本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種凡納濱對(duì)蝦組蛋白抗菌肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

凡納濱對(duì)蝦(litopenaeusvannamei)，又稱為南美白對(duì)蝦、萬(wàn)氏對(duì)蝦，屬節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、十足目、游泳亞目、對(duì)蝦科、對(duì)蝦屬、lito-penaeus亞屬。在全球形成規(guī)?；B(yǎng)殖的對(duì)蝦品種中凡納濱對(duì)蝦的產(chǎn)量占絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，占全球單品種養(yǎng)殖總產(chǎn)量的75％。伴隨著對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量的逐年增加，養(yǎng)殖問(wèn)題也漸漸涌現(xiàn)，其中蝦病是對(duì)行業(yè)的影響是幾乎毀滅性的，所以，病害防控技術(shù)是養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的關(guān)鍵。主要的病害有三類：對(duì)蝦白斑綜合征、微孢子蟲病(ehp)和對(duì)蝦早期死亡綜合征(ems)。近年來(lái)抗生素的濫用造成微生物的耐藥性、水污染使得開發(fā)能代替抗生素的抗菌肽變得尤為重要。

抗菌肽(antibac-terialpeptide)又叫抗微生物肽(antimicrobialpep-tide)、抗生素肽(antibioticspeptide)，是由多種生物細(xì)胞特定基因編碼經(jīng)外界條件誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有廣譜抗細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲、抑殺腫瘤細(xì)胞等活性作用的多肽。迄今為止，國(guó)內(nèi)外報(bào)道大約有2000多種抗菌肽被鑒定、分離出來(lái)，以天然抗菌肽作模板進(jìn)行人工合成的模擬肽已達(dá)數(shù)千種。在生物界自然存在的抗菌肽根據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同可以分為四大類：β折疊型抗菌肽、α螺旋型抗菌肽、延伸結(jié)構(gòu)型多肽和loop結(jié)構(gòu)型多肽。

目前，我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)急需解決的共性關(guān)鍵問(wèn)題包括：對(duì)蝦傳染性疫病的防控、品種的選育、營(yíng)養(yǎng)研究、養(yǎng)殖環(huán)境控制以及對(duì)蝦加工技術(shù)升級(jí)等。而要成功解決這些問(wèn)題，闡明對(duì)蝦免疫防御機(jī)制是前提和基礎(chǔ)。有鑒于此，本發(fā)明人研究和設(shè)計(jì)了一種凡納濱對(duì)蝦組蛋白抗菌肽及其應(yīng)用，本案由此產(chǎn)生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種凡納濱對(duì)蝦組蛋白抗菌肽及其應(yīng)用，通過(guò)凡納濱對(duì)蝦組蛋白抗菌肽的研究，為尋找新的對(duì)蝦病害防控、良種選育的策略提供思路，促進(jìn)我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康、持續(xù)發(fā)展。

為了解決上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種凡納濱對(duì)蝦組蛋白抗菌肽，其氨基酸序列如序列標(biāo)seqidno：1所示。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述抗菌肽的分子量為1719da。

一種凡納濱對(duì)蝦組蛋白抗菌肽的應(yīng)用，在制備治療或預(yù)防革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽(yáng)性菌的藥物中的應(yīng)用。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌、溶藻弧菌。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述革蘭氏陽(yáng)性菌包括金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌。

本發(fā)明以凡納濱對(duì)蝦組蛋白為主要研究對(duì)象，通過(guò)antibp、campr3、apd3三個(gè)在線軟件預(yù)測(cè)可能產(chǎn)生抑菌效果的抗菌肽段，選取最有可能的肽段進(jìn)一步進(jìn)行抑菌活性實(shí)驗(yàn)。再運(yùn)用netsurfpver.1.1在線軟件對(duì)抗菌肽的表面親和力進(jìn)行分析，運(yùn)用swiss-model軟件進(jìn)行3d建模，運(yùn)用heliquest在線軟件分析抗菌肽的理化性質(zhì)。本發(fā)明對(duì)抗菌肽h3進(jìn)行抑菌活性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的抗菌肽h3具有明顯抑菌效果，進(jìn)而為避免抗生素在對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用提供了思路。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明多肽h3對(duì)大腸桿菌的抑菌效果圖；其中，a：無(wú)菌蒸餾水(陰性對(duì)照)；b：1mg/ml；c：0.5mg/ml；d：0.25mg/ml；e：0.125mg/ml；f：0.0625mg/ml；g：0.03125mg/ml(最低抑菌濃度)；h：0.0625mg/ml氨芐青霉素(陽(yáng)性對(duì)照)；

