本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種用于小片段rna檢測的標(biāo)準(zhǔn)品及制備方法。

背景技術(shù)：

1、rna分子量標(biāo)準(zhǔn)品又稱rna?marker，是分子生物學(xué)電泳實驗中經(jīng)常使用到的一種rna片段的定性或定量參照物，由一系列不同長度的rna片段組成。如在瓊脂糖凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳，毛細(xì)管電泳等實驗中，通過將rna?marker與rna片段一起電泳分析，可以對待測rna片段的長度進(jìn)行分析，但是由于rna分子本身的不穩(wěn)定性，標(biāo)準(zhǔn)rna樣品在制備和純化過程中容易發(fā)生降解，這會導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)分子量大小出現(xiàn)偏差，從而產(chǎn)生對未知樣品長度的誤判。特別對高精度，高分辨率的短小片段rna的電泳分析需求，常常因為難以獲得精確分子量標(biāo)準(zhǔn)品而難以實施。另外，常規(guī)制備方法大多數(shù)分別制備不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)品，對每一種標(biāo)樣都需要單獨分離純化和質(zhì)控，然后混合，制備和使用成本非常高。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決常規(guī)rna標(biāo)準(zhǔn)品容易降解的問題，本發(fā)明提供一種用于rna檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，為一段包含重復(fù)單元的rna長序列，rna長序列包含n個長度控制序列和n+1個酶切識別序列，酶切位點位于長度控制序列的兩側(cè)，n為大于或等于2的整數(shù)，其中，將酶切識別序列與長度控制序列的組合視為一個重復(fù)單元。

2、本發(fā)明提供的標(biāo)準(zhǔn)品在作為內(nèi)標(biāo)使用時能被現(xiàn)場切割成長度不同、分子量精確的條帶，從而解決的了常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)品在保存過程中可能出現(xiàn)的降解的現(xiàn)象。本發(fā)明提供的標(biāo)準(zhǔn)品，能夠被酶更為均勻的切割，且穩(wěn)定性好，窗口期長，準(zhǔn)確度高，使用簡單方便。

3、進(jìn)一步地，n為2、3、4、5、6、7，優(yōu)選的，n為2或者3。

4、進(jìn)一步地，酶切識別序列為脫氧酶切識別序列，脫氧核酶為10-23型脫氧核酶或8-17型脫氧核酶，更進(jìn)一步地，所述脫氧核酶的序列如seq?id?no.10所示。在一些實施方式中，酶切識別序列也可以是其他可以定點切割的切割酶的識別序列，本發(fā)明提供的標(biāo)準(zhǔn)品，其酶切識別序列不受切割酶種類的限制，任何能夠定點切割的核酶或脫氧核酶的識別序列均可作為切割酶用于本發(fā)明，進(jìn)一步，所述酶切識別序列為cuaguauucuucugguccccacagacuca(seq?id?no.13)。

5、在一些實施方式中，本發(fā)明設(shè)計的rna標(biāo)準(zhǔn)品用于檢測小片段rna，小片段rna是指序列較短的rna，一般在300nt以內(nèi)。具體的，小片段rna為檢測mrna加帽和polya尾長度分析時特異性切割的截斷rna小片段rna片段，trna、mirna、sirna、grna、pirna、snrna或scrna中的一種或多種。檢測mrna加帽和polya尾長度分析時特異性切割的截斷rna小片段一般在20～150nt；trna(transfer?ribonucleic?acid)一般是由一條長70～90nt的短鏈組成的：mirna(microrna)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22nt的非編碼單鏈rna分子；sirna(small?interfering?rna)長度一般為21-23nt；grna長度大約60-80nt；pirna(piwi-interacting?rna)是一種長25-33nt的非編碼rna；snrna(small?nuclearrna)長度大約100-215nt；scrna(small?cytoplasmic?rna)長度大約19～28nt。

6、在一些實施方式中，小片段rna也可以是其它序列長度較低的rna序列，例如截斷的polya尾或加帽的rna的5′端。在一些實施方式中，本技術(shù)提供的標(biāo)準(zhǔn)品或使用方法用于polya尾長檢測。在一些實施方式中，本技術(shù)提供的標(biāo)準(zhǔn)品或使用方法用于rna加帽檢測。

7、在一些實施方式中，本發(fā)明設(shè)計的rna標(biāo)準(zhǔn)品也可用于檢測長度大于300nt的rna的長度粗略估計。

8、本發(fā)明還提供一種上述標(biāo)準(zhǔn)品在小片段rna檢測上的使用方法，使用方法包括以下步驟：

9、s1：對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行不完全酶切，得到不同長度的rna片段混合物；

10、標(biāo)準(zhǔn)品為一段rna長序列，包含n個長度控制序列和n+1個酶切識別序列，酶切識別序列位于長度控制序列的兩側(cè)，n為大于或等于2的整數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)品還包括5′起始序列和3′終止序列，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的n+1個酶切識別序列被不完全切割時，能夠得到不同長度的具有確切核苷酸個數(shù)的序列。

11、在一些實施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)構(gòu)按順序依次包括5′起始序列、n個酶切識別序列與長度控制序列組成的重復(fù)單元、酶切識別序列以及3′終止序列。在一些實施方式中，n等于2，即標(biāo)準(zhǔn)品擁有兩個重復(fù)單元；在一些實施方式中，n等于3，即標(biāo)準(zhǔn)品擁有三個重復(fù)單元。

