本發(fā)明涉及免疫分析領(lǐng)域，尤其涉及石蠟微球、組織細(xì)胞分離試劑及免疫刻蝕的方法。

背景技術(shù)：

1、細(xì)胞是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，所有生物均由細(xì)胞構(gòu)成。高等生命為生命活動(dòng)，進(jìn)行細(xì)胞分化，使得一種組織少則由數(shù)種細(xì)胞，多則由數(shù)十種細(xì)胞構(gòu)成。這些細(xì)胞在空間上有序排列，且細(xì)胞體積較小，常規(guī)方法很難分別分析。

2、現(xiàn)有技術(shù)包括單細(xì)胞分離、顯微切割等，顯微切割術(shù)(microdissection)是90年代初發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新技術(shù)，它能夠從組織切片或細(xì)胞涂片上的任一區(qū)域內(nèi)切割下幾百個(gè)、幾十個(gè)同類(lèi)細(xì)胞，甚至單個(gè)細(xì)胞，再進(jìn)行有關(guān)的分子生物學(xué)方面的研究，如pcr，pcr-sscp及比較基因組雜交等單細(xì)胞分離法是一種從待分離的材料中直接分離單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)獲得純培養(yǎng)的方法。該法在顯微鏡下操作，對(duì)于體積較大的微生物，可以用毛細(xì)管提取微生物個(gè)體；對(duì)較小的細(xì)胞或孢子，可以用顯微針、鉤、環(huán)等挑取以獲得單細(xì)胞；也可將適當(dāng)稀釋后的樣品制成小液滴，在顯微鏡下選取只含有一個(gè)細(xì)胞的液滴培養(yǎng)。

3、單細(xì)胞分離、顯微切割均需要昂貴復(fù)雜的儀器，不利于技術(shù)的推廣、應(yīng)用及生命研究的進(jìn)行。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了石蠟微球、組織細(xì)胞分離試劑及免疫刻蝕的方法。本發(fā)明提供了一種成本低、步驟簡(jiǎn)單、易于推廣的組織細(xì)胞分析方法。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了石蠟微球，包括十八烷酸、石蠟和乙醇溶液；所述十八烷酸和所述石蠟的質(zhì)量比為1:(10～100)。

4、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述石蠟微球中，所述十八烷酸和所述石蠟的質(zhì)量比為1:100。

5、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述石蠟微球中，所述十八烷酸和所述石蠟的質(zhì)量比為1:10。

6、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中上述石蠟微球中，所述石蠟的密度為0.9g/cm3。

7、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中上述石蠟微球中，所述乙醇的密度為0.9g/cm3。

8、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中上述石蠟微球中，所述乙醇的密度與與所述石蠟的密度相同，所述石蠟的液滴可以懸浮在溶液中；ph為堿性，可使所述十八烷酸去質(zhì)子，使所述石蠟的液滴表面帶負(fù)電，相互排斥，避免互溶。

9、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中上述石蠟微球中，所述乙醇的作用包括：其一，可使石蠟在該溶液中懸??；其二，0.1mol/l?naoh使十八烷酸去質(zhì)子化，使石蠟液滴表面帶有負(fù)電荷，阻止石蠟液滴融合。

10、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中上述石蠟微球中，所述石蠟微球的直徑為200nm。

11、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述石蠟微球中所述乙醇溶液的濃度為64％，所述乙醇溶液的溶質(zhì)包括0.1mol/l的naoh。

12、本發(fā)明還提供了上述石蠟微球的制備方法，取所述十八烷酸與所述石蠟混合后，與所述乙醇溶液混合，獲得所述石蠟微球。

13、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述制備方法中所述與所述乙醇溶液混合采用孔徑為200nm的微流控芯片。

14、本發(fā)明還提供了組織分離試劑，包括上述石蠟微球或上述制備方法獲得的石蠟微球和蛋白酶k。

15、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述組織細(xì)胞分離試劑中所述石蠟的熔點(diǎn)低于所述蛋白酶k的消化溫度。

16、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述組織細(xì)胞分離試劑中所述石蠟的溫度為58℃，所述蛋白酶k的消化溫度為50℃。

17、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述組織細(xì)胞分離試劑中所述蛋白酶k的濃度為10μg/ml。

18、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述組織細(xì)胞分離試劑中所述蛋白酶k來(lái)源于天根的dna提取步驟是從dp316。

