本發(fā)明涉及α-淀粉酶變體(即，具有α-淀粉酶活性的多肽)、編碼α-淀粉酶的核酸、生產(chǎn)α-淀粉酶的方法、包括α-淀粉酶的組合物以及使用α-淀粉酶的方法。

背景技術(shù)：

1、α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，e.c.3.2.1.1)構(gòu)成一組酶，這些酶催化淀粉以及其他直鏈和支鏈1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。

2、α-淀粉酶在工業(yè)上用于若干種已知應(yīng)用的用途具有悠久歷史，這些用途如洗滌劑、烘焙、釀造、淀粉液化和糖化，例如在制備高果糖糖漿中或用作從淀粉生產(chǎn)乙醇的一部分。α-淀粉酶的這些應(yīng)用和其他應(yīng)用是已知的并且利用源自微生物的α-淀粉酶，特別是細(xì)菌α-淀粉酶。

3、芽孢桿菌α-淀粉酶如特妙淀粉酶、aa560(seq?id?no:2；還參見(jiàn)wo?2000/060060)和sp707(seq?id?no:8；還參見(jiàn)tsukamoto等人，1988，biochem.biophys.res.comm.[生物化學(xué)和生物物理研究通訊]151:25-31)形成特定的已經(jīng)用于洗滌劑中的α-淀粉酶的組。這些淀粉酶已經(jīng)經(jīng)修飾以改進(jìn)洗滌劑中的穩(wěn)定性。例如，wo?96/23873披露了α-淀粉酶sp690、sp722(seq?id?no:5)和sp707(seq?id?no:8)的缺失型突變體(還參見(jiàn)wo?96/23873的seqid?no:1、2和7)以改進(jìn)這些淀粉酶的穩(wěn)定性。wo?96/23873進(jìn)一步披露了取代型突變體針對(duì)氧化來(lái)穩(wěn)定淀粉酶。具有改進(jìn)的特性的另外的α-淀粉酶突變體披露在wo?2006/002643和wo01/66712中。

4、因而，修飾天然存在的淀粉酶來(lái)改進(jìn)某些特性是已知的。

5、本發(fā)明的目的是提供具有α-淀粉酶活性的多肽(α-淀粉酶)，該多肽具有增強(qiáng)的洗滌性能，尤其是在高溫(例如在40℃或更高)下。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明涉及對(duì)應(yīng)于衍生自芽孢桿菌屬的α-淀粉酶的變體具有α-淀粉酶活性的多肽。具體而言，本發(fā)明的多肽包含seq?id?no:1的氨基酸序列或由其組成，其中這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)發(fā)生突變(例如，通過(guò)取代或缺失)，使得該多肽展現(xiàn)增強(qiáng)的洗滌性能(尤其在40℃或更高的溫度下)。

2、本發(fā)明還涉及編碼變體α-淀粉酶多肽的多核苷酸；包含這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體、和宿主細(xì)胞；以及生產(chǎn)這些變體α-淀粉酶多肽的方法。

3、本發(fā)明還涉及包含這些變體α-淀粉酶多肽的洗滌劑組合物，以及這些洗滌劑組合物在家庭和工業(yè)清洗過(guò)程(如衣物清洗和餐具洗滌)中的用途。

4、本發(fā)明進(jìn)一步涉及以下實(shí)施方案：

5、1.一種包含seq?id?no:1的變體氨基酸序列的多肽，其中與seq?id?no:1的多肽相比，該多肽具有α-淀粉酶活性并展現(xiàn)增強(qiáng)的洗滌性能。

6、2.根據(jù)實(shí)施方案1所述的多肽，其中該變體氨基酸序列在seq?id?no:1的氨基酸位置167處包含突變。

7、3.根據(jù)實(shí)施方案2所述的多肽，其中該變體氨基酸序列在seq?id?no:1的氨基酸位置167處包含取代，如w167y。

8、4.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的多肽，其中使用自動(dòng)機(jī)械應(yīng)力測(cè)定(amsa)評(píng)估增強(qiáng)的洗滌性能。

9、5.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的多肽，其中在高溫洗滌期間展現(xiàn)增強(qiáng)的洗滌性能。

10、6.根據(jù)實(shí)施方案5所述的多肽，其中所述高溫是至少40℃，如至少45℃、如至少50℃、如至少55℃、以及如至少60℃。

11、7.根據(jù)實(shí)施方案4至6中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽在選自下組的一個(gè)或多個(gè)條件下展現(xiàn)增強(qiáng)的洗滌性能：

12、(a)標(biāo)準(zhǔn)adw洗滌劑、具有漂白劑、在40℃下、以及10min的洗滌循環(huán)；

13、(b)標(biāo)準(zhǔn)adw洗滌劑、沒(méi)有漂白劑、在40℃下、以及10min的洗滌循環(huán)；

14、(c)標(biāo)準(zhǔn)adw洗滌劑、具有漂白劑、在50℃下、以及20min的洗滌循環(huán)；以及

15、(d)標(biāo)準(zhǔn)adw洗滌劑、沒(méi)有漂白劑、在50℃下、以及20min的洗滌循環(huán)；

16、其中所述標(biāo)準(zhǔn)adw洗滌劑包含甲基甘氨酸二乙酸的三鈉鹽(如trilon?m顆粒sg)、檸檬酸鈉、碳酸鈉、硅酸鈉、硫酸鈉、多磷酸鹽和硅酸鹽阻垢劑(如acusol?588g)和surfac23-6.5。

17、8.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的多肽，其中該多肽的長(zhǎng)度是1000個(gè)或更少氨基酸，例如900個(gè)、800個(gè)、700個(gè)、600個(gè)、500個(gè)、400個(gè)、300個(gè)、200個(gè)、175個(gè)、150個(gè)、125個(gè)、100個(gè)或更少的氨基酸。

18、9.根據(jù)實(shí)施方案8所述的多肽，其中該多肽的長(zhǎng)度是在400個(gè)和600個(gè)氨基酸之間，例如長(zhǎng)度在450個(gè)和500個(gè)之間、在460個(gè)和500個(gè)之間、或在470個(gè)和490個(gè)氨基酸之間。

19、10.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的多肽，該多肽在對(duì)應(yīng)于以下位置的一個(gè)或多個(gè)位置處包含突變：10、25、30、37、40、48、51、54、64、81、86、93、98、105、108、109、113、116、118、121、130、135、138、142、167、174、175、178、182、186、187、189、195、198、202、203、206、208、210、214、218、235、238、242、243、246、247、250、255、257、259、260、261、265、267、269、270、274、275、276、281、295、298、299、311、319、320、334、339、360、365、366、383、384、385、394、398、402、404、416、434、460、469、474、和482，其中編號(hào)是根據(jù)列于seq?id?no:2中的氨基酸序列。

20、11.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的多肽，其中在一個(gè)或多個(gè)位置處的所述突變是取代、缺失、和/或插入。

