本發(fā)明涉及一種寡糖的制備方法，尤其涉及一種聚合度在4-8之間的貽貝寡糖的制備方法。

背景技術：

貽貝(mytilussp.)屬于雙殼類的一種貝類，是海洋貝類養(yǎng)殖中的重要種類，又名海紅，俗稱“海中雞蛋”，味道鮮味，營養(yǎng)豐富。由于貽貝產量大，收獲后不易保存，歷來多煮熟后加工成干品——淡菜。淡菜營養(yǎng)價值很高，并有一定的藥用價值，在《本草綱目》、《本草拾遺》及《日華子本草》中均有記載?，F(xiàn)代藥理學研究表明，貽貝具有提高免疫力、抗腫瘤、清除氧自由基、抗動脈粥樣硬化、降血脂、抑制血栓的形成、改善心肌供氧及保護實驗性心肌缺血、改善微循環(huán)和降血壓等功效。其體內的多糖成分在貽貝的藥用功效中起重要作用，貽貝多糖具有提高免疫力、抗腫瘤、降血脂、預防心腦血管疾病等多種功效。

申請人在申請?zhí)枮?01710351379.4的發(fā)明專利申請中提供了貽貝多糖的結構：貽貝多糖是一種以(1→4)-α-d-glc為主鏈，含有(1→2)-α-d-glc分枝的α-吡喃型葡聚糖，且該多糖具有顯著的降血脂功效。(1→4)-α-d-glc主鏈與淀粉主鏈結構一致，貽貝多糖與淀粉的主要區(qū)別在于貽貝多糖含有(1→2)-α-d-glc分枝，支鏈淀粉含有(1→6)-α-d-glc分枝，直鏈淀粉沒有分支。淀粉主鏈在體內可被α-淀粉酶水解，貽貝多糖的主鏈在體內也應該能被水解，從而生成以(1→2)-α-d-glc分枝為核心的寡糖，該寡糖可能是貽貝多糖發(fā)揮降血脂功能的有效形式。然而，目前國內外尚沒有任何有關貽貝寡糖的報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種工藝簡單、環(huán)保的貽貝寡糖的制備方法，能夠實現(xiàn)快速、低耗、大量生產貽貝寡糖。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案。

一種貽貝寡糖的制備方法，采用以下步驟：

(1)貽貝多糖粉末溶于蒸餾水中，調ph得貽貝多糖溶液；

(2)向步驟(1)中加入水解酶進行酶解，再滅活水解酶得酶解液；

(3)將步驟(2)中酶解液過濾，收集濾液，得貽貝寡糖溶液i；

(4)向步驟(3)所述貽貝寡糖溶液i中加入酵母菌細胞培養(yǎng)，離心取上清，得貽貝寡糖溶液ii；

(5)將步驟(4)制得的貽貝寡糖溶液ii加入活性炭，室溫攪拌，過濾去上清；加入乙醇，室溫攪拌，過濾去上清；再次加入乙醇，室溫攪拌，過濾，收集濾液；濾液干燥后，得到貽貝寡糖樣品。

步驟(1)中，所述貽貝多糖的結構式為：多糖溶液濃度為10％w.t，ph為5.0-7.0。

步驟(2)中，所述酶為α-淀粉酶，優(yōu)選為中溫淀粉酶；加入量為0.1-10g/l；酶解溫度為30-70℃；酶解時間為0.5-10h；滅活條件為100℃，15min。

步驟(3)中，所述濾膜孔徑為0.22μm。

步驟(4)中，所述酵母菌為釀酒酵母，來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(cicc)，編號為1002；酵母菌細胞加入量為5-10％(w/v)；培養(yǎng)條件為30℃、150rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)24-36h；

所述酵母菌細胞通過如下方法制得：采用ypd培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母細胞，28℃培養(yǎng)30-40h，10000rpm離心2-5min；

