1.本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種多粘類芽孢桿菌菌劑、制備方法及其應(yīng)用。


背景技術(shù)：

2.藏紅花(crocus sativus l.)又稱西紅花，僅以雌蕊上部三根紅色柱頭入藥，產(chǎn)量較低，素有“紅色金子”之稱，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神功效，是傳統(tǒng)名貴中藥材，也是世界上最名貴香料和染料。藏紅花是異源三倍體，只開花不結(jié)種，生產(chǎn)上只能靠球莖無性繁殖，因此，球莖產(chǎn)量和質(zhì)量直接影響藏紅花的產(chǎn)量和質(zhì)量。藏紅花原產(chǎn)于地中海地區(qū)，現(xiàn)伊朗是主產(chǎn)區(qū)，其產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量90％以上。我國于1986年在上海崇明島引種成功，目前浙江為主產(chǎn)區(qū)，種植面積約0.6萬畝，約占全國的50％以上， 2018年藏紅花被評為新“浙八味”。但不同于主產(chǎn)地地中海氣候，我國江浙地區(qū)夏季溫?zé)岢睗?，地下球莖很容易受病原菌侵染生病腐爛，因此在5月初新球莖成熟時挖出放置室內(nèi)培育半年直至開花，12月室內(nèi)采花結(jié)束后種田里繁育球莖的“二段式”栽培方法。但即使在室內(nèi)期間，藏紅花腐爛病仍常發(fā)生。藏紅花球莖年均繁殖率僅為1.2，引種三十多年來，浙江種植面積僅 4000畝左右，藏紅花球莖腐爛病防治是我國藏紅花種植業(yè)發(fā)展的瓶頸。
3.因此，球莖腐爛病已是阻礙藏紅花產(chǎn)業(yè)發(fā)展最關(guān)鍵的破壞性因素。球莖腐爛病主要是由一種土傳病原真菌尖孢鐮刀菌(f.oxysporum)，以土壤為傳播媒介，從根部侵染球莖，消耗宿主營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致植株萎蔫死亡，各栽培時期均可發(fā)生，尤其在夏季高溫的6月下旬至8月下旬發(fā)病率最高。我國主產(chǎn)區(qū)浙江建德高發(fā)年份發(fā)病率可高達(dá)50％，嚴(yán)重阻礙國內(nèi)藏紅花種植業(yè)發(fā)展，因此國內(nèi)80％藏紅花仍需進(jìn)口。目前農(nóng)戶主要使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，但效果不佳，并且這些化學(xué)物質(zhì)對環(huán)境和人類的有害影響已得到充分證實(shí)，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留嚴(yán)重，土壤的理化性質(zhì)發(fā)生改變，使得病原菌的抗藥性不斷增強(qiáng)，也會影響與植物相關(guān)的有益微生物群。
4.因此，迫切需要尋找新型防治藏紅花球莖腐爛病的有效方法，對促進(jìn)我國生態(tài)壞境和藏紅花產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。


技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

5.本發(fā)明的目的在于提供一種多粘類芽孢桿菌，該種多粘類芽孢桿菌能夠有效抑制尖孢鐮刀菌的生長，從而從根本上降低藏紅花球莖腐爛病的發(fā)病率。
6.本發(fā)明的第二目的在于提供一種多粘類芽孢桿菌在制備用于防治藏紅花球莖腐爛病的藥物中的應(yīng)用。該多粘類芽孢桿菌能夠有效抑制尖孢鐮刀菌的生長，從而降低藏紅花球莖腐爛病的發(fā)病率，對藏紅花球莖腐爛病防治效果明顯，并且不會產(chǎn)生農(nóng)藥殘留，環(huán)境污染等問題。
7.本發(fā)明的第三目的在于提供一種包括該多粘類芽孢桿菌的菌劑，該菌劑能夠有效抑制尖孢鐮刀菌的生長，從而有效降低尖孢鐮刀菌所引起的藏紅花球莖腐爛病的發(fā)病幾
率，進(jìn)而提高了藏紅花的存活率。
8.本發(fā)明的第四目的在于提供一種菌劑的使用方法，該使用方法明確了每次菌劑的使用量和使用次數(shù)，從而確保該菌劑能成功抑制尖孢鐮刀菌的生長發(fā)育，以起到降低藏紅花球莖腐爛病發(fā)病率的作用。
9.本發(fā)明的第五目的在于提供一種包括該多粘類芽孢桿菌的菌劑的制備方法，該方法簡單易操作，且不會對環(huán)境造成危害。
