淀粉板，觀察透明圈，選取比對(duì)照明顯大的透明圈所對(duì)應(yīng)的突變菌株。

96孔板dns法定量篩選：挑選透明圈比對(duì)照高的突變菌株，用排槍快速將發(fā)酵上清轉(zhuǎn)移到pcr管中(轉(zhuǎn)移前用1：1的磷酸緩沖液與發(fā)酵液混合)，在55℃的金屬浴上保溫40min，采用dns法測(cè)定保溫前與保溫后的酶活，在540nm處下測(cè)定吸光值并記錄數(shù)據(jù)，通過(guò)計(jì)算殘留酶活力從而選出熱穩(wěn)定性有提高的突變株。

實(shí)施例3：酶活分析方法

一個(gè)β-淀粉酶酶活單位(1u)定義(u/ml)：1ml酶液在ph7.0，溫度55℃,1h水解可溶性淀粉生產(chǎn)1mg麥芽糖所需的酶量稱(chēng)為一個(gè)酶活力單位。

測(cè)定方法：準(zhǔn)確吸取0.5ml2％可溶性淀粉溶液，置于15ml比色管中，加0.4ml50mmph7.0磷酸鹽緩沖溶液，搖勻，于55℃水浴預(yù)熱5min，準(zhǔn)確加入100μl酶液，立即計(jì)時(shí)，搖勻，于55℃水浴準(zhǔn)確保溫酶解反應(yīng)10min，立即加入dns1ml，搖勻，并煮沸5min，冰水中冷卻。以同樣條件下用緩沖液代替酶液的反應(yīng)體系作為對(duì)照，上述反應(yīng)體系加10ml蒸餾水，混勻，1cm比色皿，540nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。

實(shí)施例3：β-淀粉酶突變體的純化

將發(fā)酵上清液于4℃，12000rpm離心10min除去細(xì)胞。將上清液置于磁力攪拌器中并緩緩加入45％固體硫酸銨鹽，于4℃過(guò)夜鹽析。然后4℃，12000rpm離心20min。取沉淀物用適量ph7.0，50mm磷酸-檸檬酸緩沖液溶解，通過(guò)0.4μm透析膜過(guò)濾透析后得到濃縮酶樣品。經(jīng)過(guò)凝膠層析柱純化后得到電泳純的β-淀粉酶。

實(shí)施例4：β-淀粉酶突變體的最適溫度和熱穩(wěn)定性

酶分子熱穩(wěn)性的提高可以用半衰期(t50)來(lái)體現(xiàn)。即酶分子的活力降低到初始活力一半時(shí)所需要的時(shí)間。酶的半衰期時(shí)間越長(zhǎng)，則酶的熱穩(wěn)定性越高。反之，它的熱穩(wěn)定就比較差。

以ph7.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉(50mm)為緩沖液，在30-70℃溫度范圍測(cè)定野生型β-淀粉酶及突變體bfa-10(即thr461tyr/asp506asn/asp519lys)的最適溫度。突變體和野生型β-淀粉酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性見(jiàn)圖1和圖2。

從圖1可以得知，野生型和突變體bfa-10β-淀粉酶的最適溫度均為55℃；在30-55℃的溫度范圍內(nèi)，β-淀粉酶的相對(duì)活力沒(méi)有明顯的變化；值得注意的是，當(dāng)溫度升高到60℃和65℃時(shí)，突變體bfa-10能夠保留最初酶活的75％和44％，而野生型僅保留其酶活的37％和23％。在最適溫度55℃的條件下，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)殘留酶活來(lái)確定突變體bfa-10的熱穩(wěn)定性，并與野生型相比較(圖2)；從圖2可知，突變體bfa-10在55℃下的半衰期為54min，而野生型的半衰期只有18min。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。

sequencelisting

<110>江南大學(xué)

<120>一種熱穩(wěn)定性提高的β-淀粉酶突變體

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