圖2為本發(fā)明多肽h3對(duì)溶藻弧菌的抑菌效果圖；其中，a：無(wú)菌蒸餾水(陰性對(duì)照)；b：1mg/ml；c：0.5mg/ml；d：0.25mg/ml；e：0.125mg/ml；f：0.0625mg/ml；g：0.03125mg/ml；h：0.015625mg/ml；i：0.0078125mg/ml(最低抑菌濃度)；j：0.0078125mg/ml氨芐青霉素(陽(yáng)性對(duì)照)；

圖3為本發(fā)明多肽h3對(duì)乙型鏈球菌的抑菌效果圖；其中，a：無(wú)菌蒸餾水(陰性對(duì)照)；b：1mg/ml；c：0.5mg/ml；d：0.25mg/ml(最低抑菌濃度)；e：0.25mg/ml氨芐青霉素(陽(yáng)性對(duì)照)；

圖4為本發(fā)明多肽h3對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果圖；其中，a：無(wú)菌蒸餾水(陰性對(duì)照)；b：1mg/ml；c：0.5mg/ml；d：0.25mg/ml；e：0.125mg/ml；f：0.0625mg/ml；g：0.03125mg/ml；h：0.015625mg/ml；i：0.0078125mg/ml；j：0.00390625mg/ml(最低抑菌濃度)；k：0.25mg/ml氨芐青霉素(陽(yáng)性對(duì)照)；

圖5為本發(fā)明h3肽段3d模型；

圖6為本發(fā)明合成多肽h3的理化性質(zhì)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1凡納濱對(duì)蝦組蛋白抗菌肽的預(yù)測(cè)

在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中查找凡納濱對(duì)蝦的組蛋白h4(ncbireferencesequence：np_001011609.1)的氨基酸序列。通過(guò)antibpserver、camp、apd3三個(gè)在線預(yù)測(cè)軟件，預(yù)測(cè)對(duì)蝦組蛋白h4抗菌肽段，結(jié)果如表2-1所示，一共預(yù)測(cè)得到了20條也許具有抑菌活性的小分子多肽，它們的分子量大小范圍大致在1.4-2.0kda范圍內(nèi)，其中的4條肽段序列(加粗黑體)或許有抑菌作用。并且得到提示，一部分的小分子多肽序列可能形成α螺旋，一部分多肽序列是富含p或疏水性氨基酸的多肽序列。通過(guò)該預(yù)測(cè)可知合成多肽h3與合成多肽h9的綜合得分和可信度相對(duì)較高，通過(guò)swissmodel軟件進(jìn)行同源建模預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)后推斷多肽h3(pairrlarrggvkri)與多肽h9(glgkggakrhrkvlr)是可能具有螺旋結(jié)構(gòu)的肽。本發(fā)明合成了多肽h3(tkpairrlarrggvkri)并且進(jìn)行抑菌活性分析找出其可能存在的抑菌機(jī)制。

表1對(duì)蝦組蛋白h4抗菌肽段的預(yù)測(cè)

注：①加粗多肽序列：根據(jù)其理化性質(zhì)推測(cè)可能有抑菌作用；

②ⅰ：序列可能形成α螺旋；ⅱ：富含p或w疏水性氨基酸的多肽序列。

實(shí)施例2凡納濱對(duì)蝦組蛋白抗菌降解肽段的抑菌活性分析

2.1實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1主要材料

該實(shí)驗(yàn)中所使用的多肽是來(lái)自于北京中科亞光生物科技有限公司(scilightbiotechnology,llc)合成，多肽c端酰胺化、n端乙?；兌?gt;95％。