10.本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。
11.本發(fā)明實(shí)施例提供了一種多粘類芽孢桿菌，名為多粘類芽孢桿菌cs12paenibacilluspolymyxa，所述多粘類芽孢桿菌cs12的保藏號為cgmcc no.22612，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2021 年5月26日。土壤微生物群落對于植物健康具有重要意義，植物的健康生長與根際土壤微生物群落的平衡密切相關(guān)，根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)的不平衡是土傳病害發(fā)生的主要原因。在種植了10年葡萄的土壤里間作藏紅花，發(fā)達(dá)的葡萄根系與藏紅花根系緊密交纏在一起，葡萄地下根系通過給藏紅花根系引入新的微生物，塑造具有間作優(yōu)勢獨(dú)特的藏紅花根際微生態(tài)，對防治藏紅花球莖腐爛病具有顯著效果。本發(fā)明利用藏紅花球莖腐爛病的主要致病菌尖孢鐮刀菌(fusarium oxysporum)對間作在葡萄地里的藏紅花根際土壤微生物進(jìn)行高效的拮抗分離，得到了一株具有顯著拮抗尖孢鐮刀菌效果的細(xì)菌，即為多粘類芽孢桿菌cs12。該多粘類芽孢桿菌由高效96孔板對峙試驗(yàn)從葡萄-藏紅花間作的土壤中分離并進(jìn)一步通過活體抗病試驗(yàn)等分離純化得到，其能夠通過有效抑制引起藏紅花球莖腐爛病的病原菌——尖孢鐮刀菌的生長，從而從根本上降低藏紅花球莖腐爛病的發(fā)病幾率；并且該多粘類芽孢桿菌cs12不會對土壤和環(huán)境造成損傷和危害，以能夠放心使用，不用擔(dān)心污染問題。多粘類芽孢桿菌以芽孢形式存在，耐溫性好，質(zhì)量穩(wěn)定，“以菌治菌”，藥效持久；“藥肥兼能”，不僅是防治青枯病、枯萎病、根腐病、軟腐病等土傳病害最理想的藥劑，而且具有明顯的促進(jìn)生長、提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)的作用；無任何藥害和殘留，是無公害、綠色生產(chǎn)的首選微生物制劑。
12.本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種多粘類芽孢桿菌在制備用于防治藏紅花球莖腐爛病的藥物中的應(yīng)用。該多粘類芽孢桿菌能夠有效抑制尖孢鐮刀菌的生長，從而降低藏紅花球莖腐爛病的發(fā)病率，對藏紅花球莖腐爛病防治效果明顯，并且不會產(chǎn)生農(nóng)藥殘留，環(huán)境污染等問題。
13.本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種由上述多粘類芽孢桿菌cs12制得的菌劑，通過使用該多粘類芽孢桿菌cs12所制得的菌劑可以通過灌根或注射等方式對感染尖孢鐮刀菌的藏紅花根部進(jìn)行施用，從而起到抑制藏紅花根部的尖孢鐮刀菌的生長作用，進(jìn)而降低藏紅花的球莖腐爛病的發(fā)病率，從而提高藏紅花的存活率；并且該菌劑無公害、無污染，不會對土壤和環(huán)境造成負(fù)擔(dān)，便于長期使用。
14.本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種上述菌劑的使用方法，包括如下步驟，菌劑每3天施用一次，每次5ml，持續(xù)21-30天。該使用方法通過限定每次菌劑的使用量和使用次數(shù)以保證菌劑能夠有效發(fā)揮抑制尖孢鐮刀菌的效果。
15.本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種上述菌劑的制備方法，包括如下步驟，在無菌條件下，挑取多粘類芽孢桿菌cs12的單菌落并接種于na或pda培養(yǎng)基內(nèi)，于28-37℃、75％rh暗培養(yǎng)24-48h，得到純化菌落；于無菌條件下，挑取純化菌落并接種于nb或pdb培養(yǎng)基中，于28℃、
180rpm振蕩培養(yǎng)24h得到種子菌；將種子菌接種于nb或pdb培養(yǎng)基中，于28℃、180 rpm發(fā)酵48h，形成發(fā)酵液，即得到菌劑。該方法操作簡單方便，通過將該菌株分離純化得到單菌落以及種子菌，并將該菌落的種子菌發(fā)酵后即得到該菌液。
16.相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)施例至少具有如下優(yōu)點(diǎn)或有益效果：
