本發(fā)明涉及一種重組bsai限制性內(nèi)切酶的制備方法。
背景技術(shù)：
限制性核酸內(nèi)切酶是可以識(shí)別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類酶，簡(jiǎn)稱限制酶。根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu)，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型(typei)、第二型(typeii)及第三型(typeiii)。
第一型限制酶同時(shí)具有修飾及識(shí)別切割的作用；另有識(shí)別dna上特定堿基序列的能力，通常其切割位距離識(shí)別位可達(dá)數(shù)千個(gè)堿基之遠(yuǎn)。例如：ecob、ecok。
第二型限制酶只具有識(shí)別切割的作用，修飾作用由其他酶進(jìn)行。所識(shí)別的位置多為短的回文序列；所剪切的堿基序列通常即為所識(shí)別的序列。是遺傳工程上，實(shí)用性較高的限制酶種類。例如：banhi、hindiii。
第三型限制酶與第一型限制酶類似，同時(shí)具有修飾及識(shí)別切割的作用?？勺R(shí)別短的不對(duì)稱序列，切割位與識(shí)別序列約距24～26個(gè)堿基對(duì)。例如：hinfiii。
ii型限制與修飾系統(tǒng)所占的比例最大，達(dá)93％。
其中ii型酶相對(duì)來(lái)說(shuō)最簡(jiǎn)單，它們識(shí)別回文對(duì)稱序列，在回文序列內(nèi)部或附近切割dna，產(chǎn)生帶3′-羥基和5′-磷酸基團(tuán)的dna產(chǎn)物，需mg2+的存在才能發(fā)揮活性，相應(yīng)的修飾酶只需sam。識(shí)別序列主要為4～6bp，或更長(zhǎng)且呈二重對(duì)稱的特殊序列，但有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列，切割位置因酶而異，有些是隔開的。
限制性內(nèi)切酶typeii又分了四種子型：iip，iis，iic和iit。大多數(shù)情況下實(shí)驗(yàn)室使用的iip只有一個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域，具有同時(shí)識(shí)別序列和在序列內(nèi)進(jìn)行切割的能力，而iis擁有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中一個(gè)負(fù)責(zé)識(shí)別序列，另一個(gè)負(fù)責(zé)切割，由于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域具有一定的距離，導(dǎo)致蛋白的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列之外。
本發(fā)明的bsai限制性內(nèi)切酶即屬于iis型限制酶，其識(shí)別位點(diǎn)為：
5’-ggtctc(n)1^-3’
5’-ccagag(n)5^-3’
bsai作為一個(gè)typeiis限制性內(nèi)切酶，在生物領(lǐng)域?qū)儆谛滦兔割?，常用于goldengate技術(shù)。目前商品化bsai蛋白的價(jià)格偏高，較少生物公司有此類產(chǎn)品。通過(guò)對(duì)本蛋白的研發(fā)可以增加在產(chǎn)品方面的競(jìng)爭(zhēng)力，同時(shí)可以用于goldengate技術(shù)的研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種重組bsai蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)以及純化方法。該方法通過(guò)將目的基因重組到表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株中進(jìn)而進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，重組bsai限制性內(nèi)切酶的制備方法，包括以下步驟：
(1)表達(dá)質(zhì)粒pcreatsii-bsai的構(gòu)建；
(2)bsai蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定；
(3)bsai蛋白的純化與鑒定。
作為優(yōu)選，步驟(1)所述表達(dá)質(zhì)粒pcreatsii-bsai的構(gòu)建，具體包括以下步驟：
(4)bsai的基因合成：根據(jù)密碼子優(yōu)化后的基因序列，直接進(jìn)行基因合成；
(5)gibson重組連接：將pcreatsii通過(guò)酶切進(jìn)行線性化，線性化產(chǎn)物與步驟(4)的基因合成產(chǎn)物進(jìn)行無(wú)縫克??；
(6)重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化：將上述重組連接產(chǎn)物20μl轉(zhuǎn)移到top10感受態(tài)細(xì)胞中，冰上靜置30min，42℃熱激90s，冰上再靜置2min；加入600ullb液體培養(yǎng)基，37℃搖床200rpm搖45min，涂布于含50ug/ml卡那霉素的lb平板中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜；
(7)重組克隆的鑒定：隨機(jī)挑取至少4個(gè)克隆，接入4ml含卡那霉素lb中；37℃搖床220rpm搖過(guò)夜，抽提質(zhì)粒并測(cè)序。
作為優(yōu)選，步驟(2)具體包括以下步驟：
(8)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌
將上述鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒pcreatsii-bsai轉(zhuǎn)入感受態(tài)bl21(de3)中，涂布于含卡那霉素的lb平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜；
