本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種短鏈脫氫酶突變體及其在不對稱合成替格瑞洛關(guān)鍵手性中間體((s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(ⅱ))中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

0、技術(shù)背景

1、替格瑞洛是由阿斯利康公司(astrazeneca)開發(fā)的一款新型血小板聚集抑制劑，能夠可逆地與p2y12adp受體相互作用，從而阻斷adp誘導的血小板聚集，具有快速起效和抵消作用，被用于治療或預防acs(不穩(wěn)定性心絞痛、非st段抬高心肌梗死或st段抬高心肌梗死)及其他血小板聚集相關(guān)疾病，其結(jié)構(gòu)如下：

2、

3、(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(ⅱ)是替格瑞洛合成過程中的重要手性中間體，其傳統(tǒng)化學方法利用價格昂貴的三甲氧基硼烷和硼烷二甲硫醚共同作為手性還原劑，不僅十分危險而且容易造成環(huán)境污染(cn?107892693?a、cn?108083997a、cn?107641072a、cn?104974017a、w02008018822、w02008018823)。與化學路線相比，利用酮還原酶催化前體酮不對稱合成化合物(ⅱ)具有反應(yīng)條件溫和、立體選擇性好以及環(huán)境友好等特點。目前已有許多來源的酮還原酶被用來不對稱合成化合物(ⅱ)，如leifsonia?sp.strain?s749(org.process?res.dev.,2017,21(10):1595-1601),levilactobacillus?suantsaii(biotechnol.bioeng.,2024.),lactobacillus?kefiri(chem.-eur.j.2023,29(25):e202203530.)等。盡管部分酮還原酶催化活性良好，但它們大多為nadph依賴通過還原酶，而輔酶nadph較nadh價格昂貴，因此，為了進一步降低生產(chǎn)成本，提供一種新的酶法合成路線。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于提供一種短鏈脫氫酶突變體及其在不對稱合成替格瑞洛關(guān)鍵手性中間體((s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(ⅱ))中的應(yīng)用。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為

3、一種短鏈脫氫酶突變體，短鏈脫氫酶sssdr1為seq?id?no.1所示氨基酸序列或至少與seq?id?no.1所示氨基酸序列80％同源一致性的氨基酸序列中至少一個位點突變所得；其中，位點為94，144，145，153，188，205中一個或多個。

4、所述突變體中94，144，145，153，188，205位點可相同或不同的對應(yīng)突變?yōu)閍、v、l、i。

5、所述突變體為短鏈脫氫酶sssdr1中94位點，144位點，145位點，153位點，188位點，205位點中1-4個位點進行突變。

6、所述第94位突變?yōu)閍，第144位突變?yōu)閍，第145位突變?yōu)閍或l，第153位突變?yōu)閘或i，第188位突變?yōu)閍，第205位突變?yōu)閍。

7、上述短鏈脫氫酶sssdr1來源于鞘氨醇桿菌屬(sphingobacterium?siyangensesy1)。

8、一種dna分子，編碼所述的短鏈脫氫酶突變體。

9、一種重組質(zhì)粒，含有所述的dna分子。

10、一種所述的應(yīng)用，所述突變體、所述dna分子、所述重組質(zhì)粒在合成替格瑞洛關(guān)鍵手性中間體中的應(yīng)用。

11、一種合成替格瑞洛關(guān)鍵手性中間體的催化劑，催化劑為所述突變體、所述dna分子或所述重組質(zhì)粒。

12、所述生物催化劑為細胞、粗酶粉、酶溶液、固定化酶的形式。

13、進一步的說，以2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮(ⅰ)作為底物，不對稱合成(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(ⅱ)，反應(yīng)式為：

14、

15、一種合成替格瑞洛關(guān)鍵手性中間體的方法，以2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮(ⅰ)作為底物，在所述突變體、所述dna分子或所述重組質(zhì)粒存在下不對稱合成(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(ⅱ)；反應(yīng)體系中底物濃度為0.1-1200g/l，催化劑添加量為10-200g/l。

16、反應(yīng)的合成路線為：

17、

18、進一步地，采用短鏈脫氫酶突變體對化合物(ⅰ)進行不對稱還原生產(chǎn)手性化合物(ⅱ)的反應(yīng)體系中還包括輔因子、輔因子再生體系、助溶劑和緩沖液。