21、12.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽相對(duì)于seq?id?no:2的氨基酸序列包含以下取代中的一個(gè)或多個(gè)：m10l、n25k、d30n、k37h、k37l、k37m、k37r、k37v、s40t、w48f、a51q、a51t、n54s、y64w、t81s、q86h、q86i、q86l、k93h、k93r、q98r、m105y、m105f、m105i、m105l、k108r、g109a、g109m、a113e、m116i、m116l、m116a、m116v、m116f、k118q、k118h、k118n、k118r、e121h、e130h、e130q、y135h、e138q、k142r、k142q、w167y、w167h、n174q、n174*、n175q、y178w、t182g、a186d、a186g、w187y、w189h、f195n、y198f、l202m、y203h、y203n、y203g、y203f、i206l、m208f、m208l、m208v、h210n、v214r、v214t、v214i、r218n、i235v、i235l、i235m、v238t、v238a、k242p、y243f、y243m、t246v、t246i、t246l、t246m、r247k、i250l、i250v、s255k、i257a、k259n、n260d、m261l、m261a、a265g、f267y、k269s、k269n、n270g、a274k、i275l、e276q、k281h、f295y、f295w、y298w、y298f、y299w、y299f、q311t、q311h、q311r、q319h、q319r、k320h、k320r、s334t、s339a、e360f、s365m、s365c、v366i、k383q、k383r、s384e、k385h、k385q、k385r、q394k、y398w、n402y、y404w、e416l、a434d、g460e、w469f、v474c、和w482y，其中編號(hào)是根據(jù)列于seq?id?no:2中的氨基酸序列。

22、13.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽由具有突變的seq?idno:2的氨基酸序列、或其具有α淀粉酶活性的片段組成，這些突變選自下組，該組由以下組成：k37h+l202m、e360f+s365c、m261l、h210n、y243f、k108r、v474c、g460e、t81s、k269s+n270g+a274k、k37v+l202m、l202m+q311r、n174q+l202m、k385h、k385q、k385r、k383q、k320h、k320r、e276q、k93r、k93h、q98r、k118q、k118h、k118n、e130h、e130q、e138q、k142r、k142q、e416l、q394k、s384e、y64w、k37r、d30n、f295y、y243m、y178w、k281h、k269n、y198f、q311t、f195n、i257a、s255k、r247k、y404w、y398w、q319h、q319r、q311h、q311r、y299w、n260d、k259n、y299f、a434d、v366i、s365m、s339a、n174*、i235v、i250l、i250v、k37v、k37m、k37l、y203h、s40t、w187y、v238t、m105y、m105f、m105i、i206l、t182g、m116i、y135h、y203n、y203g、n25k、m116l、a265g、f295y、a265g、k242p、v214r、m208f、y198f、w482y、v214t、v214i、m261a、m105f、m208l、m116a、n174q、n174*+n175q、i235l、a265g、m105l、k37h、q311r、w469f、y203f、g109a、n175q、w48f、m116v、m116f、f295w、y298w、m208v、m208f、m10l+m261l、w187y+m208l、y298f、w167y、w167h、w189h、f295y、i235m、y243f+f267y、k37v+p45r+k383r、d30n+n33d+k37v+k383r、w167y+h210n+s339a+v366i、s339a+v366i、w167y+h210n+s339a、h210n+s339a、w167y+h210n、w167y+l202m+h210n+y299f+s339a+v366i?、w167y+h210n+y243f+s339a+v366i?、w167y+h210n+s339a+v366i+w482y?、m116f+w167y+h210n+s339a+v366i?、w48f+w167y+h210n+s339a+v366i?、w167y+h210n+y299f+s339a+v366i?、w167y+l202m+h210n+s339a+v366i?、w167y+l202m+h210n+y299f+s339a、w167y+h210n+s339a+w482y、m116f+w167y+h210n+s339a、w48f+w167y+h210n+s339a、w167y+h210n+y299f+s339a、w167y+l202m+h210n+s339a、w167y+l202m+y299f、w167y+y243f、m116f+w167y、w48f+w167y、w167y+y299f、w167y+l202m、w167y+h210n+v366i、w167y+v366i、h210n+v366i、w167y+s339a+v366i、d30n+n33d+k37v+l202m+k383r、d30n+n33d+k37v+w48f+k383r、d30n+n33d+k37v+m116f+k383r、d30n+n33d+k37v+k383r+w482y、a51t、a51t+n54s、s334t、t246m、t246l、t246v、t246i、a186g、a51q+g109m+y203g、v238a+s334t、a51t+l202m、l202m+t246l、a51t+n174q+l202m+t246i+s334t、a51t+n174q+l202m+q311r+s334t、i235l+t246m+i250l、a186d+l202m、a186d+l202m+n270g+n402y、a186d+l202m+s339a、a186d+f195n+l202m、k37h+a51t+l202m、k37v+、a51t+l202m、a51t+l202m+s365c、a51t+l202m+s339a、a51t+l202m+q311t、a51t+l202m+m261l、a51t+l202m+h210n、a51t+l202m+n270g、a51t+f195n+l202m、a51t+l202m+q319h、a51t+l202m+q319r、a51t+l202m+q311h、a51t+l202m+r247k、a51t+l202m+q311r、a51t+l202m+y398w、a51t+l202m+y299w、a51t+k108r+l202m、a51t+l202m+y243f、a51t+l202m+v474c、a51t+l202m+g460e、n174q+l202m+a265g+q311r+s334t、a51t+l202m+t246v+a265g+q311r、a51t+l202m+a265g+q311r、k37h+l202m+t246v+s334t、?l202m+t246v+s334t+e416l、l202m+t246v+s334t+n402y、?l202m+t246v+s334t+v366i、l202m+t246v+s334t+s365m、l202m+t246v+s334t+s365c、l202m+t246v+m261l+s334t、d30n+l202m+h210n+t246v+s334t、l202m+t246v+n270g+s334t、f195n+l202m+t246v+s334t、l202m+t246v+q319h+s334t、l202m+t246v+q319r+s334t、l202m+t246v+q311h+s334t、l202m+t246v+q311r+s334t、l202m+t246v+s334t+y398w、l202m+t246v+k320h+s334t、l202m+t246v+y299w+s334t、l202m+t246v+k320r+s334t、l202m+y243f+s334t?、?l202m+t246v+s334t+v474c?、l202m+t246v+s334t+g460e、?l202m+i235m+t246v+s334t、k108r+l202m+t246v+s334t、a51t+a186d+l202m+n270g+n402y、a186d+l202m+n270g+s339a+n402y、a51t+a186d+l202m+n270g、a51t+l202m+t246v+n270g、?k37h+a51t+l202m+n270g、a51t+l202m+t246l+n270g、?a51t+n174q+l202m+n270g、a51t+l202m+v238a+n270g?、?a51t+l202m+a265g?、a51t+l202m+m261l+n270g、a51t+l202m+f267y、a51t+l202m+i275l、a51t+l202m+n270g+s365m、?a51t+l202m+n270g+s365c、a51t+l202m+n270g+q311t、?a51t+l202m+n270g+e416l、a51t+l202m+n270g+n402y、?a51t+l202m+n270g+s365c、a51t+l202m+n270g+k383r、?a51t+l202m+n270g+v474c、a51t+l202m+n270g+g460e、?a51t+q86l+l202m+n270g、a51t+q86i+l202m+n270g、?a51t+a113e+l202m+n270g、a51t+k93h+l202m+n270g、?a51t+k108r+l202m+n270g、a51t+l202m+k269n?、?a51t+l202m+y243f+n270g?、a51t+f195n+l202m+n270g、?a51t+l202m+r247k+n270g、a51t+l202m+r218n+n270g、?a51t+l202m+s255k+n270g、a51t+l202m+i257a+n270g、a51t+l202m+v214i+r218n+n270g、a51t+l202m+n270g+q311h、?a51t+l202m+n270g+k320h、a51t+l202m+n270g+y299w、a51t+l202m+n270g+k320r、a51t+l202m+n270g+k383q、?a51t+k142r+l202m+n270g、a51t+e130q+l202m+n270g、?a51t+k118n+l202m+n270g、a51t+e138q+l202m+n270g、?a51t+k118h+l202m+n270g、a51t+k118q+l202m+n270g、?a51t+q86h+l202m+n270g、a51t+e121h+l202m+n270g、?a51t+k118r+l202m+n270g、k37h+a51t+n174q+l202m+a265g+q311r+s334t?、a51t+n174q+l202m+t246i+q311r+s334t?、k37v+a51t+l202m+a265g+f267y+q311r+s334t?、a51t+n174q+l202m+a265g+f267y+q311r+s334t?、a51g+l202m+q311r+s334t?、l202m+t246i+a265g+f267y+q311r+s334t?、a51t+l202m+f267y+q311r+s334t+s365l、a51t+l202m+s365c、a51t+k108r+l202m、a51t+s365c、a51t+k108r、l202m+v238a+s334t、w48f+v238a+s334t、m116f+v238a+s334t、v238a+s334t+w482y、y243f+s334t?、?l202m+v238a+y299f+s334t?、l202m+t246v+n270g+s334t、?w48f+k118h+v238a+s334t、w48f+l202m+v238a+s334t、a51t+a186n+l202m+n270g+s365c、w167y+a186n+h210n+s339a+v366i?、w48f+w167y+a186n+h210n+s339a?、w167y+a186n+h210n+y299f+s339a+v366i?、l202m+t246v+n270g+s334t+s365c?、或a186n+l202m+t246v+n270g+s334t。

