本發(fā)明屬于基因工程，涉及一種調(diào)控蘿卜花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子rsrap2-12，具體涉及rsrap2-12基因在調(diào)控蘿卜花青素合成中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、蘿卜(raphanus?sativus?l.)是十字花科蘿卜屬中重要根菜類蔬菜作物，而花青素賦予植物豐富的顏色和抗氧化活性，對人體健康有益。富含花青素的蘿卜品種因其顏色鮮艷、營養(yǎng)價值高而深受消費者歡迎。花青素是一種水溶性黃酮化合物，存在于植物各個部位，給植物帶來豐富的色彩(chaves-silva?et?al.,2018；alappat?andalappat,2020)，同時具有多種益處，如抗氧化、抗心血管疾病、抗癌癥、促進新陳代謝、保護視力、控制血糖、抗肥胖和炎癥、延緩衰老等，也被認為是對人體有益的天然保健成分(zhang?et?al.,2023；nomi?et?al.,2019)。目前自然界中已發(fā)現(xiàn)650多種花色苷，不同種類的花色苷所呈現(xiàn)的顏色也略有差異，其中三種花青素，分別是矢車菊素、天竺葵素和飛燕草素，是植物中最為重要的色素之一(naing?et?al.,2018)，天竺葵色素和其衍生物呈現(xiàn)紅色或橙色，而矢車菊色素及其衍生物主要表現(xiàn)為磚紅或洋紫色。另外，飛燕草色素及其衍生物呈現(xiàn)藍色或紫色(liu?et?al.,2018b；liu?et?al.,2018c)。此外，花青素參與許多生物過程，如植物的環(huán)境脅迫反應(yīng)，病原菌和昆蟲的脅迫反應(yīng)。

2、植物中花青素的生物合成是類黃酮合成通路中的一個重要分支，在高等植物中較為保守，其過程涉及多個復(fù)雜的酶促反應(yīng)。植物中的花青素生物合成受到各種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如myb、wd40、wrky、erf、bhlh、bbx和bzip家族成員(gonzalez?et?al.,2008；jaakolaet?al.,2010)。結(jié)構(gòu)基因的表達受轉(zhuǎn)錄因子和環(huán)境因子的共同控制，最重要的也是被研究最多三類轉(zhuǎn)錄因子家族分別是myb、bhlh和wd40，這些轉(zhuǎn)錄因子可以單獨調(diào)控結(jié)構(gòu)基因或者相互結(jié)合組成mbw復(fù)合體共同調(diào)控結(jié)構(gòu)基因，從而調(diào)控花青素生物合成(hichri?et?al.,2011；宋建輝等，2021；petroni?et?al.,2011；xu?et?al.,2015)。

3、在擬南芥中rap2-12是一個乙烯應(yīng)答因子型轉(zhuǎn)錄因子，編碼erf/ap2轉(zhuǎn)錄因子家族(rap2.12)的erf(乙烯反應(yīng)因子)亞家族b-2的成員。該蛋白質(zhì)包含一個ap2結(jié)構(gòu)域。轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的表達來影響花青素的生物合成(d'amelia?et?al.,2014；劉等人，2016)。近年來，有研究顯示了rap2家族基因在花青素合成中的調(diào)控作用，在海棠葉片和蘋果果實中瞬時過表達rap2-4會增加葉片和果實中花青素的含量(li?et?al.,2020)。rap2-7和rap2-7是乙烯反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子受mir172b的調(diào)控從而調(diào)節(jié)花青素的生物合成(hinzetal.,2010)。rap2.10(與ap2.10相關(guān)；tr18328|c0_g1)和bbx28(tr1858|c0_g1)與ans、chi、f3h和f3′h的表達高度相關(guān)，表明rap2.10可能是參與甜櫻桃花青素生物合成的候選轉(zhuǎn)錄因子(guo?et?al.,2020)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明意在提供一種rsrap2-12基因在調(diào)控蘿卜花青素合成中的應(yīng)用，以加快蘿卜的育種進程，快速培育高含量花青素的蘿卜品種，為選育高含量花青素的蘿卜新品種以及改良蘿卜品質(zhì)提供有利的技術(shù)。

2、本發(fā)明提供了一種調(diào)控蘿卜花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子rsrap2-12基因，，所述rsrap2-12基因的核苷酸序列如seq?id?no.1。

3、本發(fā)明還提供了上述rsrap2-12基因的編碼蛋白，所述編碼蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2。

4、本發(fā)明還提供了一種擴增上述rsrap2-12基因的引物對，包括核苷酸序列如seqid?no.3所示的正向引物和核苷酸序列如seq?id?no.4所示反向引物。

5、本發(fā)明還提供了上述rsrap2-12基因或上述rsrap2-12基因的編碼蛋白在調(diào)控蘿卜花青素合成的應(yīng)用。

6、本發(fā)明還提供了一種提高蘿卜葉片花青素含量的方法，所述方法為構(gòu)建過表達載體將rsrap2-12基因瞬時過表達在蘿卜葉片上。

7、進一步，所述方法包括如下步驟：

8、s11、通過pcr擴增rsrap2-12基因

9、所述擴增引物對為權(quán)利要求3所述的擴增引物對；

10、s12、構(gòu)建重組過表達載體

11、將步驟s11擴增的rsrap2-12基因采用同源重組的方式與植物過表達載體1008連接，將重組載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌gv3101，抗性篩選后獲得陽性菌株；

