本發(fā)明涉及生物，更具體而言，提供了一種cas9核酸酶，以及包括其的crispr/cas系統(tǒng)及其用途。

背景技術：

1、crispr/cas系統(tǒng)作為原核生物的獲得性免疫機制，具有rna介導的核酸內(nèi)切酶活性。最早發(fā)現(xiàn)的可以用于基因編輯的是由crrna及tracrrna介導的cas9系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過cascade蛋白，主要為cas1和cas2捕獲噬菌體病毒dna或外源質(zhì)粒dna，將其插入自有正向重復序列形成crispr序列。crispr序列轉錄為pre-crrna，經(jīng)加工修飾成為crrna與cas9形成rnp，具有rna導向的dna內(nèi)切酶活性。當細菌再次感染該病毒時，入侵的dna可以被靶向切割，此過程還需要tracrrna(trans-activating?crrna)的參與和特異性識別的pam的存在。crispr/cas系統(tǒng)因為其rna介導的核酸內(nèi)切酶活性而被廣泛應用于基因編輯。

2、在自然界中，crispr/cas系統(tǒng)(clustered?regularly?interspaced?shortpalindromic?repeats)存在于超過40％細菌基因組及70％古細菌基因組中并為其提供免疫防護。crispr系統(tǒng)按同源性可分為class1和class2。class1包括type?i，type?iii和typeiv，class2包括type?ii，type?v和type?vi。class2最明顯的特點在于，由單一cas(crispr-associated?protein)蛋白與crrna(crispr?rna)形成復合體，行使靶向切割功能，操作更為簡單。class2系統(tǒng)雖然只有單一的效應蛋白，但是已發(fā)現(xiàn)的不同type的效應蛋白其蛋白分子量、結構域、crrna，以及pam(protospacer-adjacentmotif)偏好性和核酸切割方式都有明顯區(qū)別，為基因編輯提供了更加靈活的選擇。例如人們所熟知的cas9、cas12、cas13a，都屬于class2。

3、早在1987年，nakata等(ishino,y.,et?al.,nucleotide?sequence?ofthe?iapgene,responsible?for?alkaline?phosphatase?isozyme?conversion?in?escherichiacoli,and?identification?of?the?gene?product.j?bacteriol,1987.169(12):p.5429-33)在研究大腸桿菌中堿性磷酸酶同工酶轉化機制時，在iap基因下游發(fā)現(xiàn)一組29nt的重復序列，這些重復序列又以32nt的非重復序列間隔。在之后的十年時間里，這種重復序列在越來越多的細菌和古細菌中被報道發(fā)現(xiàn)。2000年，mojica等(mojica,f.j.,et?al.,biological?significance?ofa?family?of?regularly?spaced?repeats?in?the?genomesofarchaea,bacteria?and?mitochondria.mol?microbiol,2000.36(1):p.244-6.)將此間隔重復序列歸類為存在于大多細菌與古細菌中的簇狀重復序列家族。2007年，barrangou等(barrangou,r.,et?al.,crispr?provides?acquired?resistance?against?viruses?inprokaryotes.science,2007.315(5819):p.1709-12)在嗜熱鏈球菌(s.thermophilus)中發(fā)現(xiàn)，ii型crispr系統(tǒng)(crispr/cas9)作為天然適應性免疫在菌體降解外來核酸侵染發(fā)揮了重要作用。其中，crispr間隔序列為識別核酸提供靶向特異性，cas蛋白在降解核酸過程中發(fā)揮活性。2011年，deltcheva等(deltcheva,e.,et?al.,crispr?rna?maturation?bytrans-encoded?small?rna?and?host?factor?rnase?iii.nature,2011.471(7340):p.602-7)研究進一步闡明rna復合體、cas9蛋白以及內(nèi)源rnase?iii為crispr/cas系統(tǒng)發(fā)揮靶向作用的重要組成。直到2012年，jinek等(jinek,m.,et?al.,aprogrammable?dual-rna-guided?dna?endonuclease?in?adaptive?bacterial?immunity.science,2012.337(6096):p.816-21)在實驗中開發(fā)一種嵌合sgrna來引導cas9蛋白對特異性位點的切割，將基因編輯系統(tǒng)進一步簡化，并首次將該系統(tǒng)應用于基因組編輯。2013年，feng?zhang等(cong,l.,et?al.,multiplex?genome?engineering?using?crispr/cassystems.science,2013.339(6121):p.819-23)利用crispr/cas9系統(tǒng)在哺乳動物基因組中實現(xiàn)多重編輯。自crispr/cas9系統(tǒng)的功能與結構、機理與條件被人們所研究熟悉后，該系統(tǒng)便廣泛運用于生命科學領域并取得顯著成果。2020年，jennifer?a.doudna和emmanuellecharpentier因在crispr-cas9基因編輯工具的卓越貢獻被授予諾貝爾化學獎。

4、crispr技術發(fā)展迅速，可以應用于細菌，古菌和真核細胞的的基因編輯，但也暴露出許多問題。crispr/cas系統(tǒng)識別靶向序列嚴重依賴于pam序列的存在，pam的局限性大大限制了其在細胞編輯和核酸檢測的應用范圍。其次，對于脫靶率的問題，特異性低導致的脫靶效應以及大片段刪除和復雜的基因重組，還需要加以重視。盡管目前工程化改造的crispr/cas系統(tǒng)在特異性方面有了顯著的提升，并已經(jīng)應用于基因治療，例如β型地中海貧血和鐮刀型細胞貧血病，但是其pam的局限性依然制約可應用范圍。目前商業(yè)化的cas蛋白主要有受到3’端pam?ngg的限制的spcas9和受5’端pam?tttn的限制的lbcas12a/ascas12a。

5、因此，為打破目前商業(yè)cas9體內(nèi)基因組編輯的專利壁壘，豐富基因組編輯工具資源，提升后續(xù)工程化改造潛力，發(fā)掘有體內(nèi)基因組編輯活性的系統(tǒng)尤為重要。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種cas9核酸酶，以及包括其的crispr/cas系統(tǒng)及其用途。

2、因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種cas9核酸酶，其具有如seq?id?no：1所示的氨基酸序列。

3、在第二方面，本發(fā)明提供了一種crispr/cas系統(tǒng)，其包括根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的cas9核酸酶。

4、在第三方面，本發(fā)明提供了一種分離的核酸，所述核酸序列編碼根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的cas9核酸酶的核苷酸序列。

5、在第四方面，本發(fā)明提供了一種表達載體，其包括根據(jù)本發(fā)明第三方面所述的核酸序列。

6、在第五方面，本發(fā)明提供了一種重組細胞，其包含根據(jù)本發(fā)明第四方面所述的表達載體。

7、在第六方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含根據(jù)本發(fā)明第四方面所述的表達載體或根據(jù)本發(fā)明第五方面所述的重組細胞。

8、在第七方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的cas9核酸酶、crispr/cas系統(tǒng)、核酸、表達載體或重組細胞在基因編輯中的用途。

9、本發(fā)明的cas9核酸酶在哺乳動物細胞內(nèi)的基因組編輯活性已得到驗證，為體內(nèi)基因編輯應用方向提供了更多工具和有效位點選擇。