23、14.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的多肽，其中當(dāng)在包含漂白劑的洗滌劑的adw測(cè)定中，并且在40℃進(jìn)行10min評(píng)估多肽時(shí)，所述增強(qiáng)的洗滌性能對(duì)應(yīng)于至少1.2的改進(jìn)因子(if)。

24、15.根據(jù)實(shí)施方案14所述的多肽，其中所述多肽在對(duì)應(yīng)于以下位置的一個(gè)或多個(gè)位置處包含突變：37、51、93、98、108、118、167、186、202、210、235、243、246、247、250、255、259、260、261、270、299、311、319、334、339、365、385、398、和404，其中編號(hào)是根據(jù)seq?idno:2。

25、16.根據(jù)實(shí)施方案14或15所述的多肽，其中所述多肽由具有突變的seq?id?no:2的氨基酸序列、或其具有α淀粉酶活性的片段組成，這些突變選自下組，該組由以下組成：m261l、y243f、k385h、k385r、k93h、q98r、k118q、k118h、s255k、y404w、y398w、q319r、y299w、n260d、k259n、y299f、s339a、s334t、a51t+l202m、i235l+t246m+i250l、k37v+a51t+l202m、a51t+l202m+s365c、a51t+l202m+q311t、a51t+l202m+m261l、a51t+l202m+r247k、a51t+l202m+y299w、a51t+k108r+l202m?、?a51t+l202m+y243f?、a51t+a186d+l202m+n270g、?a51t+l202m+n270g+s365c、w167y+a186n+h210n+s339a+v366i?、w48f+w167y+a186n+h210n+s339a?、?和w167y+a186n+h210n+y299f+s339a+v366i。

26、17.根據(jù)實(shí)施方案1至13中任一項(xiàng)所述的多肽，其中當(dāng)在包含漂白劑的洗滌劑的adw測(cè)定中，并且在50℃進(jìn)行20min評(píng)估多肽時(shí)，所述增強(qiáng)的洗滌性能對(duì)應(yīng)于至少1.2的if。

27、18.根據(jù)實(shí)施方案17所述的多肽，其中所述多肽在對(duì)應(yīng)于以下位置的一個(gè)或多個(gè)位置處包含突變：30、33、37、40、48、51、81、86、93、105、108、116、118、130、138、142、167、174、175、182、186、195、198、202、206、210、235、238、243、246、247、250、255、257、259、260、261、265、266、267、269、270、299、311、319、320、334、339、360、365、366、383、385、402、416、474、和482，其中編號(hào)是根據(jù)seq?id?no:2。

28、19.根據(jù)實(shí)施方案17或18所述的多肽，其中所述多肽由具有突變的seq?id?no:2的氨基酸序列、或其具有α淀粉酶活性的片段組成，這些突變選自下組，該組由以下組成：k37h+l202m、e360f+s365c、m261l、h210n、y243f、k108r、v474c、t81s、k385h、k385q、k385r、k93r、k118q、k118n、e130h、e130q、e138q、k37r、d30n、y243m、k269n、y198f、q311t、f195n、i257a、s255k、r247k、y404w、y398w、q319h、q319r、q311h、q311r、y299w、n260d、k259n、y299f、v366i、s365m、s339a、i250l、i250v、k37m、s40t、v238t、m105f、m105i、i206l、t182g、m116i、m116l、n174q、i235l、a265g、k37h、q311r、n175q、w48f、m116f、w167y+h210n+s339a、h210n+s339a、w48f+w167y+h210n+s339a、w48f+w167y、w167y+h210n+v366i、d30n+n33d+k37v+k383r+w482y、a51t、s334t、t246m、t246l、t246v、t246i、?a186g、?v238a+s334t、?a51t+l202m、a51t+n174q+l202m+q311r+s334t、i235l+t246m+i250l、l202m+t246v+s334t+e416l、d30n+l202m+h210n+t246v+s334t、l202m+t246v+n270g+s334t、?f195n+l202m+t246v+s334t、l202m+t246v+k320r+s334t?、?l202m+y243f+s334t?、a51t+a186d+l202m+n270g+n402y?、a186d+l202m+n270g+s339a+n402y、a51t+a186d+l202m+n270g、a51t+l202m+t246v+n270g、?k37h+a51t+l202m+n270g、a51t+l202m+t246l+n270g、?a51t+n174q+l202m+n270g、a51t+l202m+v238a+n270g?、?a51t+l202m+a265g?、a51t+l202m+m261l+n270g?、?a51t+l202m+f267y?、a51t+l202m+n270g+s365c、?a51t+l202m+n270g+s365c、a51t+l202m+n270g+k383r、?a51t+q86i+l202m+n270g、a51t+k93h+l202m+n270g、?a51t+k108r+l202m+n270g、a51t+l202m+n270g+k320h、?a51t+l202m+n270g+k383q、a51t+k142r+l202m+n270g、?a51t+e130q+l202m+n270g、a51t+e138q+l202m+n270g、a51t+l202m+s365c、a51t+s365c、w48f+v238a+s334t、m116f+v238a+s334t、v238a+s334t+w482y、y243f+s334t?、?w48f+k118h+v238a+s334t?、a51t+a186n+l202m+n270g+s365c?、w167y+a186n+h210n+s339a+v366i?、w48f+w167y+a186n+h210n+s339a?、w167y+a186n+h210n+y299f+s339a+v366i?、l202m+t246v+n270g+s334t+s365c?、?和a186n+l202m+t246v+n270g+s334t。