17.一、本發(fā)明的實(shí)施例提供了一種多粘類芽孢桿菌，該多粘類芽孢桿菌名為多粘類芽孢桿菌cs12，從葡萄-藏紅花間作的土壤中分離得到，能夠有效抑制土壤中尖孢鐮刀菌的生長和發(fā)育，從而降低了藏紅花球莖腐爛病的發(fā)病幾率。
18.二、本發(fā)明的實(shí)施例還提供了一種多粘類芽孢桿菌在制備用于防治藏紅花球莖腐爛病的藥物中的應(yīng)用，該多粘類芽孢桿菌能夠有效抑制尖孢鐮刀菌的生長，從而降低藏紅花球莖腐爛病的發(fā)病率，對藏紅花球莖腐爛病防治效果明顯，并且不會產(chǎn)生農(nóng)藥殘留，環(huán)境污染等問題。
19.三、本發(fā)明的實(shí)施例還提供了一種菌劑，該菌劑由多粘類芽孢桿菌 cs12制得，該菌劑能夠被藏紅花根部吸收，從而在藏紅花根部發(fā)揮抑制尖孢鐮刀菌的生長的作用，由于尖孢鐮刀菌為藏紅花球莖腐爛病的主要致病菌，因此通過抑制尖孢鐮刀菌的生長，能夠降低藏紅花球莖腐爛病的發(fā)病幾率，從而對我國藏紅花的發(fā)展有重要意義。
20.四、本發(fā)明的實(shí)施例還提供了一種菌劑的使用方法，該方法通過以合理的用量和方式來確保該菌劑能夠有效且合理的抑制尖孢鐮刀菌的生長和發(fā)育，從而確保該菌劑的抑制效果顯著。
21.五、本發(fā)明的實(shí)施例還提供了一種菌劑的制備方法，該制備方法通過將該多粘類芽孢桿菌cs12分離純化后以得到單菌落，后續(xù)再通過將單菌落分離純化以得到種子菌，最后通過將種子菌進(jìn)行發(fā)酵即可制得該菌劑，該制備方法簡單方便易操作，且所制得的菌劑對尖孢鐮刀菌具有良好的抑制效果，從而降低藏紅花球莖腐爛病的發(fā)病幾率。
附圖說明
22.為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。
23.圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中多粘類芽孢桿菌(p.polymyxa)cs12對藏紅花球莖腐爛病病原菌尖孢鐮刀菌的抑制作用圖(a為尖孢鐮刀菌f. oxysporum，b為cs12對f.oxysporum的對峙)；
24.圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中基于16srdna引物擴(kuò)增的多粘類芽孢桿菌 cs12的凝膠電泳圖；
25.圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中采用鄰接法得到的基于16srdna的多粘類芽孢桿菌cs12的系統(tǒng)進(jìn)化樹；
26.圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中多粘類芽孢桿菌(p.polymyxa)在na固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖；
27.圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中給尖孢鐮刀菌后28天球莖的生長情況圖，(其中a為空白對照組，b為模型組，c為益生菌組)。
具體實(shí)施方式
28.為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
29.需要說明的是，在不沖突的情況下，本技術(shù)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。下面將參考具體實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。
30.本發(fā)明實(shí)施例提供了一種多粘類芽孢桿菌，名為多粘類芽孢桿菌cs12，多粘類芽孢桿菌cs12的保藏號為cgmcc no.22612，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2021年5 月30日。多粘類芽孢桿菌在根、莖、葉等植物體內(nèi)具有很強(qiáng)的定殖能力，可通過位點(diǎn)競爭阻止病原菌侵染植物；同時多粘類芽孢桿菌不斷分泌出的廣譜抗菌物質(zhì)可抑制或殺滅病原菌；此外，多粘類芽孢桿菌還能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性。土壤微生物群落對于植物健康具有重要意義，植物的健康生長與根際土壤微生物群落的平衡密切相關(guān)，根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)的不平衡是土傳病害發(fā)生的主要原因。