本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種放射碘標(biāo)記pd-l1單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是危害人類健康的主要疾病之一，中國(guó)新增307萬(wàn)腫瘤患者，其中約220萬(wàn)人死亡，分別占全球總量的21.9％和26.8％。流行病調(diào)查資料發(fā)現(xiàn)，在未來(lái)的20～30年，我國(guó)腫瘤死亡率將繼續(xù)上升。因此，篩查、預(yù)警和腫瘤早期診斷及個(gè)性化治療將成為腫瘤防治中的關(guān)鍵問(wèn)題。

近年來(lái)腫瘤免疫療法蓬勃發(fā)展，其基本原理是通過(guò)激發(fā)或調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細(xì)胞。其中程序性細(xì)胞死亡受體/配體(pd1/pd-l1)是最為重要的靶點(diǎn)之一，現(xiàn)已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。已有研究結(jié)果顯示，pd-l1單克隆抗體療效顯著。

人pd-l1基因定位于9號(hào)染色體，其開放閱讀框編碼是一個(gè)含有290個(gè)氨基酸的ⅰ型跨膜蛋白。該蛋白廣泛表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞、活化t、b細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞，其受體為cd28家族成員pd-1。pd-1通過(guò)與配體pd-l1結(jié)合向t細(xì)胞內(nèi)傳遞抑制信號(hào)，防止t細(xì)胞過(guò)度活化，負(fù)性調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程，從而介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

總而言之，pd-l1在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌，胰腺癌等多種腫瘤細(xì)胞均呈高表達(dá)且參與癌細(xì)胞免疫逃逸。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種放射碘標(biāo)記pd-l1單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用。

在本發(fā)明中，將所述放射碘標(biāo)記pd-l1單克隆抗體命名為¹³¹i-pd-l1分子探針。

本發(fā)明所提供的制備放射碘標(biāo)記pd-l1單克隆抗體的方法，是基于氯胺-t法用¹³¹i標(biāo)記pd-l1單克隆抗體，具體可包括如下步驟：向pd-l1單克隆抗體中加入磷酸鹽緩沖液、na¹³¹i溶液和氯胺-t(ch-t)進(jìn)行反應(yīng)，以與氯胺-t(ch-t)等質(zhì)量的偏重硫酸鈉終止反應(yīng)。

其中，所述pd-l1單克隆抗體、所述na¹³¹i溶液和所述氯胺-t(ch-t)的用量配比為50μg：0.58-2.9mci：10-60μg；所述na¹³¹i溶液的量以¹³¹i的放射性活度計(jì)。

相應(yīng)的，反應(yīng)體系的總體積可為50-300μl，其中含有50μg的所述pd-l1單克隆抗體，¹³¹i活度為0.58-2.9mci的所述na¹³¹i溶液，10-60μg的所述氯胺-t，余量為磷酸鹽緩沖液。

進(jìn)一步，所述pd-l1單克隆抗體、所述na¹³¹i溶液和所述氯胺-t(ch-t)的用量配比具體可為50μg：0.58mci：30μg。

相應(yīng)的，用pbs將所述反應(yīng)體系的總體積補(bǔ)充至150μl，含有50μg的所述pd-l1單克隆抗體，20μlna¹³¹i溶液(活度為0.58mci)，30μg的所述氯胺-t，余量為磷酸鹽緩沖液。

在所述方法中，進(jìn)行所述反應(yīng)的條件可為室溫(22-28℃)震蕩1-20min。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，進(jìn)行所述反應(yīng)的條件具體為室溫25℃震蕩3min。

在所述方法中，進(jìn)行所述反應(yīng)后，還可包括對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行pd10柱脫鹽層析和hplc分離純化的步驟。

其中，所述pd10柱具體為美國(guó)ge公司產(chǎn)品，cas號(hào)為55965-84-9。

對(duì)所述反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行所述pd10柱脫鹽層析后收集放射性活度及蛋白濃度均為最高峰的洗脫液(即為含有¹³¹i-pd-l1分子探針產(chǎn)物的所在管)，進(jìn)行所述hplc鑒定，收集紫外峰和放射峰相符處的產(chǎn)物即獲得所述放射碘標(biāo)記pd-l1單克隆抗體(即¹³¹i-pd-l1分子探針)。