29、20.根據(jù)實(shí)施方案1至13中任一項(xiàng)所述的多肽，其中當(dāng)在沒(méi)有漂白劑的洗滌劑的adw測(cè)定中，并且在40℃進(jìn)行10min評(píng)估多肽時(shí)，所述增強(qiáng)的洗滌性能對(duì)應(yīng)于至少1.2的改進(jìn)因子(if)。

30、21.根據(jù)實(shí)施方案20所述的多肽，其中所述多肽在對(duì)應(yīng)于以下位置的一個(gè)或多個(gè)位置處包含突變：37、48、51、64、81、108、116、167、174、186、187、189、195、198、202、208、210、235、238、243、246、250、261、265、267、269、270、275、311、319、334、339、365、366、385、460、和474、其中編號(hào)是根據(jù)seq?id?no:2。

31、22.根據(jù)實(shí)施方案20或21所述的多肽，其中所述多肽由具有突變的seq?id?no:2的氨基酸序列、或其具有α淀粉酶活性的片段組成，這些突變選自下組，該組由以下組成：k37h+l202m、m261l、h210n、y243f、k108r、g460e、t81s、n174q+l202m、k385r、y64w、y243m、k269n、y198f、s365m、s339a、w48f、m116v、m116f、w187y+m208l、w167y、w189h、w167y+l202m+h210n+y299f+s339a、w167y+l202m+h210n+s339a、w167y+l202m、v238a+s334t、a51t+l202m、l202m+t246l、a51t+n174q+l202m+t246i+s334t、i235l+t246m+i250l、a186d+f195n+l202m、k37h+a51t+l202m、k37v+a51t+l202m、a51t+l202m+s365c、a51t+l202m+q311t、a51t+l202m+m261l、a51t+l202m+q319r、a51t+l202m+q311h、a51t+k108r+l202m、a51t+l202m+v474c?、a51t+a186d+l202m+n270g?、k37h+a51t+l202m+n270g?、?a51t+l202m+a265g?、a51t+l202m+m261l+n270g、a51t+l202m+f267y、a51t+l202m+i275l、a51t+l202m+n270g+s365c、w167y+a186n+h210n+s339a+v366i、w48f+w167y+a186n+h210n+s339a、和w167y+a186n+h210n+y299f+s339a+v366i。

32、23.根據(jù)實(shí)施方案1至13中任一項(xiàng)所述的多肽，其中當(dāng)在沒(méi)有漂白劑的洗滌劑的adw測(cè)定中，并且在50℃進(jìn)行20min評(píng)估多肽時(shí)，所述增強(qiáng)的洗滌性能對(duì)應(yīng)于至少1.2的if。

33、24.根據(jù)實(shí)施方案23所述的多肽，其中所述多肽在對(duì)應(yīng)于以下位置的一個(gè)或多個(gè)位置處包含突變：30、33、37、40、48、51、86、93、108、109、113、116、118、121、130、138、142、167、174、175、182、186、195、198、202、203、210、218、235、238、243、246、247、250、255、257、259、260、261、265、267、269、270、274、275、299、311、319、320、334、339、365、366、383、385、398、402、416、404、460、474、和482，其中編號(hào)是根據(jù)seq?id?no:2。