所述ypd培養(yǎng)基組分如下(質量百分數(shù))：蛋白胨2％，酵母粉1％，葡萄糖2％，ph自然。

步驟(5)中，所述活性炭加入量為1-2mg/ml，攪拌時間為1-3h；第一次加入的乙醇濃度為3％w.t，加入量為貽貝寡糖溶液ii的1倍體積；

第二次加入的乙醇濃度為20％-40％w.t，加入量為貽貝寡糖溶液ii的1/2倍體積；攪拌時間為1h；濾膜孔徑為0.22μm；

干燥方式為冷凍干燥或減壓干燥。

所述貽貝多糖采用以下方法制備：

(1)原料處理：以凍煮貽貝干為原料，粉碎機粉碎，過20-40目篩，得貽貝干粉；

(2)多糖提?。簩⒉襟E(1)制得的貽貝干粉投入提取罐中，加入4-10體積倍的水，在80-100℃提取1-5h，攪拌槳轉速20-100rpm；

(3)除渣：用50-100目篩網(wǎng)分離貽貝肉渣與多糖提取液；

(4)酶解：將步驟(3)制得的多糖提取液調ph至8.0，加入0.05％-0.5％w.t的堿性蛋白酶，50℃酶解0.5-3h，酶解完成后在80-100℃條件下滅活10-20min，得酶解液；

(5)過濾：以硅藻土為助濾劑，用板框過濾對步驟(4)制得的酶解液進行過濾，得到澄清的多糖溶液；

(6)乙醇沉淀：在步驟(5)制得的多糖溶液中加入1.5-3體積倍的90％-95％(v/v)的酒精進行多糖沉淀，靜置3-10h，抽出上清液，得到多糖沉淀；

(7)脫水：在步驟(6)制得的多糖沉淀中加入1體積倍的90％-95％(v/v)的酒精對多糖沉淀進行脫水；

(8)過濾干燥：用400目篩網(wǎng)對脫水后的多糖沉淀進行過濾，收集沉淀，60℃真空干燥，得到白色貽貝多糖成品。

一種上述制備方法制得的貽貝寡糖，聚合度為4-8。

一種上述貽貝寡糖在制備調血脂藥物或食品中的應用。

本發(fā)明通過加入α-淀粉酶將貽貝多糖降解為葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和貽貝寡糖；再加入釀酒酵母細胞進行培養(yǎng)以除去葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖；最后通過活性炭吸附、乙醇洗脫除去未降解的多糖和其他雜質，獲得純度較高的貽貝寡糖。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明提供了一種貽貝寡糖的制備方法，該方法寡糖收率高，工藝簡單，條件溫和，易于放大。同時，本發(fā)明還提供了貽貝寡糖在制備調血脂藥物或食品中的應用，貽貝寡糖有進一步研發(fā)成降血脂藥物和保健食品的前景。

附圖說明

圖1是實施例3貽貝寡糖的薄層層析(tlc)圖；

其中，m：葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖混合標準品；1：貽貝多糖；2：貽貝多糖酶解產物(貽貝寡糖溶液i)；3：酵母細胞處理后的寡糖溶液(貽貝寡糖溶液ii)；4：貽貝寡糖。

具體實施方式

下面結合實施例與附圖對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受下述實施例的限制。

實施例1貽貝多糖制備

(1)原料處理：以浙江省幌淚縣產凍煮厚殼貽貝干為原料，粉碎機粉碎，過20目篩，得貽貝干粉；

(2)多糖提?。簩⒉襟E(1)制得的貽貝干粉投入提取罐中，加入6倍體積的水，在100℃提取2h，攪拌槳轉速60rpm：

(3)除渣：用50目篩網(wǎng)分離貽貝肉渣與多糖提取液：

(4)酶解：將步驟(3)制得的多糖提取液用naoh調ph至8.0，加入質量比為0.2％的堿性蛋白酶，50℃酶解2h，酶解完成后在80℃條件下滅活15min，得酶解液；

(5)過濾：以硅藻土為助濾劑，用板框過濾對步驟(4)制得的酶解液進行過濾，得到澄清的多糖溶液，硅藻土用量為2kg/m²；

(6)乙醇沉淀：在步驟(5)制得的多糖溶液中加入1.5倍體積質量分數(shù)為93％的酒精進行多糖沉淀，靜置6h，抽出上清液，得到多糖沉淀；

(7)脫水：在步驟(6)制得的多糖沉淀中加入1倍體積質量分數(shù)為93％的酒精對多糖沉淀進行脫水；

(8)過濾干燥：用400目篩網(wǎng)對脫水后的多糖沉淀進行過濾，收集沉淀，60℃真空干燥，得到白色貽貝多糖成品，經(jīng)苯酚-硫酸法測定貽貝多糖含量為92％。

實施例2酵母菌細胞制備

(1)斜面培養(yǎng)

將釀酒酵母(cicc編號1002)接種至ypd培養(yǎng)基(質量百分數(shù)：蛋白胨2％，酵母粉1％，葡萄糖2％，瓊脂2％，ph自然)斜面上，28℃培養(yǎng)48h，以無菌水沖洗斜面，制得菌懸液，即種子液。

