本發(fā)明屬于生物分子，涉及的技術(shù)有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechain?reaction，pcr)和擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)pcr(amplification?refractory?mutationsystem?pcr，arms-pcr)，通過設(shè)計(jì)光控引物實(shí)現(xiàn)光啟動核酸擴(kuò)增檢測，屬于生物分子。

背景技術(shù)：

1、瘧疾(malaria)是一種通過雌性按蚊叮咬傳播給人類的疾病，可危及生命。瘧疾分為惡性瘧原蟲(p.falciparum)，間日瘧原蟲(p.vivax)，三日瘧原蟲(p.malariae)，卵形瘧原蟲(p.ovale)和諾氏瘧原蟲(p.knowlesi)，其中惡性瘧原蟲是最致命的瘧疾寄生蟲，若不及時(shí)治療，惡性瘧原蟲瘧疾可在24小時(shí)內(nèi)發(fā)展成嚴(yán)重疾病，甚至死亡。根據(jù)最新《世界瘧疾報(bào)告》，在2022年一整年中，共發(fā)生2.49億例瘧疾病例，死亡人數(shù)估計(jì)為608000人。瘧疾的早期檢測能夠做到早發(fā)現(xiàn)，早治療，早控制，對于瘧疾的防治有著重大意義。

2、目前瘧疾的常用檢測方法病原學(xué)診斷方法、血清學(xué)診斷方法和分子學(xué)生物學(xué)診斷方法。這些方法均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。厚薄血涂片是確診瘧疾的金標(biāo)準(zhǔn)，也是唯一可查到原蟲實(shí)體并鑒別蟲種的方法，但其操作繁瑣，且需要自己取血涂片送至醫(yī)院進(jìn)行檢查，不利于瘧疾的快速檢測治療。血清學(xué)診斷方法是基于某些瘧原蟲特異性抗原或酶來進(jìn)行檢測，這兩種方法靈敏度較低，無法檢測低寄生蟲血癥的瘧疾患者。而聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)以其高度的靈敏度和特異性成為了瘧原蟲檢測的一大方法，對于低寄生蟲血癥的瘧疾患者也能準(zhǔn)確檢出，大大縮短檢測時(shí)間，及時(shí)治療確診患者。

3、由于非特異性擴(kuò)增對于結(jié)果準(zhǔn)確度影響較大，熱啟動pcr技術(shù)從而被發(fā)明來降低酶活性，直到高溫啟動后聚合酶恢復(fù)活性。而目前的熱啟動pcr技術(shù)是使用小分子、特異性抗體或核酸適配體來封閉耐高溫聚合酶的活性，在高溫條件下，其能解離釋放聚合酶，使其恢復(fù)正常的聚合活性。但是這種熱啟動技術(shù)需要從文庫中去篩選，使得這種技術(shù)的開發(fā)成本較高，復(fù)雜耗時(shí)，只適用于有90℃以上的擴(kuò)增方法。而光控啟動則是一種高效的控制方式，不需要高溫，只需要簡單的光照，就可以在幾十秒內(nèi)恢復(fù)聚合酶的活性，適用于所有聚合酶，在核酸擴(kuò)增領(lǐng)域有著更廣的應(yīng)用范圍。目前大多數(shù)光控啟動擴(kuò)增的方式是對酶進(jìn)行修飾，但聚合酶是核酸擴(kuò)增的關(guān)鍵，對聚合酶進(jìn)行修飾改造有可能會對酶的活性產(chǎn)生影響。此外，針對于不同的聚合酶則需要開發(fā)不同的修飾改造方式，因此不是一種通用的控制方法。然而，使用化學(xué)修飾的引物去封閉聚合酶活性，則對酶沒有任何結(jié)構(gòu)上的影響，最大程度保留了酶的完整性。而引物是絕大多數(shù)核酸擴(kuò)增所必需的，化學(xué)修飾對于引物是通用的，這種方式不僅成本較低，耗時(shí)較短，還可以適用于任何基于引物的核酸擴(kuò)增方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

4、該項(xiàng)目建立了一個(gè)簡單、快速的光啟動核酸擴(kuò)增方法實(shí)現(xiàn)了對pcr的光啟動擴(kuò)增，為瘧疾的快速檢測提供了新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種光啟動核酸擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)方法，將其與pcr方法聯(lián)合起來，發(fā)明了一種新的核酸檢測方法，命名為光啟動pcr。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、首先通過ncbi查找靶標(biāo)的保守序列，從而設(shè)計(jì)出在富含胸腺嘧啶的正常引物，根據(jù)arms-pcr在引物的胸腺嘧啶設(shè)計(jì)錯(cuò)配堿基(腺嘌呤)，再通過錯(cuò)配對于聚合酶聚合活性的抑制篩選出最低錯(cuò)配個(gè)數(shù)的引物，在錯(cuò)配的胸腺嘧啶位點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)基團(tuán)修飾。當(dāng)沒有光照時(shí)，修飾過的光控引物完全抑制聚合酶延伸反應(yīng)，而存在光照時(shí)，化學(xué)基團(tuán)解離恢復(fù)成正常引物，可以進(jìn)行延伸擴(kuò)增。