12、s13、轉(zhuǎn)化并篩選高含量花青素的蘿卜葉片

13、取步驟12獲得的陽性菌株配置浸染液，充分搖勻，采用分光光度計將od600值調(diào)至0.6～0.8，注射到蘿卜真葉中，28℃暗培養(yǎng)2天后，移至正常條件下培養(yǎng)，一周左右后觀察注射部位的表型，用于篩選蘿卜新品種。

14、進一步，在步驟s11中，所述pcr擴增程序：總體積為20μl，正向引物0.5μl，反向引物0.5μl，模板dna2μl，高保真酶mix?10μl，ddh2o?7μl；

15、所述pcr反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，60℃退火5s，72℃延伸10s，循環(huán)數(shù)35；72℃延伸2min；pcr擴增產(chǎn)物4℃保存；

16、進一步，在步驟s13中，所述侵染液包含5ml?mgcl2、5ml?mes和50ul?as，滅菌水定容至100ml。

17、本發(fā)明還提供了一種降低蘿卜肉質(zhì)花青素含量的方法，所述方法為構(gòu)建vigs沉默載體使rsrap2-12基因功能喪失。

18、進一步，所述方法包括如下步驟：

19、s21、構(gòu)建蘿卜的vigs載體

20、s22、將步驟s21構(gòu)建的vigs載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)dh5α用于擴繁，經(jīng)藍白斑篩選后搖菌，并采用質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，提取好的質(zhì)粒20℃保存；

21、s23、當(dāng)紅皮紅肉蘿卜根部膨大到直徑3cm左右開始注射第一次，將大提好的質(zhì)粒，放在室溫，融化備用，用1m無菌注射器吸取適量質(zhì)粒，注射至蘿卜肉質(zhì)根中部，每次注射多個部位，每隔一周侵染一次，侵染3次后一周切開蘿卜根部觀察表型。

22、以下為本發(fā)明方案涉及的序列：

23、rsrap2-12基因的編碼序列(seq?id?no.1)：

24、atgtgtggaggagctataatctccgatttcatcccgccgccgaggtctcgcc

25、gcgtcaccagcgagtttctctggccggatctgaagaagaagaagagctcgaggaaacgctcctcgagtttcttcgatcttgacgatgagttcgaggctgacttccagggcttcaacgacgattccttcatcgactgcgatgatgcgaaaccgttcgttttcgccggggctcgtaaaccccccgccgccactgccgccgattcagcttttggcaagaaagttgctgacggagaaggtgagagatctgcaaagaggaagaggaagagccagtaccgaggtataagacaacgtccttggggaaaatgggctgctgagattcgtgatccaagggaaggttcaagagtgtggcttggaactttcaaaactgccgaggaagctgcaagagcttacgatgctgcagctcgtagaatccgtggttccaaagctaaggtgaatttcccagaggagaacccacttgccaagaaggtggctaaaccgaacccaaacccaactctggttcagaacgtggacaactcctttgacaatatatgtttcatggaggagaaacaagaagttaacagcagcaacaacaacaacaatcaatttggtaatgggtatcatcagttattcagctcagaccagggtagtaactcatttggttgttctgagtttggttggaacgatcaagctcctataactcctgagatctcttcggcgtttatcaacaacaacaactctgctctattcgccgaggaagctgatccagctaagaagctcaagtccatggatttcgagacaccttacaacaacactgaatgggattcttcacttgatttcttcaacgaagacgccgtggcgactcaggacaatggtgcaaaccctatggaactatggagcattgatgagatcgattccatgattggaggagtcttctga

26、rsrap2-12基因的蛋白質(zhì)序列(seq?id?no.2)：

27、mcggaiisdfippprsrrvtseflwpdlkkkkssrkrsssffdlddefeadfqgfnddsfidcddakpfvfagarkppaataadsafgkkvadgegersakrkrksqyrgirqrpwgkwaaeirdpregsrvwlgtfktaeeaaraydaaarrirgskakvnfpeenplakkvakpnpnptlvqnvdnsfdnicfmeekqevnssnnnnnqfgngyhqlfssdqgsnsfgcsefgwndqapitpeissafinnnnsalfaeeadpakklksmdfetpynntewdssldffnedavatqdnganpmelwsideidsmiggvf

28、seq?id?no.3：

29、atgtgtggaggagctataatctccg

30、seq?id?no.4：

31、gaagactcctccaatcatggaa

32、綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果：

33、本發(fā)明提供的rsrap2-12基因是一種轉(zhuǎn)錄因子，通過在蘿卜中克隆rsrap2-12的編碼序列，構(gòu)建過表達載體，在蘿卜葉片中表達可以促進葉片中花青素的合成，構(gòu)建vigs沉默載體注射到紅皮紅肉蘿卜根部可以降低花青素的積累；因此，蘿卜rsrap2-12基因在蘿卜花青素合成調(diào)控中起重要作用，從蘿卜中分離并鑒定rsrap2-12基因，對于培育高花青素含量蘿卜新品種具有重要的育種意義，為培育高花青素蘿卜新品種提供了參考依據(jù)。