(2)搖瓶培養(yǎng)

將種子液接入ypd培養(yǎng)基(質量百分數(shù)：蛋白胨2％，酵母粉1％，葡萄糖2％，ph自然)，接種量為5％，28℃培養(yǎng)30h，10000rpm離心3min，棄上清，即得釀酒酵母菌細胞。

實施例3貽貝寡糖制備

(1)實施例1的貽貝多糖粉末溶于蒸餾水中，配制成10％多糖溶液，hcl調ph至5.5，得貽貝多糖溶液；

(2)向步驟(1)所述貽貝多糖溶液中加入中溫α-淀粉酶使其濃度為0.5g/l，50℃保溫0.5h，100℃滅活15min，得貽貝多糖水解液；

(3)步驟(2)所述貽貝多糖水解液用0.22μm濾膜過濾，收集濾液，得貽貝寡糖溶液i；

(4)向步驟(3)所述貽貝寡糖溶液i中按照8％質量體積比加入實施例1的酵母菌細胞，30℃、150rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)30h，離心取上清，得貽貝寡糖溶液ii；

(5)將步驟(4)制得的貽貝寡糖溶液ii按每毫升1mg加入活性炭，室溫攪拌1h，去上清；加入與貽貝寡糖溶液ii等體積的質量百分比3％的乙醇，室溫攪拌1h，去上清；加入貽貝寡糖溶液ii二分之一體積的質量百分比25％的乙醇，室溫攪拌1h，0.22μm濾膜過濾，收集濾液；濾液冷凍干燥，得到貽貝寡糖樣品。

經(jīng)硫酸-苯酚法檢測，該寡糖純度為92％。

對貽貝多糖、貽貝寡糖溶液i、貽貝寡糖溶液ii和貽貝寡糖樣品進行薄層層析(tlc)，結果如圖1所示：貽貝多糖在tlc展層時集中在點樣點附近；貽貝多糖經(jīng)α-淀粉酶酶解后獲得的貽貝寡糖溶液i中含有葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、聚合度4-8的寡糖及未降解的多糖；經(jīng)酵母菌處理后，葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖被酵母菌利用，貽貝寡糖溶液ii中含有聚合度4-8的寡糖及未降解的多糖；最后通過活性炭純化去除未降解的多糖后，得到較純凈的聚合度4-8的寡糖樣品。

實施例4貽貝寡糖降血脂實驗

選雄性sd大鼠100只(由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物生產許可證號：scxk(魯)20140007。動物合格證號：no.37009200002065)，體重170±10g，隨機分為5組，分別為空白組、模型組、貽貝多糖組(200mg/kg)、貽貝寡糖低劑量組(100mg/kg)、貽貝寡糖高劑量組(200mg/kg)，貽貝多糖采用實施例1中樣品，貽貝寡糖采用實施例3中樣品。全部大鼠喂養(yǎng)基礎飼料觀察1周，禁食12h后稱重，眼內眥取血，室溫25℃靜置1h，3000rpm離心10min，取血清，用自動生化分析儀測定tc，tg，hdl-c和ldl-c水平。空白組始終基礎飼料喂養(yǎng)，其余各組大鼠均用高脂飼料喂養(yǎng)(高脂飼料配方為膽固醇1％、膽鹽0.1％、豬油10％、蛋黃粉與全脂奶粉分別為5％，購于北京華阜康生物科技有限公司)。4周后眼內眥取血(取血前禁食12h)，測定血清tc(總膽固醇)，tg(甘油三酯)，hdl-c(高密度脂蛋白膽固醇)和ldl-c(低密度脂蛋白膽固醇)水平。用高脂飼料喂養(yǎng)4周后各組大鼠血清總膽固醇水平和甘油三酯水平與空白組比較有顯著性差異(p<0.05)，表明脂代謝紊亂模型成功建立。

脂代謝紊亂模型建立成功后，空白組與模型組每日灌胃蒸餾水1ml，貽貝多糖組和貽貝寡糖組分別按照相應的劑量每天灌胃給藥1次，連續(xù)8周。給藥8周后大鼠隔夜禁食12h，眼內眥取血，測定血清tc，tg，hdl-c和ldl-c水平。