(9)iptg誘導(dǎo)蛋白表達(dá)
挑單克隆于含卡那霉素lb中，37℃搖床，220rpm培養(yǎng)過(guò)夜，以1∶100接過(guò)夜菌于4ml含卡那霉素lb板中，繼續(xù)培養(yǎng)2.5h，od600nm達(dá)到0.6～0.8時(shí)加入iptg至0.5mm，于15℃過(guò)夜誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；
(10)sds-page鑒定
取2ml菌液12000rpm離心1min收集菌體，加入100μl的1×上樣緩沖液，煮沸5min，冷卻后12000rpm離心1min，取10μl樣品進(jìn)行12％聚丙烯酰胺凝膠電泳，取下凝膠利用快染儀染色脫色10min，觀察誘導(dǎo)前后蛋白條帶的變化，結(jié)果顯示目的蛋白有表達(dá)。
作為優(yōu)選，步驟(3)具體包括以下步驟：
(11)bsai蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
將過(guò)夜培養(yǎng)已轉(zhuǎn)入pcreatsii-bsai的bl21(de3)菌液以1∶100接于800ml含卡那霉素lb中，37℃搖床，220rpm培養(yǎng)2h，od600nm達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入iptg至0.5mm，于15℃過(guò)夜誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，8000rpm離心10min，收集菌體，-20℃保存；
(12)細(xì)菌蛋白表達(dá)形式的分析
-20℃凍存菌體按每克濕菌5ml的比例加入細(xì)菌裂解液，超聲破菌，4℃，16000rpm離心15min，沉淀在底部，分別取上清、包涵體做sds-page，結(jié)果顯示bsai蛋白一部分存在于上清中；
(13)bsai蛋白的純化
收集菌體加入裂解液重懸，超聲破碎后離心，16000rpm離心15min，將上清液置于干凈的50ml的離心管中加入2mlni柱，4℃孵育2h，裂解液洗柱100ml；利用含有20mm咪唑的裂解液洗脫30ml，含有500mm咪唑的裂解液洗脫5ml；以bsai儲(chǔ)存液作為流動(dòng)相過(guò)分子篩superdex200，根據(jù)紫外吸收值收集合目的蛋白的洗脫液，將目的蛋白液用12％的sds-page進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明應(yīng)用蛋白純化系統(tǒng)，superdex200分子篩層析對(duì)蛋白進(jìn)行提純，經(jīng)純化工藝摸索及條件優(yōu)化，整個(gè)純化過(guò)程僅需5～6h，極大簡(jiǎn)化了純化過(guò)程及時(shí)間，從而保證了酶活性，有利于酶產(chǎn)量的提高，且純化后bsai經(jīng)酶活力與商業(yè)化酶相當(dāng)，通過(guò)大腸桿菌表達(dá)bsai極大的降低了成本，效率也有很大的提升。該純化工藝的新方法，為研發(fā)及生產(chǎn)其他ii型限制性內(nèi)切酶奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。
1.菌種
宿主菌大腸桿菌top10、bl21(de3)及表達(dá)載體pcreatsii。
2.試劑
限制性內(nèi)切酶為neb(北京)有限公司產(chǎn)品；pcreatsii為通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司研發(fā)；dna聚合酶為通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司自產(chǎn)；膠回收及質(zhì)粒小抽試劑盒為axygen產(chǎn)品；nintabeads6ff購(gòu)自常州天地人和生物科技有限公司；t4dna連接酶購(gòu)自thermo公司。
3.蛋白酶基因合成
bsai蛋白酶與甲基化酶基因由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司基因部根據(jù)基因序列直接合成，5’及3’分別帶有pcreatsii的同源臂。
4.pcreatsii-bsai表達(dá)載體的構(gòu)建
將bsai蛋白酶基因及線性化載體pcreatsii利用利用重組酶進(jìn)行同源重組，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10，抽提質(zhì)粒由本公司測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
5.pcreatsii-bsai表達(dá)及產(chǎn)物純化
將測(cè)序正確的陽(yáng)性重組子轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)中挑取單菌落轉(zhuǎn)化到30ml含卡那霉素(50mg/ml)的lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1∶100接種至800ml含卡那霉素的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，當(dāng)od600達(dá)到0.5時(shí)加入iptg(終濃度0.5mm)于15℃誘導(dǎo)過(guò)夜。
收集菌體加入裂解液重懸，超聲破碎后離心，16000rpm離心15min，將上清液置于干凈的50ml的離心管中加入2mlni柱，4℃孵育2h，裂解液洗柱100ml。利用含有20mm咪唑的裂解液洗脫30ml，含有500mm咪唑的裂解液洗脫5ml。以bsai儲(chǔ)存液作為流動(dòng)相過(guò)分子篩superdex200，根據(jù)紫外吸收值收集含目的蛋白的洗脫液，將目的蛋白液用12％的sds-page進(jìn)行檢測(cè)。
6.將目的蛋白純化產(chǎn)物進(jìn)行酶切驗(yàn)證。
以上所述的本發(fā)明實(shí)施方式，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。