進(jìn)一步，進(jìn)行所述pd10柱脫鹽層析具體可包括如下步驟：常規(guī)重力流盡pd10柱內(nèi)預(yù)裝溶液，并以磷酸鹽緩沖液平衡pd10柱，將所述反應(yīng)產(chǎn)物上柱，以磷酸鹽緩沖液洗脫，以500μl/ep管收集分離純化產(chǎn)物，每管分別測(cè)放射性活度及紫外蛋白質(zhì)濃度，二者均為最高峰者中含有¹³¹i-pd-l1分子探針。

進(jìn)行所述hplc分離純化的具體條件如下：流動(dòng)相a為含有0.1％三氟乙酸的乙腈；流動(dòng)相b為含有0.1％三氟乙酸的去離子水；％表示體積百分含量。洗脫程序?yàn)椋鹤缘?.01min起，用7％的所述流動(dòng)相a和93％的所述流動(dòng)相b進(jìn)行洗脫；持續(xù)到第25min，改為用32％的所述流動(dòng)相a和68％的所述流動(dòng)相b進(jìn)行洗脫；持續(xù)到第25.1min，改為用100％的所述流動(dòng)相a和0％的所述流動(dòng)相b進(jìn)行洗脫，持續(xù)到40min停止洗脫；％表示體積百分含量。流速為1.0ml/min。波長(zhǎng)為280nm。

在本發(fā)明中，以上所述的磷酸鹽緩沖液的ph為7.2±0.2，為hyclone公司產(chǎn)品，catno.:sh30256.01，lotno.：ac10209969。

利用所述方法制備得到的放射碘標(biāo)記pd-l1單克隆抗體(即¹³¹i-pd-l1分子探針)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述放射碘標(biāo)記pd-l1單克隆抗體(即¹³¹i-pd-l1分子探針)在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

(a)腫瘤顯像或制備用于腫瘤顯像的產(chǎn)品；

(b)治療腫瘤或制備用于治療腫瘤的產(chǎn)品；

(c)制備靶向腫瘤細(xì)胞pdl1靶點(diǎn)的產(chǎn)品。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述腫瘤具體為乳腺癌細(xì)胞所致腫瘤。所述腫瘤細(xì)胞具體為乳腺癌細(xì)胞(如4t1細(xì)胞)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述pd-l1單克隆抗體具體為欣博盛公司產(chǎn)品，clone:10f.9g2，catalog:be0101，lot:615416d1。

本發(fā)明實(shí)現(xiàn)用放射性核素[131]碘對(duì)pd-l1單抗進(jìn)行標(biāo)記。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明標(biāo)記后的探針具有十分優(yōu)越的性質(zhì)。該探針能夠明顯地靶向腫瘤組織，所得圖像清晰，對(duì)比度高，并且標(biāo)記方法簡(jiǎn)單，標(biāo)記率高，放射化學(xué)純度較高，體外穩(wěn)定性好。本發(fā)明對(duì)于腫瘤顯像及腫瘤治療具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1為hplc鑒定色譜圖，a為經(jīng)pd10柱純化前色譜圖，b為經(jīng)pd10柱純化后色譜圖，c為將該探針按1:9比例置于生理鹽水4℃環(huán)境中，5h之后的色譜圖。說(shuō)明經(jīng)pd10柱純化后，成功獲得高放化純的¹³¹i-pd-l1分子探針，并且在生理鹽水環(huán)境中能夠保持穩(wěn)定。其中a通道1是紫外峰，ad2是放射峰。

圖2為¹³¹i-pd-l1分子探針在人新鮮血清中的穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果。

圖3為¹³¹i-pd-l1分子探針細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果。a為實(shí)驗(yàn)組結(jié)果；b為對(duì)照組結(jié)果。

圖4為¹³¹i-pd-l1分子探針腫瘤顯像實(shí)驗(yàn)荷瘤小鼠注射后72h顯像結(jié)果，箭頭所示為腫瘤顯像。

圖5為預(yù)飽和阻斷顯像，72h未見腫瘤顯影，說(shuō)明阻斷成功。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