在種植了10年葡萄的土壤里間作藏紅花，發(fā)達(dá)的葡萄根系與藏紅花根系緊密交纏在一起，葡萄地下根系通過給藏紅花根系引入新的微生物，塑造具有間作優(yōu)勢獨(dú)特的藏紅花根際微生態(tài)，對防治藏紅花球莖腐爛病具有顯著效果。本發(fā)明利用藏紅花球莖腐爛病的主要致病菌尖孢鐮刀菌對間作在葡萄地里的藏紅花根際土壤微生物進(jìn)行高效的拮抗分離，得到了一株具有顯著抗尖孢鐮刀菌效果的細(xì)菌，即為多粘類芽孢桿菌cs12。該多粘類芽孢桿菌cs12主要在藏紅花的根部定殖，從而通過位點(diǎn)競爭以阻止尖孢鐮刀菌對藏紅花球莖進(jìn)行侵染，從而切斷尖孢鐮刀菌的營養(yǎng)來源，進(jìn)而抑制了尖孢鐮刀菌的生長，降低了藏紅花球莖腐爛病的患病幾率；且該多粘類芽孢桿菌cs12不會對土壤和環(huán)境造成污染，進(jìn)而便于長期使用。
31.在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，上述多粘類芽孢桿菌的16srdna序列如 seq id no.1所示。
32.另一方面，本發(fā)明的實(shí)施例還提供了一種多粘類芽孢桿菌在制備用于防治藏紅花球莖腐爛病的藥物中的應(yīng)用。由于該多粘類芽孢桿菌cs12能夠有效抑制尖孢鐮刀菌的生長，而尖孢鐮刀菌為藏紅花球莖腐爛病的主要致病菌，因此使用該菌株制得的藥物能夠通過抑制尖孢鐮刀菌的生長而有效降低藏紅花球莖腐爛病的發(fā)病幾率。
33.另一方面，本發(fā)明的實(shí)施例還提供了一種菌劑，該菌劑由上述多粘類芽孢桿菌cs12制得。通過使用該多粘類芽孢桿菌cs12所制得的菌劑可以對感染尖孢鐮刀菌的藏紅花根部進(jìn)行施用，從而起到抑制藏紅花根部的尖孢鐮刀菌的生長作用，進(jìn)而降低藏紅花的球莖腐爛病的發(fā)病率，最終提高藏紅花的存活率；并且該菌劑無公害、無污染，不會對土壤和環(huán)境造成負(fù)擔(dān)，便于長期使用。
34.在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，上述菌劑中多粘類芽孢桿菌cs12的濃度為 10
7-108cfu/ml。該濃度區(qū)間的多粘類芽孢桿菌cs12能夠保證菌劑能夠有效發(fā)揮防治效果的同時且避免多粘類芽孢桿菌cs12對藏紅花本身的生長發(fā)育而造成影響。
35.在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，上述菌劑每3天施用一次，每次5ml，持續(xù)21-30天。此為該菌劑的使用方法，通過該施用量和施用次數(shù)以確保該多粘類芽孢桿菌cs12能夠穩(wěn)定抑制尖孢鐮刀菌的生長，并避免該多粘類芽孢桿菌cs12在藏紅花根部積存過多而影響藏紅花本
身的生長及發(fā)育。
36.在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，上述施用的方法為灌根或注射。通過使用菌劑對感染了藏紅花球菌腐爛病的藏紅花進(jìn)行灌根或?qū)Ω窟M(jìn)行直接注射以抑制染病植株中尖孢鐮刀菌的生長，從而降低藏紅花球菌腐爛病的發(fā)病幾率。
37.另一方面，本發(fā)明的實(shí)施例還提供了一種上述菌劑的制備方法，該方法包括如下步驟，在無菌條件下，挑取多粘類芽孢桿菌cs12的單菌落并接入滅菌的na或pda培養(yǎng)基內(nèi)，于28-37℃、75％rh暗培養(yǎng)24-48h，得到純化菌落；于無菌條件下，挑取純化菌落并接種于滅菌的nb或pdb培養(yǎng)基中，于28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)24h得到種子菌；將種子菌接種于nb 或pdb培養(yǎng)基中，于28℃、180rpm發(fā)酵48h，形成發(fā)酵液，即得到菌劑。其中先將多粘類芽孢桿菌cs12于na培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，以得到純化的多粘類芽孢桿菌cs12的單菌落，通過挑取該單菌落將其接種于nb或 pdb培養(yǎng)基中，得到種子菌培養(yǎng)基，以便于后續(xù)進(jìn)行發(fā)酵，最后通過將種子菌單菌落接種于nb或pdb培養(yǎng)基內(nèi)發(fā)酵，使該多粘類芽孢桿菌cs12 在nb培養(yǎng)基中大量繁殖，進(jìn)而得到菌劑。