34、25.根據(jù)實(shí)施方案23或24所述的多肽，其中所述多肽由具有突變的seq?id?no:2的氨基酸序列、或其具有α淀粉酶活性的片段組成，這些突變選自下組，該組由以下組成：k269s+n270g+a274k、k37v+l202m、n174q+l202m、k385h、k385r、k93h、k118q、e130q、e138q、k37r、d30n、y243m、k269n、y198f、f195n、i257a、s255k、r247k、y404w、y398w、q319h、q319r、q311h、q311r、y299w、n260d、k259n、y299f、v366i、s365m、s339a、n174*、k37l、s40t、t182g、a265g、w482y、m116a、n174q、i235l、a265g、k37h、q311r、n175q、w48f、m116v、m116f、w167y+l202m+h210n+s339a+v366i、w167y+l202m+h210n+y299f+s339a、w167y+l202m+h210n+s339a、w167y+l202m+y299f、w48f+w167y、w167y+y299f、w167y+l202m、d30n+n33d+k37v+l202m+k383r、d30n+n33d+k37v+w48f+k383r、a51t、s334t、t246m、t246l、t246i、a186g、a51q+g109m+y203g、v238a+s334t、a51t+l202m、l202m+t246l、a51t+n174q+l202m+t246i+s334t、a51t+n174q+l202m+q311r+s334t、i235l+t246m+i250l、a186d+l202m、a186d+l202m+n270g+n402y、a186d+l202m+s339a、a186d+f195n+l202m、k37h+a51t+l202m、k37v+a51t+l202m、a51t+l202m+s365c、a51t+l202m+s339a、a51t+l202m+q311t、a51t+l202m+m261l、a51t+l202m+h210n、a51t+l202m+n270g、a51t+f195n+l202m、a51t+l202m+q319h、a51t+l202m+q319r、a51t+l202m+q311h、a51t+l202m+r247k、a51t+l202m+q311r、a51t+l202m+y398w、a51t+l202m+y299w、a51t+k108r+l202m、a51t+l202m+y243f、a51t+l202m+v474c、a51t+l202m+g460e、n174q+l202m+a265g+q311r+s334t、a51t+l202m+t246v+a265g+q311r、k37h+l202m+t246v+s334t、l202m+t246v+s334t+e416l、?l202m+t246v+s334t+n402y、l202m+t246v+s334t+v366i、?l202m+t246v+s334t+s365m、l202m+t246v+s334t+s365c、?l202m+t246v+m261l+s334t、d30n+l202m+h210n+t246v+s334t、l202m+t246v+n270g+s334t、f195n+l202m+t246v+s334t、l202m+t246v+q319h+s334t、l202m+t246v+q319r+s334t、l202m+t246v+q311h+s334t、l202m+t246v+q311r+s334t、l202m+t246v+s334t+y398w、l202m+t246v+k320h+s334t、l202m+t246v+y299w+s334t、l202m+t246v+k320r+s334t?、?l202m+y243f+s334t?、l202m+t246v+s334t+v474c、?l202m+t246v+s334t+g460e、l202m+i235m+t246v+s334t、?k108r+l202m+t246v+s334t、a51t+a186d+l202m+n270g+n402y?、a186d+l202m+n270g+s339a+n402y、a51t+a186d+l202m+n270g、a51t+l202m+t246v+n270g、?k37h+a51t+l202m+n270g、a51t+l202m+t246l+n270g、?a51t+n174q+l202m+n270g、a51t+l202m+v238a+n270g?、?a51t+l202m+a265g?、a51t+l202m+m261l+n270g、a51t+l202m+f267y、a51t+l202m+i275l、a51t+l202m+n270g+s365m、?a51t+l202m+n270g+s365c、a51t+l202m+n270g+q311t、a51t+l202m+n270g+e416l、a51t+l202m+n270g+n402y、?a51t+l202m+n270g+s365c、a51t+l202m+n270g+k383r、?a51t+l202m+n270g+v474c、a51t+l202m+n270g+g460e、?a51t+q86l+l202m+n270g、a51t+q86i+l202m+n270g、?a51t+a113e+l202m+n270g、a51t+k93h+l202m+n270g、?a51t+k108r+l202m+n270g、a51t+l202m+k269n?、?a51t+l202m+y243f+n270g?、a51t+l202m+r247k+n270g、?a51t+l202m+r218n+n270g、a51t+l202m+s255k+n270g、?a51t+l202m+i257a+n270g、a51t+l202m+v214i+r218n+n270g、a51t+l202m+n270g+q311h、a51t+l202m+n270g+k320h、?a51t+l202m+n270g+y299w、a51t+l202m+n270g+k320r、?a51t+l202m+n270g+k383q、a51t+k142r+l202m+n270g、?a51t+e130q+l202m+n270g、a51t+k118n+l202m+n270g、a51t+e138q+l202m+n270g、a51t+k118h+l202m+n270g、?a51t+e121h+l202m+n270g、k37h+a51t+n174q+l202m+a265g+q311r+s334t?、a51t+n174q+l202m+t246i+q311r+s334t?、k37v+a51t+l202m+a265g+f267y+q311r+s334t?、a51t+n174q+l202m+a265g+f267y+q311r+s334t、l202m+t246i+a265g+f267y+q311r+s334t?、a51t+l202m+f267y+q311r+s334t+s365l、a51t+l202m+s365c、a51t+k108r+l202m、l202m+v238a+s334t、w48f+v238a+s334t、m116f+v238a+s334t、v238a+s334t+w482y、y243f+s334t、l202m+v238a+y299f+s334t、l202m+t246v+n270g+s334t、w48f+k118h+v238a+s334t、?w48f+l202m+v238a+s334t、a51t+a186n+l202m+n270g+s365c?、w167y+a186n+h210n+s339a+v366i?、w48f+w167y+a186n+h210n+s339a?、w167y+a186n+h210n+y299f+s339a+v366i?、l202m+t246v+n270g+s334t+s365c?、?和a186n+l202m+t246v+n270g+s334t。

35、26.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽在對(duì)應(yīng)于以下位置的一個(gè)或多個(gè)位置處包含突變：48、167、210、299、339、366，其中編號(hào)是根據(jù)seq?id?no:2。

36、27.根據(jù)實(shí)施方案26所述的多肽，其中所述多肽由具有一個(gè)或多個(gè)突變的seq?idno:2的氨基酸序列、或其具有α淀粉酶活性的片段組成，這些突變選自下組，該組由以下組成：w48f、w167y、h210n、y299f、s339a、和v366i。

37、28.根據(jù)實(shí)施方案26或27所述的多肽，其中所述多肽包含選自以下的氨基酸序列、及其具有α淀粉酶活性的片段或由它們組成：

38、(a)具有突變w167y、h210n和s339a的seq?id?no:1；

39、(b)具有突變w167y、h210n、s339a和v366i的seq?id?no:1；

40、(c)具有突變w167y、h210n、y299f、s339a和v366i的seq?id?no:1；

41、(d)具有突變w48f和w167y的seq?id?no:1；

42、(e)具有突變w48f、w167y、h210n和s339a的seq?id?no:1；

43、(f)具有突變w48f、w167y、h210n、y299f、s339a和v366i的seq?id?no:1；

44、(g)具有突變v238a、s334t、和w482y的seq?id?no:1；

45、(h)具有突變y243f和s334t的seq?id?no:1；

46、(i)具有突變w48f的seq?id?no:1；

47、(j)具有突變k118h的seq?id?no:1；

48、(k)具有突變w167y的seq?id?no:1；

49、(l)具有突變w48f、v238a、和s334t的seq?id?no:1；

50、(m)具有突變i234l、t246m、和i250l的seq?id?no:1；

51、(n)具有突變s339a的seq?id?no:1；以及

52、(o)具有突變s334t的seq?id?no:1；

53、其中編號(hào)是根據(jù)seq?id?no:2。

54、29.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽包含與seq?id?no:1具有至少70％序列一致性的氨基酸序列或由其組成，例如與seq?id?no:1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。

55、30.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的多肽，其中相對(duì)于seq?id?no:1突變的數(shù)量的是1-20個(gè)，例如1-10個(gè)和1-5個(gè)，如1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10個(gè)突變。

56、31.根據(jù)前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽是選自表1的多肽的組。

57、32.一種編碼根據(jù)實(shí)施方案1至31中任一項(xiàng)所述的多肽的多核苷酸。

58、33.一種包含根據(jù)實(shí)施方案32所述的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。

59、34.一種包含根據(jù)實(shí)施方案32所述的多核苷酸的表達(dá)載體。

60、35.一種包含根據(jù)實(shí)施方案32所述的多核苷酸的宿主細(xì)胞。

61、36.一種產(chǎn)生α-淀粉酶多肽的方法，該方法包括：

62、(a)在適合于表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)根據(jù)實(shí)施方案35所述的宿主細(xì)胞；以及

63、(b)回收所述多肽。

64、37.根據(jù)實(shí)施方案36所述的方法，其中所述多肽在對(duì)應(yīng)于以下位置的一個(gè)或多個(gè)位置處包含突變：10、25、30、37、40、48、51、54、64、81、86、93、98、105、108、109、113、116、118、121、130、135、138、142、167、174、175、178、182、186、187、189、195、198、202、203、206、208、210、214、218、235、238、242、243、246、247、250、255、257、259、260、261、265、267、269、270、274、275、276、281、295、298、299、311、319、320、334、339、360、365、366、383、384、385、394、398、402、404、416、434、460、469、474、和482，其中編號(hào)是根據(jù)列于seq?id?no:2中的氨基酸序列。

65、38.一種洗滌劑組合物，該洗滌劑組合物包含根據(jù)實(shí)施方案1至31中任一項(xiàng)所述的多肽和表面活性劑、或濃縮物或添加劑用于制備該洗滌劑組合物。