4、作為優(yōu)選地，該方法具體包括如下步驟：

5、(1)質(zhì)粒的培養(yǎng)與提取

6、在lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)top10細(xì)胞使其復(fù)制大量的攜帶惡性瘧原蟲保守序列的質(zhì)粒(puc57)。用試劑盒tianpure?midi?plasmid?kit提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒作為后續(xù)擴(kuò)增的模板。

7、(2)錯(cuò)配引物的設(shè)計(jì)

8、根據(jù)惡性瘧原蟲emp1保守基因選取79-1941bp的序列設(shè)計(jì)引物，長度1-60bp，使得反向引物具有1-60個(gè)胸腺嘧啶。再根據(jù)amrs-pcr對胸腺嘧啶位點(diǎn)設(shè)計(jì)錯(cuò)配，作為錯(cuò)配引物。

9、(3)重組酶聚合酶擴(kuò)增(rpa)

10、根據(jù)rpa反應(yīng)的說明書加入正常的正向引物和錯(cuò)配的反向錯(cuò)配引物、rpa反應(yīng)液、模板、醋酸鎂，然后將反應(yīng)管放在abiq3熒光儀中，1-60℃反應(yīng)1-180min，實(shí)時(shí)記錄熒光。根據(jù)最低的熒光強(qiáng)度組，篩選出完全抑制聚合酶擴(kuò)增的錯(cuò)配引物。

11、(4)光啟動引物的設(shè)計(jì)

12、根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)篩選的能夠完全抑制聚合酶擴(kuò)增的錯(cuò)配引物，在錯(cuò)配引物相應(yīng)錯(cuò)配位點(diǎn)的胸腺嘧啶上修飾光敏基團(tuán)，作為光啟動引物。

13、(5)光啟動聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

14、根據(jù)pcr的說明書，在反應(yīng)館中加入pcr反應(yīng)混合液、正常的正向引物、反向光啟動引物、模板，混勻后進(jìn)行光照。然后將反應(yīng)液放入abiq3熒光儀中，pcr的反應(yīng)條件為95℃，30s；95℃，5s，50-70℃，30s，35個(gè)循環(huán)，在延伸階段記錄熒光。

15、作為優(yōu)選地，步驟(2)中，反向引物含有1-60個(gè)胸腺嘧啶(t)。

16、作為優(yōu)選地，步驟(2)中，反向錯(cuò)配引物根據(jù)amrs-pcr將正常反向引物的胸腺嘧啶替換成其他堿基，與模板形成錯(cuò)配。

17、作為優(yōu)選地，步驟(3)中，rpa擴(kuò)增條件為1-100℃，反應(yīng)1-180min。

18、作為優(yōu)選地，步驟(4)中，引物在錯(cuò)配的堿基位點(diǎn)引入光敏分子(如香豆素、鄰硝基芐基等)修飾的胸腺嘧啶。

19、作為優(yōu)選地，步驟(5)中，光源功率采用1-200w，光照時(shí)間是采用光進(jìn)行照射0-20min。

20、作為優(yōu)選地，步驟(5)中，步驟(5)中，引物的濃度為200nm，pcr的反應(yīng)條件為95℃，30s；95℃，5s，60-65℃，30s，35個(gè)循環(huán)。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

22、1.本發(fā)明提供了一種光控聚合酶聚合活性的光控引物設(shè)計(jì)方法，能夠在時(shí)空上進(jìn)行聚合酶聚合活性的調(diào)控；

23、2.本發(fā)明的通用性強(qiáng)、普及性高，不僅適用于pcr，且適用于其他所有以聚合酶和引物為基礎(chǔ)的核酸擴(kuò)增方法。

技術(shù)特征：

1.一種光啟動核酸擴(kuò)增的引物，其特征包括在核酸擴(kuò)增中使用光控引物，該引物使用化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行修飾。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：包括如下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(2)中，反向引物含有1-60個(gè)胸腺嘧啶(t)。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(2)中，反向錯(cuò)配引物根據(jù)amrs-pcr將正常反向引物的胸腺嘧啶替換成其他堿基，與模板形成錯(cuò)配。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(3)中，rpa擴(kuò)增條件為1-100℃，反應(yīng)1-180min。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(4)中，引物在錯(cuò)配的堿基位點(diǎn)引入光敏分子(如香豆素、鄰硝基芐基等)修飾的胸腺嘧啶。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(5)中，光源功率采用1-200w，光照時(shí)間是采用光進(jìn)行照射0-20min。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：步驟(5)中，引物的濃度為200nm，pcr的反應(yīng)條件為95℃，30s；95℃，5s，60-65℃，30s，35個(gè)循環(huán)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種使用光啟動核酸擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)方法，屬于生物分子技術(shù)領(lǐng)域。光控引物設(shè)計(jì)包括如下步驟：根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)胸腺堿基含量多的引物；并使用AMRS?PCR對引物的胸腺堿基設(shè)計(jì)不同的錯(cuò)配；根據(jù)錯(cuò)配位置對引物進(jìn)行化學(xué)基團(tuán)修飾，建立光控核酸擴(kuò)增體系，特異性好，檢測速度快，可以使用光控制核酸擴(kuò)增，通用性高、應(yīng)用前景大。

技術(shù)研發(fā)人員：于超,秦瑜繁,卿敏,劉小瓊,陳欣
受保護(hù)的技術(shù)使用者：重慶醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10