本發(fā)明涉及生物，針對人滋養(yǎng)細胞表面抗原2(trop2)開發(fā)近紅外二區(qū)(nir-ii)熒光分子探針并引導(dǎo)保乳術(shù)切緣評估，具體涉及一種靶向trop2的nir-ii的熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、乳腺癌對女性健康構(gòu)成威脅。長達20年的研究證實，保乳手術(shù)(bcs)與乳房切除術(shù)在患者長期生存率上并無顯著差異，因而bcs已成為早期乳腺癌患者的首選治療方式。bcs的顯著優(yōu)勢在于其能在保留乳房外觀的同時，提高患者術(shù)后的生活質(zhì)量。然而，手術(shù)中的切緣狀態(tài)與術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險緊密相連，而當前的輔助放療和系統(tǒng)治療在降低切緣陽性患者復(fù)發(fā)風(fēng)險方面效果有限。目前，外科醫(yī)生主要依賴傳統(tǒng)的“眼看手觸”來評估切緣，但這可能導(dǎo)致高達15％至50％的切緣陽性率，給患者帶來嚴重的身心和經(jīng)濟壓力。

2、為了優(yōu)化手術(shù)決策，盡管已有包括冰凍切片和印跡細胞學(xué)在內(nèi)的多種切緣評估方法，但這些方法仍存在操作復(fù)雜、耗時較長等局限性。同時，盡管乳腺x線攝影和磁共振成像等技術(shù)在診斷上頗具價值，但由于手術(shù)室中配置相關(guān)設(shè)備的限制，其術(shù)中應(yīng)用受到制約。因此，開發(fā)一種實時、高效且精確的切緣評估方法顯得尤為迫切。

3、熒光分子成像技術(shù)，憑借其高靈敏度和實時成像的特點，已成為非侵入性可視化生物進程的新興技術(shù)。與傳統(tǒng)成像相比，它在細胞和分子層面提供了更為詳盡的微觀信息，且具有更高的時空分辨率，同時避免了電離輻射的暴露。特別是fda批準的吲哚菁綠(icg)，已在肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤的手術(shù)指導(dǎo)中展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用價值。然而，近紅外一區(qū)(nir-i)熒光成像技術(shù)仍受限于穿透深度和成像對比度。最新研究揭示，第二近紅外區(qū)(nir-ii，1000-1700nm)的熒光成像技術(shù)能顯著提升組織穿透深度、對比度和分辨率，為切緣評估帶來了新希望。

4、在尋找更為精準的術(shù)中導(dǎo)航手段時，我們發(fā)現(xiàn)her2受體、vegf-a等腫瘤標志物作為靶點頗具潛力。然而，這些標志物的表達在乳腺癌中并不普遍。值得關(guān)注的是，人類滋養(yǎng)層細胞表面抗原2(trop2)在乳腺癌組織中普遍高表達，而在正常組織中低表達或不表達，且fda已批準其作為轉(zhuǎn)移性三陰性和hr+/her2-乳腺癌患者的臨床治療藥物。因此，trop2有望成為熒光成像引導(dǎo)乳腺癌術(shù)中切緣評估的有效靶點。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于合成具有優(yōu)異trop2靶向能力和生物相容性的nir-ii熒光探針，并作為特異性識別乳腺癌的靶向探針，準確區(qū)分腫瘤及正常組織、有效判斷切緣狀態(tài)，降低保乳手術(shù)切緣陽性率，進而降低患者二次手術(shù)率及術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險。

2、為實現(xiàn)上述目的，且考慮到小分子抑制劑和抗體在靶向性和分布特性上的不足，本發(fā)明采用了具有適中尺寸和高度親和力的環(huán)肽作為靶向元件，通過nhs酯反應(yīng)，成功合成了基于trop2靶向環(huán)肽和icg-nhs的nir-ii熒光分子探針ttp-icg，用于區(qū)分腫瘤與正常組織、指導(dǎo)乳腺癌精確切除，還通過離體標本實驗進一步證實了其區(qū)分良惡性腫瘤組織的能力，這一突破性的研究為乳腺癌手術(shù)中的切緣評估提供了新的、高效的解決方案。

3、具體技術(shù)方案如下：

4、一種靶向trop2的nir-ii熒光探針,所述探針為ttp-icg，其通過具有高trop2親和力的環(huán)肽ttp和icg-nhs經(jīng)nhs酯反應(yīng)偶聯(lián)所得。

5、進一步地，ttp-icg靶向在乳腺癌組織中高表達的trop2。

6、一種靶向trop2的nir-ii熒光探針的制備方法，該方法包括以下步驟：

7、s1、icg-nhs(10μmol)和ttp(8μmol)溶于2ml二甲基甲酰胺(dmf)中；

8、s2、用n,n-二異丙基乙胺(diea)調(diào)節(jié)ph至7.5-8.5；

9、s3、室溫攪拌2h后，用高效液相色譜法(hplc)純化目標產(chǎn)物ttp-icg，流動相為溶劑a-水(含0.1％三氟乙酸)及溶劑b-乙腈(含0.1％三氟乙酸)，梯度范圍為30-65％，梯度時間15min，流速1.0ml/min，產(chǎn)物收集時間為11min；