實(shí)驗(yàn)中使用的水產(chǎn)致病菌有革蘭氏陽(yáng)性菌(g+)和革蘭氏陰性菌(g-)。g+的代表菌種有乙型鏈球菌(beta-streptococcus)和金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)；g-的代表菌種有大腸桿菌(e.coli)和溶藻弧菌(solublev.)。

2.1.2主要試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

lb瓊脂：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

2.1.3主要儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(dhg-9140a)：上海秣馬恒溫設(shè)備廠

艾美特電磁爐(ce2132-z)

電熱恒溫水浴鍋(dk-826)：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司

雙人雙面垂直送風(fēng)(經(jīng)濟(jì)型)凈化工作臺(tái)(sw-cj-2d)：蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司

電子分析天平(me203/ar1530)：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司

雙層大容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器(雙層全溫度恒溫?fù)u床)(zhwy-2102)：上海智城分析儀器制造有限公司

高壓滅菌鍋(kt-30l)：日本alp公司

移液槍：賽默飛世爾(上海)儀器有限公司

2.1.4溶液

2.1.4.1人工合成多肽溶液

1.0mg/ml多肽溶液：在實(shí)驗(yàn)室冰箱冷凍室中取1mg凍干粉末狀的多肽，加1ml無(wú)菌蒸餾水混勻，再依次稀釋到所需倍數(shù)，于零下20℃分裝保持備用。

2.1.4.2氨芐青霉素溶液

1.0mg/ml氨芐青霉素溶液：用電子分析天平稱取1mg氨芐青霉素，再加入1ml無(wú)菌蒸餾水混勻，再依次稀釋到所需濃度，于零下20℃分裝保持備用。

2.1.4.3培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(液體)的配方(每升)：蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3.0g、氯化鈉5.0g、最終ph7.4±0.2。使用方法：稱取本品18g，加入蒸餾水或去離子水1l，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝試管或三角瓶，121℃高壓滅菌15min。

lb瓊脂(固體)的配方(每升)：蛋白胨10.0g、酵母膏粉5.0g、氯化鈉5.0g、葡萄糖1.0g、瓊脂15.0g、最終ph7.0±0.2。使用方法：稱取本品36g，加入蒸餾水或去離子水1l，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121℃滅菌15min。

2.2平板菌落計(jì)數(shù)法分析抑菌活性

方法流程如下：

第一步，從冰箱冷凍室將金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌、溶藻弧菌、大腸桿菌取出，在常溫下一段時(shí)間后，取50μl的致病菌于1ml的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，并放置于37℃的恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-12h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

第二步，取一環(huán)活化好的菌液接種于lb瓊脂固體小斜面上放置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-12h,接著用3ml的無(wú)菌蒸餾水將小斜面上的菌洗入裝有97ml無(wú)菌蒸餾水的三角瓶中，稀釋成10^-2的菌液。

第三步，根據(jù)菌液的原有濃度，用無(wú)菌蒸餾水將菌液稀釋為所需濃度，取稀釋后的50μl菌液與50μl的對(duì)應(yīng)濃度的肽液進(jìn)行混合。將菌肽混合液放置于30℃恒溫水浴鍋中孵化2h，并且取50μl混合液用涂布法涂平板，做兩個(gè)平行，將涂布完成的培養(yǎng)皿倒扣放置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24h后計(jì)數(shù)菌落并拍照。無(wú)菌蒸餾水為陰性對(duì)照，氨芐青霉素為陽(yáng)性對(duì)照。

第四步，進(jìn)行抑菌率的計(jì)算。

抑菌率(％)＝(陰性對(duì)照菌落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù))/陰性對(duì)照菌落數(shù)×100。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2.3結(jié)果分析