66、39.根據(jù)實(shí)施方案38所述的組合物，其中該表面活性劑選自下組，該組由以下組成：陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、非離子表面活性劑和兩性離子表面活性劑。

67、40.根據(jù)實(shí)施方案38或39所述的組合物，該組合物進(jìn)一步包含選自下組的一種或多種另外的組分，該組由以下組成：氧化劑、漂白活化劑、螯合劑、填充劑、助洗劑、緩沖劑、結(jié)構(gòu)劑、螯合劑、熒光增白劑、消泡劑、酶、香料、抗再沉積劑、皮膚調(diào)理劑、柔軟劑、乳化劑、和著色劑。

68、41.根據(jù)實(shí)施方案38至40所述的組合物，其中所述組合物是液體或粉末衣物洗滌劑組合物。

69、42.根據(jù)實(shí)施方案38至40所述的組合物，其中所述組合物是液體或粉末自動(dòng)餐具洗滌(adw)洗滌劑組合物。

70、43.根據(jù)實(shí)施方案38至40所述的組合物，其中所述組合物是液體手動(dòng)餐具洗滌劑組合物。

71、44.根據(jù)實(shí)施方案1至31中任一項(xiàng)所述的變體、或根據(jù)實(shí)施方案38至43中任一項(xiàng)所述的組合物在家庭或工業(yè)清洗過(guò)程中的用途。

72、45.根據(jù)實(shí)施方案44所述的用途，用于清洗織物，例如衣物洗滌。

73、46.根據(jù)實(shí)施方案44所述的用途，用于陶瓷、塑料或玻璃材料的清洗，例如餐具洗滌。

74、定義

75、α-淀粉酶：術(shù)語(yǔ)“α-淀粉酶”(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，e.c.3.2.1.1)構(gòu)成一組酶，這些酶催化淀粉以及其他直鏈和支鏈1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)實(shí)例1中所述的程序測(cè)定α-淀粉酶活性。在一方面，本發(fā)明的變體具有seq?idno:1的成熟多肽的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。

76、氨基酸：如本文使用的，術(shù)語(yǔ)‘氨基酸’包括標(biāo)準(zhǔn)二十種遺傳編碼的氨基酸及其相應(yīng)的處于‘d’型(與天然‘l’型進(jìn)行對(duì)比)的立體異構(gòu)體、ω-氨基酸、其他天然存在的氨基酸、非常規(guī)氨基酸(例如α,α-雙取代的氨基酸、n-烷基氨基酸等)和化學(xué)衍生的氨基酸?？梢酝ㄟ^(guò)與功能性側(cè)集團(tuán)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的化學(xué)衍生物。此類衍生的分子包括例如，其中游離氨基基團(tuán)已經(jīng)衍生形成胺鹽酸鹽、對(duì)甲苯磺?；鶊F(tuán)、羧基苯氧基基團(tuán)、叔丁氧基羰基基團(tuán)、氯乙?；鶊F(tuán)或甲?；鶊F(tuán)的那些分子。游離羧基基團(tuán)可以被衍生形成鹽、甲酯和乙酯或其他類型的酯和酰肼。游離羥基基團(tuán)可被衍生化以形成o-酰基或o-烷基衍生物。作為化學(xué)衍生物還包括那些包含二十種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如：4-羥脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羥賴氨酸可以取代賴氨酸；3-甲基組氨酸可以取代組氨酸；高絲氨酸可以取代絲氨酸并且鳥氨酸取代賴氨酸。只要維持必要的活性，衍生物也包括包含一個(gè)或多個(gè)添加或缺失的肽。其他包括的修飾是酰胺化、氨基末端?；?例如乙?；驇€基乙酸酰胺化)、末端羧基酰胺化(例如用氨或甲胺)、和類似的末端修飾。

77、當(dāng)明確列舉氨基酸，如‘丙氨酸’或‘a(chǎn)la’或‘a(chǎn)’時(shí)，除非另有明確說(shuō)明，否則該術(shù)語(yǔ)是指l-丙氨酸和d-丙氨酸。其他非常規(guī)氨基酸也可以是本發(fā)明多肽的適合組分，只要所需功能特性由多肽保留即可。對(duì)于所示的肽，適當(dāng)時(shí)，每個(gè)編碼的氨基酸殘基由單字母代號(hào)表示，對(duì)應(yīng)于常規(guī)氨基酸的普通名稱。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的多肽包含l-氨基酸或由其組成。

78、cdna：術(shù)語(yǔ)“cdna”意指可以通過(guò)從獲得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、剪接的mrna分子進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而制備的dna分子。cdna缺乏可以存在于對(duì)應(yīng)基因組dna中的內(nèi)含子序列。早先的初始rna轉(zhuǎn)錄物本是mrna的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mrna之前要經(jīng)一系列步驟進(jìn)行加工，包括剪接。

79、編碼序列：術(shù)語(yǔ)“編碼序列”意指一種多核苷酸，該多核苷酸直接規(guī)定了變體的氨基酸序列。編碼序列的邊界一般由開(kāi)放閱讀框架決定，該開(kāi)放閱讀框架從起始密碼子(如atg、gtg或ttg)開(kāi)始并且以終止密碼子(如taa、tag或tga)結(jié)束。編碼序列可為基因組dna、cdna、合成dna或其組合。

80、控制序列：術(shù)語(yǔ)“控制序列”意指為編碼本發(fā)明的變體的多核苷酸的表達(dá)所需的核酸序列。每個(gè)控制序列對(duì)于編碼該變體的多核苷酸來(lái)說(shuō)可以是天然的(即，來(lái)自相同基因)或外源的(即，來(lái)自不同基因)，或相對(duì)于彼此是天然的或外源的。此類控制序列包括但不限于前導(dǎo)子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少，控制序列包括啟動(dòng)子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。出于引入促進(jìn)控制序列與編碼變體的多核苷酸的編碼區(qū)域連接的特異性限制位點(diǎn)的目的，控制序列可以提供有接頭。

81、增強(qiáng)的洗滌性能：術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)的洗滌性能”或“改進(jìn)的洗滌性能”意指與seq?id?no:1的親本α淀粉酶相比，本發(fā)明的多肽在洗滌過(guò)程(如衣物洗滌或餐具洗滌)中提供清洗效果(例如去除污漬)的能力是改進(jìn)的。可以使用本領(lǐng)域熟知的方法來(lái)確定洗滌性能，如使用自動(dòng)機(jī)械應(yīng)力測(cè)定(amsa)或自動(dòng)餐具洗滌(adw)(參見(jiàn)實(shí)例2和3)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，僅在一些或者可能所有的洗滌條件下(例如在40℃或更高(例如在40℃和/或在50℃)的洗滌溫度下、和/或有或沒(méi)有漂白劑的存在)，可以實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的洗滌性能。

82、表達(dá)：術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括涉及變體的產(chǎn)生的任何步驟，包括(但不限于)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。