38.在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，上述na培養(yǎng)基包括蛋白胨10g、牛肉膏3 g、氯化鈉5g和瓊脂20g，na培養(yǎng)基的ph為7.0-7.4；nb培養(yǎng)基包括蛋白胨10g、牛肉膏3g和氯化鈉5g，nb培養(yǎng)基的ph為7.0-7.4。pda培養(yǎng)基包括土豆200g的水煎煮液、葡萄糖20g和瓊脂15g；pdb培養(yǎng)基包括土豆200g的水煎煮液和葡萄糖20g，pdb培養(yǎng)基的ph為7.0-7.4。
39.上述原料為所使用的na或pda培養(yǎng)基以及nb或pdb培養(yǎng)基的配方，以為多粘類芽孢桿菌cs12的生長和代謝提供基本的營養(yǎng)物質(zhì)和原料，其能夠有利于多粘類芽孢桿菌cs12的生長和代謝，使該多粘類芽孢桿菌cs12 的代謝速率處于較高水平，從而有利于多粘類芽孢桿菌cs12的大量生長和繁殖以及種子菌的形成等。
40.在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，上述菌劑按種子菌液:nb或pdb培養(yǎng)基的體積比為1:(10-100)的接種量接種。該接種量區(qū)間的種子菌能夠在發(fā)酵液中大量增殖和發(fā)育，從而以提高最終所制得的菌劑的抗病效果。
41.以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
42.實(shí)施例1
43.多粘類芽孢桿菌cs12的篩選、分離、純化和鑒定：
44.(1)2020年8月15日從浙江湖州南太湖現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園區(qū)葡萄與藏紅花間作地里采集健康藏紅花根際土壤。稱取0.5g土壤加入2ml無菌水， 180rpm/min振蕩20min，得到懸液，利用rotor hda菌落高通量篩選工作站(英國singer)進(jìn)行自動點(diǎn)樣到96孔板上，尖孢鐮刀菌在中間，四周正方形等距離點(diǎn)4個土壤懸液，點(diǎn)樣結(jié)束后，用封口膜把板密封，于37℃暗培養(yǎng)2-3天，選擇有明顯抑菌帶的菌落進(jìn)行分離純化。
45.(2)挑取抑菌帶明顯的菌落，采用劃線法接種到na培養(yǎng)基上，對其進(jìn)行純化。挑取純化的單菌落接種至30ml(50ml錐形瓶)nb液體培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩搖床中以28℃，180rpm培養(yǎng)條件培養(yǎng)12-48h。在超凈臺中用一次性巴氏滴管吸取少量菌劑于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在蔡司正置熒光顯微鏡下進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)，用無菌水將孢子懸浮液濃度稀釋為10
7-108cfu/ml。
46.(3)將藏紅花球莖腐爛病病原菌尖孢鐮刀菌(從同一地塊，生病植株根際土壤中分離)，接種到pda培養(yǎng)基上，于26
±
2℃暗環(huán)境下培養(yǎng)5-7d，用直徑6mm的滅菌打孔器制成菌
塊，接到新pda培養(yǎng)基中心處，在距圓心2cm處等距離放3個直徑為6mm無菌濾紙片，用移液槍吸取孢子懸浮液3μl置在濾紙片上。等體積的nb培養(yǎng)液作為陰性對照，每個處理重復(fù) 3次。放入培養(yǎng)箱，在26
±
2℃暗環(huán)境下培養(yǎng)5-7d，檢測對峙培養(yǎng)結(jié)果，所得結(jié)果如圖1所示，根據(jù)圖1結(jié)果計(jì)算相對抑菌率。相對抑菌率(％)＝(對照菌落半徑－處理菌落半徑)/(對照菌落半徑－菌餅半徑)
×
100％，選擇其中相對抑菌率大于85％的菌株，進(jìn)行分子鑒定。