10、s4、收集產(chǎn)物凍干后，于-20℃保存。

11、一種靶向trop2的nir-ii熒光探針在外科導(dǎo)航中的應(yīng)用。

12、進一步地，所述探針ttp-icg能夠作為nir-ii熒光成像的熒光指示劑用于區(qū)分正常乳腺組織及腫瘤組織。

13、進一步地，所述探針ttp-icg能夠作為nir-ii熒光成像的熒光指示劑用于識別微小腫瘤組織。

14、進一步地，所述探針ttp-icg能夠作為nir-ii熒光成像的熒光指示劑用于描繪腫瘤輪廓引導(dǎo)腫瘤切除。

15、本發(fā)明與背景技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點：

16、(1)本發(fā)明提供了一種基于fda批準的icg的nir-ii熒光探針ttp，相較于nir-i和可見光區(qū)，nir-ii熒光成像具有更低的光散射、光子吸收和組織自熒光，從而極大地提高了熒光穿透深度和對比度，同時icg為fda批準用于人體的熒光染料，較于其它的nir-ii熒光團如稀土納米探針、量子點等具有更優(yōu)異的生物相容性，更快的體內(nèi)代謝，更具有臨床轉(zhuǎn)化前景；

17、(2)本發(fā)明提供了一種靶向trop2的熒光分子探針，其可通過靶向乳腺癌普遍高表達的trop2，在腫瘤部位特異性主動聚集，較于單純的熒光染料如icg的被動聚集，具有更優(yōu)異的腫瘤成像信噪比，較于her2及分泌型蛋白vegf-a等靶點，其具有更廣譜的應(yīng)用前景及靶向穩(wěn)定性，更有利于術(shù)中切緣的評估；

18、(3)選擇靶向環(huán)肽作為靶向元件，其較于小分子抑制劑具有更高的親和力，較于抗體具有更低的免疫原性和組織滲透能力，此外環(huán)化結(jié)構(gòu)的剛性構(gòu)象具有更高的受體親和力和穩(wěn)定性，因此在具有優(yōu)異生物相容性的同時，可展現(xiàn)出優(yōu)異的靶向能力；

19、(4)通過低表達與高表達trop2腫瘤細胞系的混合體系進行探針靶向性評估，其結(jié)果更直觀、更具可信度；同時，從mmtv-pyvt轉(zhuǎn)基因小鼠模型、多發(fā)微小腫瘤模型到肌肉浸潤模型，分別評估探針區(qū)分正常組織與惡性組織、識別微小衛(wèi)星灶及評估腫瘤切緣的能力，進而從動物標本到人體標本驗證探針臨床轉(zhuǎn)化的潛能，利用多尺度、多角度的反復(fù)驗證模式及從在體到離體，宏觀到微觀的可行性驗證模式，其結(jié)果亦更具信服力，更有利于加快推進trop2特異靶向分子探針的臨床轉(zhuǎn)化進程；

20、(5)ttp-icg具有可忽略的較低細胞毒性。

技術(shù)特征：

1.一種靶向trop2的nir-ii熒光探針，其特征在于,所述探針為ttp-icg，其通過具有高trop2親和力的環(huán)肽ttp和icg-nhs經(jīng)nhs酯反應(yīng)偶聯(lián)所得。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種靶向trop2的nir-ii熒光探針，其特征在于，ttp-icg靶向在乳腺癌組織中高表達的trop2。

3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種靶向trop2的nir-ii熒光探針的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

4.一種根據(jù)權(quán)利要求1-2任意一項所述的一種靶向trop2的nir-ii熒光探針在外科導(dǎo)航中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述探針ttp-icg能夠作為nir-ii熒光成像的熒光指示劑用于區(qū)分正常乳腺組織及腫瘤組織。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述探針ttp-icg能夠作為nir-ii熒光成像的熒光指示劑用于識別微小腫瘤組織。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述探針ttp-icg能夠作為nir-ii熒光成像的熒光指示劑用于描繪腫瘤輪廓引導(dǎo)腫瘤切除。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種靶向Trop2的NIR?II的熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，所述探針為TTP?ICG，其通過具有高Trop2親和力的環(huán)肽TTP和ICG?NHS經(jīng)NHS酯反應(yīng)偶聯(lián)所得，該探針生物安全性好，在體成像效果優(yōu)異，不僅能夠在動物模型中在體評估腫瘤切緣狀態(tài)，還能夠通過離體組織浸泡孵育的方法區(qū)分腫瘤和正常組織，對引導(dǎo)保乳術(shù)手術(shù)切緣評估具有顯著效果，對減少切緣陽性率及二次手術(shù)率進而改善患者預(yù)后和生活質(zhì)量具有重要臨床意義。

技術(shù)研發(fā)人員：張國君,樓康良,白靜雯,吳川六,林琳玲,劉洪潭,高藝洋
受保護的技術(shù)使用者：云南省腫瘤醫(yī)院（昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10