本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，尤其是涉及一種dna亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑、方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、表觀遺傳學(xué)是研究在基因核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)水平變化的一門新型遺傳學(xué)分支學(xué)科。表觀遺傳現(xiàn)象很多，如dna甲基化、組蛋白修飾、rna介導(dǎo)的基因沉默、染色體失活等。其中，dna的甲基化是高等真核生物中最主要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

2、所謂dna甲基化是指在dna甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，基因組5'-cpg-3'二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)，為5-甲基胞嘧啶(5-mc)，其含量占所有胞嘧啶殘基的2-5％。dna甲基化與人類發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、遺傳印記和腫瘤疾病的密切關(guān)系。特別是cpg島異常甲基化與腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)，基因組中富含cpg的一段dna稱為cpg島，cpg常成簇存在，長(zhǎng)度在1～2kb左右。迄今為止，超過1000多個(gè)基因cpg高甲基化與癌癥有關(guān)。癌細(xì)胞中特定基因的甲基化為癌癥診斷提供一種早期標(biāo)志物，異常基因dna甲基化主要見于啟動(dòng)子或第一外顯子中的5'-cpg-3'二核苷酸。

3、由于5-甲基胞嘧啶與胞嘧啶具有相同的堿基配對(duì)行為，因此不能簡(jiǎn)單通過基因測(cè)序來確定。在20世紀(jì)90年代早期之前，很少有技術(shù)方法能夠在單個(gè)cpg位點(diǎn)水平上評(píng)估基因組dna中的甲基化模式，并且大多數(shù)技術(shù)需要相對(duì)大量的起始dna(高達(dá)10μg)。1992年，frommer首先報(bào)道dna亞硫酸鹽修飾確定dna分子中胞嘧啶殘基的甲基化狀態(tài)的方法，并提高了轉(zhuǎn)化dna的產(chǎn)量和分析效率。亞硫酸鹽在單鏈dna中將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶(5-mc)則不被轉(zhuǎn)化，用于確定dna分子中胞嘧啶殘基的甲基化狀態(tài)。dna經(jīng)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化處理后，可采用核酸測(cè)序、定量pcr和基因芯片等分析來確定堿基甲基化。

4、重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法是公認(rèn)的dna甲基化分析的標(biāo)準(zhǔn)手段，重亞硫酸鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶脫氨成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則不發(fā)生變化，經(jīng)過pcr(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增，尿嘧啶(u)轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶(t)，而甲基化的5-甲基胞嘧啶(5mc)重新恢復(fù)成胞嘧啶(c)。由于在甲基化dna和異常甲基化dna混雜的樣品中，甲基化異常dna占少數(shù)，因此在下游分析時(shí)需要大量的克隆和測(cè)序，耗時(shí)耗力，且所用鏈特異性pcr不是特異擴(kuò)增變異靶序列，擴(kuò)增效率低，且檢測(cè)靈敏度低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種dna亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑、方法與應(yīng)用。

2、本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

3、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種dna亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑，所述轉(zhuǎn)化試劑由nahso3和na2so3組成；

4、nahso3和na2so3的摩爾比為2-10：1。

5、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種dna亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的組合物，所述組合物由dna保護(hù)劑、溶劑和亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑組成，所述轉(zhuǎn)化試劑由nahso3和na2so3組成；所述dna保護(hù)劑為氫醌或奎諾二甲基丙烯酸酯；所述溶劑為水。

6、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述dna保護(hù)劑為氫醌。

7、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述dna保護(hù)劑和亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑的體積比為1：3-10；

8、nahso3和na2so3的摩爾比為2-10：1。

9、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述dna保護(hù)劑和亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑的體積比為1：3-6；進(jìn)一步的，所述dna保護(hù)劑和亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑的體積比為1：5；

10、nahso3和na2so3的摩爾比為2-5：1；進(jìn)一步的，nahso3和na2so3的摩爾比為3：1。

11、本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種dna轉(zhuǎn)化試劑盒，包括上述dna亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的組合物。

12、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒還包含溶劑、結(jié)合液、洗滌液、洗脫液或純化磁珠中的一種或多種。

13、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述溶劑為水，所述結(jié)合液是含異硫酸氰胍的tris溶液，所述洗滌液是tris的醇溶液，所述洗脫劑是te緩沖液，所述磁珠是羥基磁珠。

14、本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種dna亞硫酸鹽處理方法，包括以下步驟：

15、將dna與上述組合物接觸，得到反應(yīng)體系，然后進(jìn)行孵育，后處理得到亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的dna-dna中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶；

16、其中，所述dna為變性處理后的單鏈dna，

17、反應(yīng)體系中，dna保護(hù)劑的濃度為0-100mm，nahso3的濃度為1-6m，na2so3的濃度為0.5-3m；反應(yīng)體系的ph為5-6。

18、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，反應(yīng)體系中，dna保護(hù)劑的濃度為10-30mm，進(jìn)一步的，dna保護(hù)劑的濃度為20mm；

19、nahso3的濃度為4m，na2so3的濃度為1m；

20、反應(yīng)體系的ph為5.1-5.5。

21、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，dna經(jīng)高溫變性處理(單鏈dna)后，與組合物接觸。

22、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述孵育包括一次孵育和二次孵育；

23、其中，一次孵育過程中，溫度為90-99℃，時(shí)間為5-20分鐘；

24、二次孵育過程中，溫度為50-80℃，時(shí)間為15-60分鐘。

25、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，一次孵育過程中，溫度為94-99℃，時(shí)間為5-15分鐘；

26、二次孵育過程中，溫度為50-70℃，時(shí)間為30-60分鐘。

27、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述后處理包括以下步驟：

28、(1)將亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的dna與磁珠和結(jié)合液接觸，混勻后靜置，得到結(jié)合有dna的磁珠，

29、(2)使用洗滌液洗滌步驟(1)得到的結(jié)合有dna的磁珠，得到預(yù)處理磁珠；

30、(3)使用洗脫液將dna從步驟(2)得到的預(yù)處理磁珠上洗脫，得到亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的dna。

31、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合液為異硫氰酸胍。

32、本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種通過上述方法在檢測(cè)dna甲基化中的應(yīng)用，具體包括以下步驟：

33、對(duì)轉(zhuǎn)化的dna進(jìn)行序列檢測(cè)與未轉(zhuǎn)化dna的序列比較，獲得dna的甲基化結(jié)果。

34、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

35、(1)簡(jiǎn)單：dna無需轉(zhuǎn)換前naoh預(yù)處理；

36、(2)快速：獨(dú)特的亞硫酸鹽配方，dna轉(zhuǎn)化流程可在1h完成；

37、(3)轉(zhuǎn)化率高：將非甲基化胞嘧啶完全轉(zhuǎn)化為尿嘧啶達(dá)99％以上；

38、(4)靈敏度高：dna損失少，含獨(dú)特的dna保護(hù)劑，減少高溫高鹽引起的dna降解；

39、(5)適用性廣：處理后的dna樣品適合于下游靈敏的甲基化分析，如甲基化pcr、甲基化測(cè)序法及甲基化芯片等；

40、(6)臨床適用性廣：由于亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的敏感性增加，適合分析dna含量少的臨床標(biāo)本如體液尤其是血清或血漿，也可以應(yīng)用于痰、糞便、尿液或腦脊液中的dna。