本發(fā)明涉及細胞免疫治療領域，尤其涉及t細胞治療領域，具體涉及一種增強型靶向mage-a4的t細胞受體(tcr)及其應用。

背景技術：

1、免疫治療通過提升患者免疫系統(tǒng)的功能，利用免疫細胞去清除體內的癌細胞，從而達到治愈癌癥的效果。細胞治療是一種過繼性治療，該技術將對靶細胞抗原具有特異性反應性t細胞轉入病人體內，使其針對靶細胞發(fā)揮作用。t細胞受體(tcr)是t細胞表面的一種膜蛋白，其能夠識別相應的靶細胞表面的抗原短肽。在免疫系統(tǒng)中，通過抗原短肽特異性的tcr與短肽-主要組織相容性復合體（pmhc復合物）的結合一起t細胞與抗原呈遞細胞（apc）直接的物理接觸，然后t細胞及apc兩者的其他細胞膜表面分子就發(fā)生相互作用，引起一系列后續(xù)的信號傳遞，從而使得不同抗原特異性的t細胞對其靶細胞發(fā)揮免疫效應。

2、natural?killer?t(nkt)細胞，又稱自然殺傷t細胞，是一類介于先天性免疫和獲得性免疫的特殊淋巴細胞，被認為是第四類淋巴細胞[natrev?immunol?.,2010；10:272-277]。nkt細胞是既表達tcr，又表達nk細胞受體，根據目前接受的系統(tǒng)命名法nkt細胞主要分為3種類型，i型、ii型及、iii型;?其中i型nkt又稱為恒定nkt（invariant?nkt,簡稱inkt）,?inkt細胞的特點之一是，可以識別α-半乳糖神經酰胺(αgalcer)；另外一個特點是inkt?tcr的alpha?鏈的可變區(qū)為v24a-jα18恒定氨基酸序列；第三個特點是和mhc限制性t細胞的tcr相比，inkt?tcr的beta鏈多樣性非常低，因而inkt的tcr總體的多樣性很低，適合作為同種異體免疫細胞治療。因而在本發(fā)明探究了開發(fā)tcrnkt通用型細胞治療腫瘤，發(fā)現(xiàn)tcr?nkt具有顯著抗腫瘤效果。并且與tcr?nkt相比，cd8αcd8α-tcr?nkt及cd8αcd8β-tcrnkt殺傷及擴增功能更優(yōu)。

3、本發(fā)明專利通過添加cd8α和cd8β元件與靶向mage-a4的tcr進行組合轉入免疫細胞（t細胞及nkt細胞），與單純的tcr轉入免疫細胞相比，可以顯著增強免疫細胞擴增及其對腫瘤的殺傷功能。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明公開了一種t細胞受體，所述t細胞受體包含tcrα結構域，tcrβ結構域，cd8α結構域和/或cd8β結構域，以及連接所述結構域的接頭結構域，所述cd8α結構域的序列與seq?id?no:20至少90%同一性，所述cd8β結構域的序列與seq?id?no:24至少90%同一性。

2、優(yōu)選的，所述t細胞受體是修飾的t細胞受體。

3、優(yōu)選的，所述t細胞受體是單鏈形式。

4、優(yōu)選的，所述t細胞受體的類型是tcrα-l-tcrβ，l是接頭結構域或接頭序列。

5、優(yōu)選的，所述t細胞受體包含tcrα結構域，tcrβ結構域，cd8α結構域和cd8α結構域，以及連接所述結構域的接頭結構域。

6、優(yōu)選的，所述t細胞受體依次包含tcrα結構域，tcrβ結構域，cd8α結構域和cd8α結構域，以及連接所述結構域的接頭結構域。

7、優(yōu)選的，所述t細胞受體包含tcrα結構域，tcrβ結構域，cd8α結構域和cd8β結構域，以及連接所述結構域的接頭結構域。

8、優(yōu)選的，所述t細胞受體依次包含tcrα結構域，tcrβ結構域，cd8α結構域和cd8β結構域，以及連接所述結構域的接頭結構域。

9、優(yōu)選的，所述tcrα結構域依次包含vα區(qū)、jα區(qū)以及mcα區(qū)，tcrβ結構域依次包含vβ區(qū)、dβ區(qū)、j?β區(qū)以及mcβ區(qū)。

10、優(yōu)選的，所述tcrα結構域依次由vα區(qū)、jα區(qū)以及mcα區(qū)組成，tcrβ結構域依次由vβ區(qū)、dβ區(qū)、j?β區(qū)以及mcβ區(qū)組成。