83、表達(dá)載體：術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”意指一種直鏈或環(huán)狀dna分子，該分子包括編碼一種變體的一種多核苷酸并且可操作地連接至提供用于其表達(dá)的控制序列。

84、片段：術(shù)語(yǔ)“片段”意指具有在seq?id?no:1的成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在的一個(gè)或多個(gè)(例如若干個(gè))氨基酸的多肽；其中該片段具有α-淀粉酶活性。在一方面，片段包含seq?id?no:1的至少200個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，例如seq?id?no:1的至少300個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基、或至少350個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基、或至少400個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基、或至少450個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。

85、宿主細(xì)胞：術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”意指易于用包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。

86、改進(jìn)因子：術(shù)語(yǔ)“改進(jìn)因子”意指計(jì)算根據(jù)本發(fā)明的變體的具體特性的改進(jìn)的定量方式。改進(jìn)因子可以根據(jù)以下公式確定：

87、

88、可以使用其他公式來(lái)確定改進(jìn)因子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道目前提出的公式以及計(jì)算改進(jìn)因子的替代方法。

89、根據(jù)本發(fā)明，1.0的值對(duì)應(yīng)于針對(duì)親本α-淀粉酶觀察到的比活性。高于1.0的值指示與親本α-淀粉酶相比所測(cè)試的變體的比活性的改進(jìn)。因此，>1.0的任何值指示與親本α-淀粉酶相比該變體的特性(如比活性)的改進(jìn)。1.0的值表明變體的特性與親本α-淀粉酶至少相當(dāng)。

90、分離的：術(shù)語(yǔ)“分離的”意指在自然界中不存在的形式或環(huán)境中的一種物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括(1)任何非天然發(fā)生的物質(zhì)，(2)包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子的任何物質(zhì)，該物質(zhì)至少部分地從與其本質(zhì)相關(guān)的一種或多種或所有天然存在的成分中去除；(3)相對(duì)于天然發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)通過(guò)人工修飾的任何物質(zhì)；或(4)通過(guò)相對(duì)于與其天然相關(guān)的其他組分，增加該物質(zhì)的量而修飾的任何物質(zhì)(例如，編碼該物質(zhì)的基因的多個(gè)拷貝；比與編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子的使用)。分離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣品中。

91、成熟多肽：術(shù)語(yǔ)“成熟多肽”意指在翻譯和任何翻譯后修飾如n-末端加工、c-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后處于其最終形式的多肽。本領(lǐng)域內(nèi)公知，宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生由相同多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同的成熟多肽(即，具有不同的c-末端和/或n-末端氨基酸)的混合物。

92、成熟多肽編碼序列：術(shù)語(yǔ)“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。

93、突變：在本發(fā)明多肽的上下文中，術(shù)語(yǔ)“突變”意指在參考氨基酸序列(即seq?idno:1)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸通過(guò)用不同的氨基酸取代或通過(guò)缺失而改變。此外，突變可以對(duì)應(yīng)于在參考氨基酸序列內(nèi)一個(gè)或多個(gè)額外的氨基酸的插入。

94、核酸構(gòu)建體：術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”意指單-鏈或雙-鏈的核酸分子，該核酸分子是從天然存在的基因中分離的，或以本來(lái)不存在于自然界中的方式被修飾成包含核酸的區(qū)段，或者其是合成的，該核酸分子包括一個(gè)或多個(gè)控制序列。

95、可操作地連接：術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”意思指這樣一種配置，在該配置中，一個(gè)控制序列被放置在相對(duì)于多核苷酸的編碼序列適當(dāng)?shù)奈恢锰帲@樣使得該控制序列引導(dǎo)該編碼序列的表達(dá)。

96、親本或親本α-淀粉酶：術(shù)語(yǔ)“親本”或“親本α-淀粉酶”意指seq?id?no:1的α-淀粉酶(通過(guò)諾維信公司(novozymes?a/s)在商品名“plus”下商品化；參見(jiàn)wo2006/002643)。

97、序列一致性：兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性是通過(guò)參數(shù)“序列一致性”進(jìn)行描述。

98、出于本發(fā)明的目的，使用如在emboss包(emboss：歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件套件，rice等人，2000,trends?genet.[遺傳學(xué)趨勢(shì)]16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的needle程序中所實(shí)施的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物學(xué)雜志]48:443-453)來(lái)確定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性。使用的參數(shù)可以是缺口開(kāi)放罰分10、缺口擴(kuò)展罰分0.5、以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長(zhǎng)一致性”的尼德?tīng)栞敵?使用-非簡(jiǎn)化(-nobrief)選項(xiàng)獲得)用作百分比一致性并且如下計(jì)算：

99、(同一的殘基x?100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù))

100、可替代地，所使用的參數(shù)可以是空位開(kāi)放罰分10，空位延伸罰分0.5和ednafull(ncbi?nuc4.4的emboss版本)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長(zhǎng)一致性”的尼德?tīng)栞敵?使用-非簡(jiǎn)化(-nobrief)選項(xiàng)獲得)用作百分比一致性并且如下計(jì)算：

101、(同一的脫氧核糖核苷酸×100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-在比對(duì)中的空位總數(shù))

102、子序列：術(shù)語(yǔ)“子序列”意指使一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))核苷酸從成熟多肽編碼序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中該子序列編碼具有α-淀粉酶活性的片段。

103、變體：術(shù)語(yǔ)“變體”意指相對(duì)于seq?id?no:1的“親本”α-淀粉酶的位置，在一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))位置包含突變(即，取代、插入、和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占用某一位置的氨基酸；并且插入意指在鄰接并且緊隨占用某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。本發(fā)明的變體具有seq?id?no:1的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的α-淀粉酶活性。

104、野生型α-淀粉酶：術(shù)語(yǔ)“野生型α-淀粉酶”意指由天然存在的微生物(例如自然界中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌、酵母或絲狀真菌)表達(dá)的α-淀粉酶。

105、變體命名規(guī)則

106、具有α-淀粉酶活性的本發(fā)明的多肽對(duì)應(yīng)于衍生自芽孢桿菌屬的α-淀粉酶的變體(如在seq?id?no:1中顯示)(其由諾維信公司(novozymes?a/s)，在商品名stainzyme?plustm下銷售)。

107、

108、本發(fā)明多肽中的變體(即突變的氨基酸)通過(guò)參考seq?id?no:2(其對(duì)應(yīng)于枯草芽孢桿菌的成熟蛋白aa560)的氨基酸編號(hào)來(lái)定義。以下以粗體、下劃線顯示了相對(duì)于seq?idno:1的氨基酸序列差異。

109、

110、

111、相應(yīng)地，seq?id?no:2中的氨基酸位置1至182對(duì)應(yīng)于seq?id?no:1中的相同編號(hào)，seq?id?no:2的氨基酸位置183至184在seq?id?no:1中不存在，并且seq?id?no:2的氨基酸位置185至485分別對(duì)應(yīng)于seq?id?no:1的位置183至483。