19、本發(fā)明還提供了上述石蠟微球、上述制備方法獲得的石蠟微球或上述組織細(xì)胞分離試劑在免疫刻蝕中的應(yīng)用。

20、本發(fā)明還提供了免疫刻蝕的方法，包括以下步驟：

21、s1：取上述石蠟微球或上述制備方法獲得的石蠟微球活化后，標(biāo)記二抗，獲得二抗標(biāo)記的石蠟微球；

22、s2：取所述二抗標(biāo)記的石蠟微球融化后覆蓋于預(yù)處理的樣品，獲得待測(cè)樣品；

23、s3：取上述組織細(xì)胞分離試劑中的所述蛋白酶k消化所述待測(cè)樣品，脫蠟，染色，獲得分離的組織細(xì)胞。

24、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述方法s2中所述預(yù)處理包括脫蠟、抗原修復(fù)和一抗孵育的步驟。

25、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述方法中，所述一抗孵育的時(shí)間為1h。

26、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述方法中，所述一抗包括小鼠抗人her2抗體。

27、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述方法中，所述石蠟微球的直徑為200nm。

28、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述方法中，所述石蠟微球的粒徑過(guò)大會(huì)導(dǎo)致石蠟微球漂浮在試劑表面，難以懸浮。

29、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述方法s1中所述活化采用edc和nhs；所述edc的濃度為20mg/ml；所述nhs的濃度為24mg/ml。

30、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述方法s1中所述活化的時(shí)間為30min，溫度為37℃。

31、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述方法s1中所述二抗包括兔抗小鼠抗體。

32、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述方法s1中所述標(biāo)記二抗采用抗原抗體反應(yīng)。

33、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述方法s1中所述標(biāo)記二抗的時(shí)間為15min。

34、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述方法s1中所述標(biāo)記二抗后還包括過(guò)濾和清洗的步驟。

35、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述方法s3中所述消化的溫度為50℃，時(shí)間為30min。

36、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述使用方法，所述蛋白酶k的消化溫度低于所述石蠟的熔點(diǎn)，使得所述石蠟薄膜仍為固態(tài)，防止所述石蠟融化在浮力作用下脫離切片，失去保護(hù)功能。

37、在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述使用方法s2中所述取所述二抗標(biāo)記的石蠟微球融化后覆蓋于預(yù)處理的樣品形成石蠟薄膜，保護(hù)組織不被消化。

38、本發(fā)明還提供了上述方法制得的切片。

39、本發(fā)明提供了石蠟微球及其制備方法、組織細(xì)胞分離試劑、石蠟微球和組織細(xì)胞分離試劑在免疫刻蝕中的應(yīng)用以及免疫刻蝕的方法。

40、本發(fā)明提供了的免疫刻蝕的方法成本低、步驟簡(jiǎn)單、易于推廣。

技術(shù)特征：

1.石蠟微球，其特征在于，包括十八烷酸、石蠟和乙醇溶液；所述十八烷酸和所述石蠟的質(zhì)量比為1:(10～100)。

2.如權(quán)利要求1所述的石蠟微球，其特征在于，所述乙醇溶液的濃度為64％，所述乙醇溶液的溶質(zhì)包括0.1mol/l的naoh。

3.如權(quán)利要求1或2所述的石蠟微球的制備方法，其特征在于，取所述十八烷酸與所述石蠟混合后，與所述乙醇溶液混合，獲得所述石蠟微球。

4.組織細(xì)胞分離試劑，其特征在于，包括如權(quán)利要求1或2所述的石蠟微球或如權(quán)利要求3所述制備方法獲得的石蠟微球和蛋白酶k。

5.如權(quán)利要求4所述的組織細(xì)胞分離試劑，其特征在于，所述石蠟的熔點(diǎn)低于所述蛋白酶k的消化溫度。

6.如權(quán)利要求4或5所述的組織細(xì)胞分離試劑，其特征在于，所述蛋白酶k的濃度為10μg/ml。

7.如權(quán)利要求1或2所述的石蠟微球、如權(quán)利要求3所述制備方法獲得的石蠟微球或如權(quán)利要求4至6任一項(xiàng)所述組織細(xì)胞分離試劑在免疫刻蝕中的應(yīng)用。

8.免疫刻蝕的方法，其特征在于，包括以下步驟：

9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，s2中所述預(yù)處理包括脫蠟、抗原修復(fù)和一抗孵育的步驟。

10.如權(quán)利要求8或9所述方法制得的切片。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及免疫分析領(lǐng)域，尤其涉及石蠟微球、組織細(xì)胞分離試劑及免疫刻蝕的方法。本發(fā)明提供了石蠟微球，包括十八烷酸、石蠟和乙醇溶液；所述十八烷酸和所述石蠟的質(zhì)量比為1:(10～100)。本發(fā)明提供了一種成本低、步驟簡(jiǎn)單、易于推廣的組織細(xì)胞分析方法。

技術(shù)研發(fā)人員：孫開(kāi)宇
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海欣戈賽生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10