11、優(yōu)選的，所述vα區(qū)的序列如seq?id?no:2所示，jα區(qū)的序列如seq?id?no:4所示，mcα區(qū)的序列如seq?id?no:6所示。

12、優(yōu)選的，所述vβ區(qū)的序列如seq?id?no:10所示，dβ區(qū)的序列如seq?id?no:12所示，j?β區(qū)的序列如seq?id?no:14所示，mcβ區(qū)的序列如seq?id?no:16所示。

13、優(yōu)選的，所述cd8α結構域的序列如seq?id?no:20所示，所述cd8β結構域的序列如seq?id?no:24所示。

14、優(yōu)選的，所述接頭結構域選自如seq?id?no:8、seq?id?no:18或seq?id?no:22所示的序列。

15、優(yōu)選的，所述tcrα結構域和tcrβ結構域之間的接頭結構域序列如seq?id?no:8所示。

16、優(yōu)選的，所述tcrβ結構域和cd8α結構域之間的接頭結構域序列如seq?id?no:18所示。

17、優(yōu)選的，所述cd8α結構域和cd8α結構域之間的接頭結構域序列如seq?id?no:22所示。

18、優(yōu)選的，所述cd8α結構域和cd8β結構域之間的接頭結構域序列如seq?id?no:22所示。

19、優(yōu)選的，所述tcrα結構域中包含的cdr1、cdr2和cdr3的核苷酸序列分別為acctccgagaacaactactac（seq?id?no:25）、aggaggcctacaagcaacagaac（seq?id?no:26）、gccacccacagcggcgccggcagctaccagctgacc（seq?id?no:27）；

20、其中，所述tcrβ結構域中包含的cdr1、cdr2和cdr3的核苷酸序列分別為agcgagcacaatcgg（seq?id?no:31）、ttccagaatgaagcccag（seq?id?no:32）、gccagctctgctcctggctataacgagcagttt（seq?id?no:33）。

21、優(yōu)選的，所述tcrα結構域中包含的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別為tsennyy（seq?id?no:28）、qeaykqqn（seq?id?no:29）、athsgagsyqlt（seq?id?no:30）；其中，所述tcrβ結構域中包含的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別為sehnr（seq?id?no:34）、fqneaq（seq?id?no:35）、assapgyneqf（seqid?no:36）。

22、本發(fā)明公開了一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼所述的t細胞受體。

23、優(yōu)選的，其中編碼cd8α結構域的核苷酸序列與seq?id?no:19至少85%同一性。

24、優(yōu)選的，其中編碼cd8β結構域的核苷酸序列與seq?id?no:23至少85%同一性。

25、優(yōu)選的，其中編碼cd8α結構域的核苷酸序列如seq?id?no:19所示。

26、優(yōu)選的，其中編碼cd8β結構域的核苷酸序列如seq?id?no:23所示。

27、優(yōu)選的，其中vα區(qū)包含如seq?id?no:1所示的核苷酸序列，jα區(qū)包含如seq?id?no:3所示的核苷酸序列，mcα區(qū)包含如seq?id?no:5所示的核苷酸序列。

28、優(yōu)選的，其中編碼tcr?vα區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:1所示，編碼tcr?jα區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:3所示，編碼mcα區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:5所示。

29、優(yōu)選的，其中vβ區(qū)包含如seq?id?no:9所示的核苷酸序列，dβ區(qū)包含如seq?id?no:11所示的核苷酸序列，j?β區(qū)包含如seq?id?no:13所示的核苷酸序列，mcβ區(qū)包含如seq?idno:15所示的核苷酸序列。

30、優(yōu)選的，其中編碼vβ區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:9所示，編碼dβ區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:11所示，編碼j?β區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:13所示，編碼mcβ區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:15所示。