2.3.1合成多肽h3的抑菌活性結(jié)果分析

表2多肽h3對(duì)大腸桿菌、溶藻弧菌、乙型鏈球菌、金黃色葡萄球菌的抑菌率(％)

表3氨芐青霉素對(duì)大腸桿菌、溶藻弧菌、乙型鏈球菌、金黃色葡萄球菌最低的抑菌率(％)

由圖1至圖4，及表2和表3可知，合成多肽h3對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.03125mg/ml，對(duì)溶藻弧菌的最低抑菌濃度為0.0078125mg/ml，對(duì)乙型鏈球菌的最低抑菌濃度為0.25mg/ml，對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.00390625mg/ml。而陽(yáng)性對(duì)照氨芐青霉素對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.00625mg/ml，對(duì)溶藻弧菌的最低抑菌濃度為0.0078125mg/ml，對(duì)乙型鏈球菌的最低抑菌濃度為0.25mg/ml，對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.25mg/ml。同濃度的多肽h3與氨芐青霉素比較，多肽h3的抑菌效果甚至比氨芐青霉素還要強(qiáng)，這樣的發(fā)現(xiàn)對(duì)于未來(lái)h3抗菌肽代替抗生素提供了可能，同時(shí)在制藥方面也存在著無(wú)限的可能。

實(shí)施例3凡納濱對(duì)蝦組蛋白h4抗菌肽的預(yù)測(cè)及結(jié)構(gòu)分析

3.1組蛋白h4抗菌肽表面親和力及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

組蛋白h4的表面親和力和二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)netsurfpver.1.1-proteinsurfaceaccessibilityandsecondarystructurepredictions(http：//www.cbs.dtu.dk/services/netsurfp/)網(wǎng)站預(yù)測(cè)，結(jié)果如下：

3.1.1合成多肽h3表面親和力和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

表4合成多肽h3表面親和力和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)值

從表4可以看出，從空間結(jié)構(gòu)的可能性來(lái)看，h3形成α螺旋的可能性較大，形成β折疊的可能性較小。

3.2合成多肽h3的3d模型預(yù)測(cè)及結(jié)構(gòu)分析

已知凡納濱對(duì)蝦組蛋白h4的序列，并取出包含h3肽段的一段序列：kvlrdniqgitkpairrlarrggvkrisgliyeetrgvlkvflen(其中加粗部分為h3肽段的序列)，通過(guò)swiss-model|workspace(http：//swissmodel.expasy.org/interactive)網(wǎng)站預(yù)測(cè)，對(duì)這段序列進(jìn)行同源建模，得到如下模型。

如圖5所示，箭頭所指螺旋部分為h3肽段的3d結(jié)構(gòu)模型，通過(guò)模型可以看出，h3肽段的結(jié)構(gòu)中存在α-螺旋。由圖5可知h3肽段存在α-螺旋結(jié)構(gòu)和線狀的松散結(jié)構(gòu)。

3.3合成多肽h3的理化性質(zhì)分析

合成多h3通過(guò)heliquest(http：//heliquest.ipmc.cnrs.fr/)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果如下：

表5合成多肽h3的理化性質(zhì)

根據(jù)以上圖6和表5，可知合成多肽h3的疏水性為0.064，疏水性力矩為0.070，凈電荷為7.，極性殘基10個(gè)，非極性殘基7個(gè)。大多抗菌肽在生理ph7.0條件下帶凈正電荷，正電荷數(shù)2-9，但是多數(shù)2-5個(gè)。一般在一定的范圍內(nèi)，凈電荷數(shù)的增加伴隨著抑菌活性的增強(qiáng)。合成多肽h3的凈電荷已經(jīng)達(dá)到7個(gè)，這可能會(huì)成為其抑菌活性強(qiáng)的原因。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說(shuō)明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>集美大學(xué)

<120>一種凡納濱對(duì)蝦組蛋白抗菌肽及其應(yīng)用

<130>2017

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

proalaileargargleualaargargglyglyvallysargile

151015