檢測結果均以x±sd表示，采用spss13.0軟件進行統(tǒng)計，并進行組間差異分析，數(shù)據(jù)如表1所示。

連續(xù)給藥8周后，與模型組相比，貽貝多糖組和貽貝寡糖低劑量組能顯著降低大鼠血清甘油三酯水平(p<0.01)，貽貝寡糖高劑量組能顯著降低大鼠血清甘油三酯(p<0.01)、總膽固醇(p<0.05)和低密度脂蛋白膽固醇含量(p<0.05)(表1)。表明貽貝寡糖有一定的降血脂功能，且同等劑量貽貝寡糖降血脂效果優(yōu)于貽貝多糖。

表1各組大鼠血清中血脂水平測定結果(x±sd，n＝15-20)

注：^##p<0.01，與正常組比較；^*p<0.05，^**p<0.01，與模型組比較。

實施例5貽貝寡糖制備

(1)實施例1的貽貝多糖粉末溶于蒸餾水中，配制成10％多糖溶液，hcl調ph至5.0，得貽貝多糖溶液；

(2)向步驟(1)所述貽貝多糖溶液中加入中溫α-淀粉酶使其濃度為0.1g/l，70℃保溫5h，100℃滅活15min，得貽貝多糖水解液；

(3)步驟(2)所述貽貝多糖水解液用0.22μm濾膜過濾，收集濾液，得貽貝寡糖溶液i；

(4)向步驟(3)所述貽貝寡糖溶液i中按照5％質量體積比加入實施例2的酵母菌細胞，30℃、150rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)36h，離心取上清，得貽貝寡糖溶液ii；

(5)將步驟(4)制得的貽貝寡糖溶液ii按每毫升1mg加入活性炭，室溫攪拌2h，去上清；加入與貽貝寡糖溶液ii等體積的質量百分比3％的乙醇，室溫攪拌1h，去上清；加入貽貝寡糖溶液ii二分之一體積的質量百分比20％的乙醇，室溫攪拌1h，0.22μm濾膜過濾，收集濾液，減壓干燥，得到貽貝寡糖樣品；經(jīng)硫酸-苯酚法檢測，該寡糖純度為92.1％。

實施例6貽貝寡糖制備

(1)實施例1的貽貝多糖粉末溶于蒸餾水中，配制成10％多糖溶液，hcl調ph至6.0，得貽貝多糖溶液；

(2)向步驟(1)所述貽貝多糖溶液中加入中溫α-淀粉酶使其濃度為10g/l，30℃保溫10h，100℃滅活15min，得貽貝多糖水解液；

(3)步驟(2)所述貽貝多糖水解液用0.22μm濾膜過濾，收集濾液，得貽貝寡糖溶液i；

(4)向步驟(3)所述貽貝寡糖溶液i中按照10％質量體積比加入實施例2的酵母菌細胞，30℃、150rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)24h，離心取上清，得貽貝寡糖溶液ii；

(5)將步驟(4)制得的貽貝寡糖溶液ii按每毫升2mg加入活性炭，室溫攪拌2h，去上清；加入與貽貝寡糖溶液ii等體積的質量百分比3％的乙醇，室溫攪拌3h，去上清；加入貽貝寡糖溶液ii二分之一體積的質量百分比35％的乙醇，室溫攪拌1h，0.22μm濾膜過濾，收集濾液，冷凍干燥，得到貽貝寡糖樣品；經(jīng)硫酸-苯酚法檢測，該寡糖純度為91.8％。

實施例7貽貝寡糖制備

(1)實施例1的貽貝多糖粉末溶于蒸餾水中，配制成10％多糖溶液，hcl調ph至7.0，得貽貝多糖溶液；

(2)向步驟(1)所述貽貝多糖溶液中加入中溫α-淀粉酶使其濃度為5g/l，50℃保溫3h，100℃滅活15min，得貽貝多糖水解液；

(3)步驟(2)所述貽貝多糖水解液用0.22μm濾膜過濾，收集濾液，得貽貝寡糖溶液i；

(4)向步驟(3)所述貽貝寡糖溶液i中按照7％質量體積比加入實施例2的酵母菌細胞，30℃、150rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)32h，離心取上清，得貽貝寡糖溶液ii；

(5)將步驟(4)制得的貽貝寡糖溶液ii按每毫升2mg加入活性炭，室溫攪拌2h，去上清；加入與貽貝寡糖溶液ii等體積的質量百分比3％的乙醇，室溫攪拌3h，去上清；加入貽貝寡糖溶液ii二分之一體積的質量百分比40％的乙醇，室溫攪拌1h，0.22μm濾膜過濾，收集濾液，冷凍干燥，得到貽貝寡糖樣品，經(jīng)硫酸-苯酚法檢測，該寡糖純度為92.3％。