pd-l1單克隆抗體：欣博盛公司產(chǎn)品，clone:10f.9g2，catalog:be0101，lot:615416d1。

磷酸鹽緩沖液：磷酸鹽緩沖液的ph為7.2±0.2，為hyclone公司產(chǎn)品，catno.:sh30256.01，lotno.：ac10209969。

na¹³¹i溶液：購(gòu)買于原子高科公司，溶劑為去離子水，溶質(zhì)濃度約0.9mg/100mlnacl+29uci/μlna¹³¹i。

實(shí)施例1、¹³¹i-pd-l1分子探針的制備及鑒定

一、¹³¹i-pd-l1分子探針的制備方法

1、基于氯胺-t法用¹³¹i標(biāo)記pd-l1單克隆抗體

配制反應(yīng)體系(150μl)如下：pd-l1單克隆抗體50μg/8.53μl、20μlna¹³¹i溶液(其中¹³¹i的活度約為0.58mci)、30μg/6μlch-t，余量為磷酸鹽緩沖液。

將配制好的反應(yīng)體系于25℃震蕩反應(yīng)3min。標(biāo)記完成后立即以等量偏重硫酸鈉溶液，即6μl，5μg/μl的偏重硫酸鈉溶液(溶劑為磷酸鹽緩沖液)終止反應(yīng)。

2、pd10柱分離純化

對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行pd10柱分離純化，具體步驟為：自然重力流盡pd10柱(ge公司產(chǎn)品，cas號(hào)為55965-84-9)預(yù)裝溶液后，以pbs緩沖液平衡pd10柱，備用。將步驟1中的反應(yīng)產(chǎn)物加于pd10柱后，先以少量pbs緩沖液，約0.2-0.5ml洗脫2-3次后逐漸增加pbs用量，以500μl/ep管收集分離純化產(chǎn)物，共收集24管。每管分別測(cè)放射性活度及蛋白質(zhì)濃度，二者均為最高峰者含有¹³¹i-pd-l1分子探針，即經(jīng)¹³¹i成功標(biāo)記pd-l1單克隆抗體，所得的¹³¹i-pd-l1分子探針。

3、hplc鑒定

將經(jīng)步驟2純化前后的反應(yīng)物分別進(jìn)行hplc分離純化，具體條件如下：

流動(dòng)相a：0.1％三氟乙酸in100％乙腈。

流動(dòng)相b：0.1％三氟乙酸in100％去離子水。

其中，％表示體積百分含量。

梯度洗脫，程序如下(％表示體積百分含量)：

流速：1.0ml/min。

波長(zhǎng)：280nm。

結(jié)果如圖1所示，其中a為經(jīng)pd10柱純化前色譜圖，b為經(jīng)pd10柱純化后色譜圖。b中紫外峰和放射峰相符處的產(chǎn)物(即保留時(shí)間為31.425min處的放射峰，注因先過(guò)紫外探測(cè)器，后過(guò)放射探測(cè)器，所以紫外峰略先于放射峰)即為純化后¹³¹i-pd-l1分子探針，由a和b的比較可見純化后成功獲得高放化純的¹³¹i-pd-l1分子探針。

二、標(biāo)記率的測(cè)定

以紙層析方法檢測(cè)標(biāo)記率：在展開劑(正丁醇5v：乙醇1v：氨水2v)中，標(biāo)記產(chǎn)物滯留于原點(diǎn)。標(biāo)記率＝原點(diǎn)計(jì)數(shù)/總計(jì)數(shù)×100％，注此處原點(diǎn)計(jì)數(shù)及總計(jì)數(shù)均已減去本底計(jì)數(shù)。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定三次以上，結(jié)果取均值。

結(jié)果顯示：步驟一制得¹³¹i-pd-l1分子探針的標(biāo)記率為61.34％-81.2％。該結(jié)果表明，放射性碘131可以成功標(biāo)記pdl1單克隆抗體，制備¹³¹i-pd-l1分子探針，且標(biāo)記率較高。

實(shí)施例2、¹³¹i-pd-l1分子探針在生理鹽水和人新鮮血清中的穩(wěn)定性測(cè)定

1、生理鹽水

將¹³¹i-pd-l1分子探針按1:9(體積比)比例置于生理鹽水4℃環(huán)境中放置5h。按照實(shí)施例1步驟一3的方法于實(shí)驗(yàn)處理前后分別進(jìn)行hplc檢測(cè)。