112、因此，出于本發(fā)明的目的，使用在seq?id?no:2中披露的成熟多肽來(lái)確定另一種α-淀粉酶多肽中的對(duì)應(yīng)氨基酸殘基。將另一種α-淀粉酶的氨基酸序列與seq?id?no:2中披露的成熟多肽進(jìn)行比對(duì)，并且基于該比對(duì)，使用如在emboss包(emboss：歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件套件，rice等人，2000，trends?genet.[遺傳學(xué)趨勢(shì)]16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德?tīng)柍绦蛑兴鶎?shí)施的尼德?tīng)柭?翁施算法(needleman和wunsch，1970，j.mol.biol.[分子生物學(xué)雜志]48:443-453)來(lái)確定與seq?id?no:2中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸殘基相對(duì)應(yīng)的氨基酸位置編號(hào)。使用的參數(shù)是缺口開(kāi)放罰分10、缺口擴(kuò)展罰分0.5、以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩陣。

113、可以通過(guò)使用若干計(jì)算機(jī)程序，使用其對(duì)應(yīng)默認(rèn)參數(shù)比對(duì)多個(gè)多肽序列來(lái)確定在另一種α-淀粉酶中的對(duì)應(yīng)氨基酸殘基的鑒定，所述計(jì)算機(jī)程序包括但不限于muscle(通過(guò)對(duì)數(shù)預(yù)期的多序列比較；版本3.5或更新版本；edgar，2004，nucleic?acids?research[核酸研究]32:1792-1797)，mafft(版本6.857或更新版本；katoh和kuma，2002，nucleic?acidsresearch[核酸研究]30:3059-3066；katoh等人，2005，nucleic?acids?research[核酸研究]33:511-518；katoh和toh，2007，bioinformatics[生物信息學(xué)]23:372-374；katoh等人，2009，methods?in?molecular?biology[分子生物學(xué)方法]537:_39-64；katoh和toh，2010，bioinformatics[生物信息學(xué)]26:_1899-1900)，以及采用clustalw(1.83或更新版本；thompson等人，1994，nucleic?acids?research[核酸研究]22:4673-4680)的emboss?emma。

114、當(dāng)其他α-淀粉酶與seq?id?no:2的成熟多肽相背離使得傳統(tǒng)的基于序列的比較方法不能檢測(cè)其相互關(guān)系時(shí)(lindahl和elofsson，2000，j.mol.biol.[分子生物學(xué)雜志]295:613-615)，可以應(yīng)用其他成對(duì)序列比較算法。在基于序列的搜索中較高的敏感度可使用搜索程序來(lái)獲得，這些搜索程序采用多肽家族的概率表現(xiàn)(譜)來(lái)搜索數(shù)據(jù)庫(kù)。例如，psi-blast程序通過(guò)迭代數(shù)據(jù)庫(kù)搜索過(guò)程來(lái)產(chǎn)生多個(gè)譜，并且能夠檢測(cè)遠(yuǎn)距離同源物(atschul等人，1997,nucleic?acids?res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中的一個(gè)或多個(gè)代表，甚至可以實(shí)現(xiàn)更高的敏感度。程序如genthreader(jones,1999,j.mol.biol.[分子生物學(xué)雜志]287:797-815；mcguffin和jones,2003,bioinformatics[生物信息學(xué)]19:874-881)利用來(lái)自多種來(lái)源(psi-blast、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、結(jié)構(gòu)比對(duì)譜和溶劑化勢(shì))的信息作為預(yù)測(cè)查詢序列的結(jié)構(gòu)折疊的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入。類似地，gough等人，2000,j.mol.biol.[分子生物學(xué)雜志]313:903-919的方法可以用于比對(duì)未知結(jié)構(gòu)的序列與存在于scop數(shù)據(jù)庫(kù)中的超家族模型。這些比對(duì)進(jìn)而可以用于產(chǎn)生多肽的同源性模型，并且使用出于該目的而開(kāi)發(fā)的多種工具可以評(píng)估此類模型的準(zhǔn)確度。

115、對(duì)于已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，若干工具和資源可用于檢索并產(chǎn)生結(jié)構(gòu)比對(duì)。例如，蛋白質(zhì)的scop超家族已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行比對(duì)，并且那些比對(duì)是可訪問(wèn)且可下載的。可以使用多種算法如距離比對(duì)矩陣(holm和sander,1998,proteins[蛋白質(zhì)]33:88-96)或組合延伸(shindyalov和bourne,1998,protein?engineering[蛋白質(zhì)工程]11:739-747)比對(duì)兩種或更多種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且這些算法的實(shí)施可以另外用于查詢具有感興趣結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)，以便發(fā)現(xiàn)可能的結(jié)構(gòu)同源物(例如，holm和park,2000,bioinformatics[生物信息學(xué)]16:566-567)。

116、在描述本發(fā)明的α-淀粉酶變體中，以下所述的命名法適于引用方便。采用了已接受的iupac單字母和三字母的氨基酸縮寫。

117、取代：對(duì)于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，在位置226處的蘇氨酸被丙氨酸取代表示為“thr226ala”或者“t226a”。多個(gè)突變由加號(hào)(“+”)分開(kāi)，例如“gly205arg+ser411phe”或“g205r+s411f”表示在位置205和位置411處的甘氨酸(g)和絲氨酸(s)分別被精氨酸(r)和苯丙氨酸(f)取代。

118、缺失：對(duì)于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，將在位置195處的甘氨酸的缺失表示為“gly195*”或“g195*”。多個(gè)缺失由加號(hào)(“+”)分開(kāi)，例如，“gly195*+ser411*”或“g195*+s411*”。

119、插入：對(duì)于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，將在位置195處的甘氨酸之后插入賴氨酸表示為“gly195glylys”或“g195gk”。將多個(gè)氨基酸的插入表示為[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入氨基酸#1、插入氨基酸#2等]。例如，在位置195處的甘氨酸之后插入賴氨酸和丙氨酸被表示為“gly195glylysala”或“g195gka”。

120、在此類情況下，通過(guò)將小寫字母添加至在所插入的氨基酸殘基之前的氨基酸殘基的位置編號(hào)中來(lái)對(duì)所插入的氨基酸殘基進(jìn)行編號(hào)。在以上實(shí)例中，該序列因此將是：

121、 <![cdata[<u>親本：</u>]]> <![cdata[<u>變體：</u>]]> 195 195?195a?195b g g-k-a

122、多種改變：包含多種改變的變體由加號(hào)(“+”)分開(kāi)，例如“arg170tyr+gly195glu”或“r170y+g195e”表示在位置170和位置195處的精氨酸和甘氨酸分別被酪氨酸和谷氨酸取代。

123、不同改變：在可以在某一位置引入不同的改變的情況下，所述不同的改變由逗號(hào)分開(kāi)，例如“arg170tyr,glu”表示在位置170處的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“tyr167gly,ala+arg170gly,ala”表示以下變體：

124、“tyr167gly+arg170gly”、“tyr167gly+arg170ala”、“tyr167ala+arg170gly”以及“tyr167ala+arg170ala”。