19、所述輔因子為nad(p)+、葡萄糖脫氫酶、甲酸脫氫酶中的一種幾種；優(yōu)選為nad(p)+。

20、輔因子再生體系為異丙醇、葡萄糖、甲酸根化合物中的一種幾種；優(yōu)選為異丙醇。

21、助溶劑選自異丙醇、甲醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、甲苯中的一種或幾種。

22、反應(yīng)體系中底物濃度為0.1-1200g/l，考慮到反應(yīng)效果，底物濃度優(yōu)選0.1-1000g/l。

23、反應(yīng)體系的ph值優(yōu)選能夠保持在短鏈脫氫酶可以表達其活性的ph范圍內(nèi)，反應(yīng)體系的ph值為7.0-9.0。

24、反應(yīng)體系溫度優(yōu)選能夠保持在短鏈脫氫酶可以表達其活性的溫度范圍內(nèi)，反應(yīng)體系的溫度為25-45℃。

25、輔因子其在反應(yīng)體系中的終濃度為0-0.5mm，優(yōu)選0.05-0.2mm。

26、輔因子再生體系其在反應(yīng)體系中的終濃度為0-0.5mm，優(yōu)選0.05-0.2mm。

27、在使用酶溶液的實施方案中，用于產(chǎn)生酶溶液的細胞可以是表達僅含有輔因子再生系統(tǒng)或含有輔因子再生系統(tǒng)和短鏈脫氫酶的酶。在使用全細胞的實施方案中，該細胞可以同時表達含有輔因子再生系統(tǒng)和短鏈脫氫酶的酶。

28、所述助溶劑濃度為反應(yīng)體系的0.1-90％。

29、所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液或tris-hcl緩沖液，緩沖液濃度為0.05-0.2m。

30、本發(fā)明的有益技術(shù)成果：

31、本發(fā)明對來源于鞘氨醇桿菌屬(sphingobacterium?siyangense?sy1)的短鏈脫氫酶基因sssdr1進行突變，在seq?id?no.1的野生型短鏈脫氫酶的基礎(chǔ)上，利用定點突變的分子生物學方法對其進行突變，得到的短鏈脫氫酶突變體對合成替格瑞洛重要前體酮化合物(ⅰ)的催化活性顯著提高，通過搭載nadh再生還原系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)替格瑞洛關(guān)鍵手性中間體(ⅱ)的高效不對稱合成，立體選擇性嚴格(ee>99.9％)，具有良好的工業(yè)應(yīng)用潛力。

技術(shù)特征：

1.一種短鏈脫氫酶突變體，其特征在于：短鏈脫氫酶sssdr1為seq?id?no.1所示氨基酸序列或至少與seq?id?no.1所示氨基酸序列80％同源一致性的氨基酸序列中至少一個位點突變所得；其中，位點為94，144，145，153，188，205中一個或多個。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于：所述突變體中94，144，145，153，188，205位點可相同或不同的對應(yīng)突變?yōu)閍、v、l、i。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的突變體，其特征在于：所述突變體為短鏈脫氫酶sssdr1中94位點，144位點，145位點，153位點，188位點，205位點中1-4個位點進行突變。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的突變體，其特征在于：所述第94位突變?yōu)閍，第144位突變?yōu)閍，第145位突變?yōu)閍或l，第153位突變?yōu)閘或i，第188位突變?yōu)閍，第205位突變?yōu)閍。

5.一種dna分子，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的短鏈脫氫酶突變體。

6.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，含有權(quán)利要求5所述的dna分子。

7.一種權(quán)利要求1、5或6所述的應(yīng)用，其特征在于：權(quán)利要求1所述突變體、權(quán)利要求5所述dna分子、權(quán)利要求6所述重組質(zhì)粒在合成替格瑞洛關(guān)鍵手性中間體中的應(yīng)用。

8.一種合成替格瑞洛關(guān)鍵手性中間體的催化劑，其特征在于：催化劑為權(quán)利要求1所述突變體、權(quán)利要求5所述dna分子或權(quán)利要求6所述重組質(zhì)粒。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的催化劑，其特征在于：所述生物催化劑為細胞、粗酶粉、酶溶液、固定化酶的形式。

10.一種合成替格瑞洛關(guān)鍵手性中間體的方法，其特征在于：以2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮(ⅰ)作為底物，在權(quán)利要求1所述突變體、權(quán)利要求5所述dna分子或權(quán)利要求6所述重組質(zhì)粒存在下不對稱合成(s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇(ⅱ)；反應(yīng)體系中底物濃度為0.1-1200g/l，催化劑添加量為10-200g/l。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種短鏈脫氫酶突變體及其在不對稱合成替格瑞洛關(guān)鍵手性中間體((S)?2?氯?1?(3,4?二氟苯基)乙醇(Ⅱ))中的應(yīng)用。短鏈脫氫酶SsSDR1為SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列或至少與SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列80％同源一致性的氨基酸序列中至少一個位點突變所得；其中，位點為94，144，145，153，188，205中一個或多個。本發(fā)明獲得的酮還原酶突變體對底物(Ⅰ)具有更高的催化活性以及嚴格的立體選擇性。本發(fā)明涉及的相關(guān)突變體具有催化活性高，立體選擇性嚴格，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)勢，對于替格瑞洛關(guān)鍵手性中間體(Ⅱ)的酶法不對稱合成具有應(yīng)用價值。

技術(shù)研發(fā)人員：游松,車昌麗,賈嫻,許欣,鄭芷然
受保護的技術(shù)使用者：沈陽藥科大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10