結(jié)果如圖1中c所示，可見¹³¹i-pd-l1分子探針在生理鹽水環(huán)境中能夠保持穩(wěn)定。

2、人新鮮血清

血清中¹³¹i-pd-l1分子探針?biāo)急壤秊?0％(體積百分含量)即10μl的¹³¹i-pd-l1分子探針置于90μl的血清中。采用紙層析法獲得放化純，具體操作：常規(guī)點(diǎn)樣于新華一號(hào)紙層析試紙，展開劑為正丁醇(5v)：無(wú)水乙醇(1v)：氨水(2v)，分別于血清與¹³¹i-pd-l1分子探針混合后的第1、3、6、12、24、36、48和72小時(shí)點(diǎn)樣紙層析法測(cè)放化純，評(píng)估穩(wěn)定性。

結(jié)果如圖2所示。由圖可見：該分子探針的血清穩(wěn)定性始終大于90％，說(shuō)明該分子探針在血清中十分穩(wěn)定。

實(shí)施例3、¹³¹i-pd-l1分子探針細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組：提前一天向24孔板均勻鋪入乳腺癌細(xì)胞(4t1細(xì)胞系)。攝取實(shí)驗(yàn)開始前4h將所有孔內(nèi)培養(yǎng)液吸凈并pbs漂洗后加入無(wú)血清低糖培養(yǎng)基。向各孔中均加入37kbq¹³¹i-pd-l1分子探針，分別于15min、1h、2h、4h、12h、24h、36h、48h將各孔培養(yǎng)液分別移入相應(yīng)放免管中，并用pbs清洗三遍，記為細(xì)胞外液；加入naoh溶液(濃度為1n)50μl移入另外相應(yīng)放免管中，并用pbs清洗三遍，記為細(xì)胞內(nèi)液。即時(shí)利用伽馬計(jì)數(shù)器，分別測(cè)定各放免管放射性計(jì)數(shù)。攝取率百分比＝細(xì)胞內(nèi)液計(jì)數(shù)/(細(xì)胞外液計(jì)數(shù)+細(xì)胞內(nèi)液計(jì)數(shù))×100％，注：此處細(xì)胞內(nèi)液計(jì)數(shù)及細(xì)胞外液計(jì)數(shù)均已減去本底計(jì)數(shù)。

對(duì)照組：與實(shí)驗(yàn)組相比，僅將37kbq¹³¹i-pd-l1分子探針替換為37kbq¹³¹i，其余所有操作同前。

結(jié)果如圖3所示。由圖可見：對(duì)照組未見細(xì)胞攝取¹³¹i，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞明顯攝取¹³¹i-pd-l1分子探針。

實(shí)施例4、¹³¹i-pd-l1分子探針腫瘤顯像實(shí)驗(yàn)

一、荷瘤小鼠的制備

常規(guī)培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞(4t1細(xì)胞)并接種于babl/c小鼠腋下，約三周后成瘤。

二、¹³¹i-pd-l1分子探針腫瘤顯像

經(jīng)鼠尾靜脈向荷瘤小鼠注射200μci/150μl¹³¹i-pd-l1分子探針后分別于1、6、12、24、36、48、72小時(shí)對(duì)小鼠連續(xù)顯像至72h。

注射后72h顯像結(jié)果如圖4所示，腫瘤顯像十分明顯，如箭頭所示。該結(jié)果表明，說(shuō)明該探針具有優(yōu)異的腫瘤靶向性，在體pdl1靶向性顯像可行，進(jìn)一步推測(cè)該分子探針也將具備優(yōu)良的腫瘤治療效果。

實(shí)施例5、預(yù)飽和阻斷后¹³¹i-pd-l1分子探針腫瘤顯像實(shí)驗(yàn)

測(cè)得標(biāo)記完成¹³¹i-pd-l1分子探針中的蛋白濃度，由babl/c尾靜脈注射100倍的pd-l1單克隆抗體，1小時(shí)后，由小鼠尾靜脈注射¹³¹i-pd-l1分子探針(注射量為pd-l1單克隆抗體的1/100，以分子探針中pd-l1單克隆抗體的量計(jì))，在麻醉狀態(tài)下，分別于1、6、12、24、36、48、72小時(shí)對(duì)小鼠顯像。

圖5所示為72小時(shí)顯像結(jié)果。未見小鼠腋下腫瘤顯像，達(dá)到預(yù)飽和阻斷顯像目的，說(shuō)明過(guò)量pdl1單抗能夠阻斷¹³¹i-pd-l1分子探針靶向腫瘤，表明該探針具有良好的靶向性。