31、本發(fā)明公開了載體，所述載體包含所述的多核苷酸。

32、優(yōu)選的，所述載體為病毒載體或同源重組修復街道基因敲入載體。

33、優(yōu)選的，所述載體選自質粒、逆轉錄病毒載體和慢病毒載體、轉座子載體、ssdna、dsdna等。

34、優(yōu)選的，所述載體為逆轉錄病毒載體或慢病毒載體。

35、優(yōu)選的，所述載體為長單鏈dna（ssdna），雙鏈dna（dsdna）,微型環(huán)狀dna（circledsdna）。

36、本發(fā)明公開了細胞，所述細胞包括所述的載體。

37、本發(fā)明公開了細胞，所述細胞提呈所述的t細胞受體。

38、本發(fā)明公開了細胞，所述細胞包含所述的t細胞受體。

39、優(yōu)選的，所述細胞是分離的細胞或天然存在的細胞。

40、優(yōu)選的，所述細胞選自淋巴細胞。

41、優(yōu)選的，所述淋巴細胞為免疫效應細胞，范圍不限于ipsc來源細胞。

42、優(yōu)選的，包括但不限于細胞毒性t淋巴細胞(ctl)、cd8+t細胞、cd4+t細胞、自然殺傷(nk)細胞、自然殺傷t(nkt)細胞、γ/δ-t細胞。

43、優(yōu)選的，所述t細胞受體還包括至少一種分子標記。

44、本發(fā)明公開了所述的t細胞受體的方法，所述方法包括：

45、1）孵育所述的細胞；

46、2）純化所述t細胞受體。

47、本發(fā)明公開了t細胞受體，所述t細胞受體采用所述的方法制備獲得。

48、本發(fā)明公開了組合物，所述組合物包括如下的一種或幾種：

49、1）根據所述的t細胞受體；

50、2）根據所述的多核苷酸；

51、3）根據所述的載體；

52、4）根據所述的細胞。

53、優(yōu)選的，所述組合物還包括藥學上可接受的載體或賦形劑。

54、優(yōu)選的，所述組合物是藥物。

55、本發(fā)明公開了試劑盒，所述試劑盒包括如下的一種或幾種：

56、1）根據所述的t細胞受體；

57、2）根據所述的多核苷酸；

58、3）根據所述的載體；

59、4）根據所述的細胞。

60、本發(fā)明公開了所述的t細胞受體、所述的多核苷酸、所述的載體或所述的細胞在制備治療癌癥的組合物中的用途。

61、優(yōu)選的，所述癌癥是腫瘤。

62、優(yōu)選的，所述癌癥是mage-4陽性的。

63、優(yōu)選的，所述癌癥選自黑色素瘤、肺癌、胃癌、食管癌、人腦多形性膠質母細胞瘤。

64、本發(fā)明公開了cd8α和cd8β在制備提高t細胞殺傷力的組合物中的用途，cd8α和cd8β被構建到t細胞受體中或cd8α和cd8β與t細胞受體在t細胞中共表達，所述cd8α結構域的序列與seq?id?no:20至少90%同一性，所述cd8β結構域的序列與seq?id?no:24至少90%同一性。

65、優(yōu)選的，所述“cd8α和cd8β”選自“cd8α和cd8α”的組合或“cd8α和cd8β”的組合。

66、優(yōu)選的，所述cd8α和cd8β被構建到t細胞受體中，所述t細胞受體包含tcrα結構域，tcrβ結構域，cd8α結構域和/或cd8β結構域，以及連接所述結構域的接頭結構域，

67、優(yōu)選的，所述t細胞受體依次包含tcrα結構域，tcrβ結構域，cd8α結構域和cd8α結構域，以及連接所述結構域的接頭結構域。

68、優(yōu)選的，所述t細胞受體包含tcrα結構域，tcrβ結構域，cd8α結構域和cd8β結構域，以及連接所述結構域的接頭結構域。

69、本發(fā)明通過將cd8α和cd8β與tcr共表達，制備了修飾的tcr，通過制備tcr分子克隆的慢病毒載體，并轉導nkt細胞制備成tcr-nkt細胞。然后，通過cd107a?脫顆粒實驗（cd107adegranulation?assay）和體外殺傷實驗（in?vitro?cytotoxicity?assay）進行tcr-nkt細胞對腫瘤殺傷效果的評價。結果表明：轉入tcr的nkt細胞有顯著殺傷腫瘤效果；其中cd8αβ-tcr?nkt、cd8αα-tcr?nkt細胞被雙陽性靶細胞（hla-a02:01+mage-a4+）刺激后cd107a+比例顯著高于tcr?nkt細胞；cd8αβ-tcr?nkt、cd8αα-tcr?nkt細胞擴增能力及對靶細胞的殺傷能力強于tcrnkt細胞。帶有cd8αα或cd8αβ的tcr?nkt細胞比tcr?nkt細胞在經靶細胞刺激后能更好的維持對靶細胞的殺傷能力。

70、因此，共表達cd8αβ或cd8αα的tcr?nkt可被認為具有更強的長期增殖并清除腫瘤細胞的潛能。