47.將上述對尖孢鐮刀菌抑制率大于85％的菌株分別接種到nb液體培養(yǎng)基中，在搖床中以180rpm/min的轉(zhuǎn)速30℃恒溫振蕩24-48h。吸取2ml 至離心管中，按照天根dp302細(xì)菌基因組dna提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)步驟提取菌株dna。采用細(xì)菌通用引物對分離細(xì)菌 16srdna進(jìn)行擴(kuò)增。所用正向引物27f的序列如seq id no.2，所用反向引物1492r的序列如seq id no.3所示。擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性3min； 94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后在72℃下延伸5min，終止反應(yīng)，所得多粘類芽孢桿菌cs12的擴(kuò)增序列如表1所示。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后的pcr產(chǎn)物送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定，其凝膠電泳圖如圖2所示。以pcr產(chǎn)物測得序列作為靶序列，在ncbi中的genbank數(shù)據(jù)庫搜索同源序列，下載與形態(tài)型序列最相似的參考序列，用鄰接法(neighbor-joining，nj)用于系統(tǒng)發(fā)育分析，來確定待鑒定菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位，所得結(jié)果如圖3所示。經(jīng)形態(tài)學(xué)，生理生化分析(見表2，其中+為能利用或陽性，-為無法利用或陰性)和 16srrna分子生物學(xué)鑒定，確定了本發(fā)明的根際細(xì)菌菌株為多粘類芽孢桿菌cs12，保藏編號為cgmcc no.22612。
48.表1多粘類芽孢桿菌cs12的16srdna序列和所用引物的序列表
49.[0050][0051]
[0052]
表2多粘類芽孢桿菌cs12的生理生化特征表
[0053]
指標(biāo)表達(dá)情況指標(biāo)表達(dá)情況葡萄糖+3％nacl硫化氫-木糖+丙二酸鈉-阿拉伯糖+尿素酶+麥芽糖+過氧化氫酶-山梨醇-明膠水解-甘露醇+mp-硝酸鹽肉湯+v-p+
[0054]
實(shí)施例2
[0055]
多粘類芽孢桿菌cs12的菌劑的抗病實(shí)驗(yàn)：
[0056]
(1)取斜面保存的尖孢鐮刀菌菌株，在無菌條件下，用接種針挑取少許菌絲接種到pda培養(yǎng)基上活化，26
±
2℃暗環(huán)境下培養(yǎng)5-7d；用直徑6mm 的滅菌打孔器制成菌塊，接種到pdb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每10ml pdb接種1個菌塊。在30℃，180rpm/min培育4-5d。將培養(yǎng)好的尖孢鐮刀菌發(fā)酵液在超凈臺內(nèi)，用兩層無菌紗布過濾。吸取100μl孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)目，調(diào)整至f.oxysporum 10
5-106個孢子/ml懸浮液。
[0057]
(2)冷凍保存在25％甘油中的cs12菌株，在無菌條件下，吸取100μl 涂布在na培養(yǎng)基上，于28-37℃，75％濕度條件下暗培養(yǎng)24-48h，觀察其培養(yǎng)特征，所得結(jié)果如圖4所示；將活化后的菌株，用接種針挑取單菌落接種于25ml nb培養(yǎng)基中，28℃，180rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)24h制備種子菌；種子菌以1-10％接種量接種于新的nb培養(yǎng)基中，在28℃，180rpm 條件下發(fā)酵48h，形成菌劑。培養(yǎng)的菌劑用無菌水進(jìn)行稀釋，將菌劑的 od600調(diào)整為0.4-0.6。
[0058]
(3)藏紅花球莖進(jìn)入休眠期，從建德市三都西紅花專業(yè)合作社購買了外觀無病斑，單重25
±
1g的藏紅花球莖。待7月底，球莖快結(jié)束休眠時，把球莖外皮去除，用三步消毒法(75％乙醇60s，2.5％次氯酸鈉5min，75％乙醇30s)進(jìn)行表面滅菌，然后球莖用無菌水多次沖洗，晾干。用于實(shí)驗(yàn)。
[0059]
(4)球莖隨機(jī)分為3組(空白對照組：control；模型組：尖孢鐮刀菌 +無菌水；益生菌組：cs12+尖孢鐮刀菌)，每組42個，每組3個生物學(xué)重復(fù)。放在43cm
×
33cm
×
28cm育苗盒中進(jìn)行培育。病原菌和益生菌均采用針刺法接種。cs12組提前3天在球莖頂部3個位置注射cs12各10μl，空白組和模型組接種等體積的無菌水。每隔3天注射一次，在第二次接種時，模型組和cs12組同時接種尖孢鐮刀菌，持續(xù)28天，其中28天后的球莖生長情況如圖5所示，使用autocad2019軟件統(tǒng)計(jì)病斑面積，計(jì)算發(fā)病指數(shù)。病情分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，無病斑；1級，球莖病斑面積小于10％；2級，球莖病斑面積為10％-30％；3級，球莖病斑面積為30％-50％；4級，球莖病斑面積為50％-70％；5級，球莖病斑面積大于70％。病情指數(shù)(di)＝[σ(病級株數(shù)
×
代表數(shù)值)/株數(shù)總和]
×
100。各組的病情指數(shù)如表3所示。
[0060]
表3空白對照組、模型組和益生菌組的病情指數(shù)表
[0061]
組別空白對照組模型組益生菌組病情指數(shù)67
±
10.2439
±
48.3102
±
19.2
[0062]
其中根據(jù)表3結(jié)果并按照公式防治效果(％)＝(模型組病情指數(shù)－益生菌組病情指數(shù))/模型組病情指數(shù)
×
100％，計(jì)算得知，cs12的防治效果為 76.7％，因此可以得出該多
粘類芽孢桿菌cs12對尖孢鐮刀菌具有明顯的抑菌效果從而能夠有效降低藏紅花球莖腐爛病的發(fā)病率。
[0063]
實(shí)施例3
[0064]
多粘類芽孢桿菌cs12的菌劑用于防治藏紅花球莖腐爛病的田間實(shí)驗(yàn)：
[0065]
選取了連續(xù)種植了5年的藏紅花地塊，劃分成同等大小的三塊地，設(shè)置了2個平行地塊(20m
×
4m)，分別為對照組和cs12組。cs12組采用灌根法給予實(shí)施例2中的菌劑，每個球莖5ml，以常規(guī)栽培管理方法為對照組。在球莖休眠期，挖取球莖，統(tǒng)計(jì)球莖發(fā)病率，計(jì)算防治效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)施用了多粘類芽孢桿菌cs12的地塊，球莖腐爛病發(fā)生率在5％以下，顯著低于未施用的對照組，說明該多粘類芽孢桿菌cs12所制得的菌劑能夠有效降低藏紅花球莖腐爛病的發(fā)病幾率。
[0066]
綜上所述，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種多粘類芽孢桿菌及其應(yīng)用以及包括該多粘類芽孢桿菌的菌劑及其制備方法：
[0067]
一、本發(fā)明的實(shí)施例提供了一種多粘類芽孢桿菌，該多粘類芽孢桿菌名為多粘類芽孢桿菌cs12，從葡萄-藏紅花間作的土壤中分離得到，能夠有效抑制土壤中尖孢鐮刀菌的生長和發(fā)育，從而降低了藏紅花球莖腐爛病的發(fā)病幾率。
[0068]
二、本發(fā)明的實(shí)施例還提供了一種多粘類芽孢桿菌在制備用于防治藏紅花球莖腐爛病的藥物中的應(yīng)用，該多粘類芽孢桿菌能夠有效抑制尖孢鐮刀菌的生長，從而降低藏紅花球莖腐爛病的發(fā)病率，對藏紅花球莖腐爛病防治效果明顯，并且不會產(chǎn)生農(nóng)藥殘留，環(huán)境污染等問題。
[0069]
三、本發(fā)明的實(shí)施例還提供了一種菌劑，該菌劑有多粘類芽孢桿菌 cs12制得，該菌劑能夠被藏紅花根部吸收，從而在藏紅花根部發(fā)揮抑制尖孢鐮刀菌的生長的作用，由于尖孢鐮刀菌為藏紅花球莖腐爛病的主要致病菌，因此通過抑制尖孢鐮刀菌的生長，能夠降低藏紅花球莖腐爛病的發(fā)病幾率，從而對我國藏紅花的發(fā)展有重要意義。
[0070]
四、本發(fā)明的實(shí)施例還提供了一種菌劑的使用方法，該方法通過以合理的用量和方式來確保該菌劑能夠有效且合理的抑制尖孢鐮刀菌的生長和發(fā)育，從而確保該菌劑的抑制效果優(yōu)秀。
[0071]
五、本發(fā)明的實(shí)施例還提供了一種菌劑的制備方法，該制備方法通過將該多粘類芽孢桿菌cs12分離純化后以得到單菌落，后續(xù)再通過將單菌落分離純化以得到種子菌，最后通過將種子菌進(jìn)行發(fā)酵即可制得該菌劑，該制備方法簡單方便易操作，且所制得的菌劑對尖孢鐮刀菌具有良好的抑制效果，從而降低藏紅花球莖腐爛病的發(fā)病幾率。
[0072]
以上所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本發(fā)明的實(shí)施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。