12、在一些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)品擁有5′起始序列、3′終止序列、兩個完全一致的長度控制序列和三個完全一致的酶切識別序列，即擁有兩個重復(fù)單元，全長178nt，其中長度控制序列長27nt、5′起始序列長11nt、3′終止序列長26nt，酶切識別序列長29nt，且酶切識別序列的切割位點5′側(cè)長15nt，酶切識別序列的切割位點3′側(cè)長14nt。利用酶切反應(yīng)對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行不完全切割，參照圖1可知，重復(fù)單元的長度為56nt，理論上會出現(xiàn)26nt、40nt、56nt、82nt、96nt、112nt、138nt、152nt、178nt的9種不同長度的的rna片段，可以理解的是，在實際過程中無法完美均勻的切割出全部9種長度的rna片段并被檢測儀器清晰的識別出來，實際產(chǎn)生的條帶數(shù)量取決于不完全切割的具體條件和時間，為了使待測rna的數(shù)據(jù)讀取更為精確，一般認(rèn)為需要至少切割并被儀器識別出5種以上的清晰的主峰值。

13、在一些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)品擁有5′起始序列、3′終止序列、三個完全一致的長度控制序列和四個完全一致的酶切識別序列，即擁有三個重復(fù)單元，全長234nt，其中長度控制序列長27nt、5′起始序列長11nt、3′終止序列長26nt，酶切識別序列長29nt，且酶切識別序列的切割位點5′側(cè)長15nt，酶切識別序列的切割位點3′側(cè)長14nt。利用酶切反應(yīng)對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行不完全切割，參照圖2可知，重復(fù)單元的長度為56nt，理論上會出現(xiàn)26nt、40nt、56nt、82nt、96nt、112nt、138nt、152nt、168nt、194nt、208nt、234nt的12種不同長度的的rna片段，可以理解的是，在實際過程中無法完美均勻的切割出全部12種長度的rna片段并被檢測儀器清晰的識別出來，實際產(chǎn)生的條帶數(shù)量取決于不完全切割的具體條件和時間，為了使待測rna的數(shù)據(jù)讀取更為精確，一般認(rèn)為需要至少切割并被儀器識別出5種以上的清晰的主峰值。

14、s2：采用上述不同長度的rna片段混合物作為小片段rna長度檢測的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行擬合，生成標(biāo)準(zhǔn)計算文件；

15、本發(fā)明提供的不同長度的rna片段混合物，可用于各種rna長度檢測儀器的檢測內(nèi)標(biāo)，包括但不限于可用于rna長度檢測的瓊脂糖凝膠電泳檢測、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測或毛細(xì)管電泳檢測。在一些實施方式中，還可用于其它需要不同長度的rna片段內(nèi)標(biāo)的儀器。

16、在一些實施方式中，采用儀器自帶計算軟件即可生成標(biāo)準(zhǔn)計算文件。在一些實施方式中，儀器沒有自動生成的計算軟件，也可通過人工的方式自行擬合。

17、s3：對待測小片段rna進(jìn)行檢測并直接讀取待測小片段rna的序列長度。

18、進(jìn)一步地，酶切識別序列與脫氧核酶的摩爾比為4：1-32：1之間。本技術(shù)提供的標(biāo)準(zhǔn)品，需要現(xiàn)場切割并用于內(nèi)標(biāo)，因此對切割片段的均勻性具有較高的要求，標(biāo)準(zhǔn)品rna應(yīng)當(dāng)被均勻、迅速的切割，并盡量的產(chǎn)生清晰可讀的條帶，從而為后續(xù)待測樣品的長度讀取提供更為精準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)。本技術(shù)提供的標(biāo)準(zhǔn)品，酶切識別序列與脫氧核酶的摩爾比為4：1-32：1之間時，能夠讀取到更多更為清晰的峰值；優(yōu)選的，酶切識別序列與脫氧核酶的摩爾比為8：1-16：1之間；更優(yōu)選的，酶切識別序列與脫氧核酶的摩爾比為16：1。

19、本發(fā)明還提供一種上述標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，包括以下步驟：

20、a：設(shè)計引物，重疊延伸pcr并篩選得到具有重復(fù)單元的目的片段；

21、通過重疊延伸pcr能夠獲得具有不同重復(fù)單元數(shù)的片段，通過篩選獲得目的重復(fù)單元片段，如具有兩個重復(fù)單元的片段或具有三個重復(fù)單元的片段，以實際需求進(jìn)行篩選。

22、b：將具有重復(fù)單元的目的片段插入體外轉(zhuǎn)錄載體，得到體外轉(zhuǎn)錄模板；

23、c：對體外轉(zhuǎn)錄模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到標(biāo)準(zhǔn)品。

24、本技術(shù)涉及的小片段rna，其長度一般在300nt以內(nèi)，為了使檢測結(jié)果更加精確，標(biāo)準(zhǔn)品的總序列長度一般不高于300nt。在一些實施方式中，n等于2或者3，重復(fù)單元的序列長度為40-80nt。

25、進(jìn)一步地，體外轉(zhuǎn)錄模板還有t7啟動子，具有重復(fù)單元的片段插入所述t7啟動子的后面。

26、本發(fā)明通過對重復(fù)串聯(lián)序列單元的精確不完全切割方案設(shè)計，可以一次性制備多種精確大小的rna片段，無需混合便可直接使用，因而流程簡潔方便，產(chǎn)生的精確片段豐富，且窗口期時間長，切割后無需純化直接使用，能有效的避免降解，從而保證了標(biāo)準(zhǔn)分子量的精確性。重復(fù)單元還可以根據(jù)待測rna樣品本身的序列特點進(jìn)行一致性優(yōu)化設(shè)計，使其精確性更符合待測rna樣品的各堿基比例，進(jìn)一步提高對其長度分析的精確性。本方法適用各種對rna長度有精確分析需求的實驗，包括但不僅限于mrna帽子結(jié)構(gòu)分析、mrnapolya長度分析、各種小片段rna精確長度分析(如trna、mirna、sirna、grna、pirna、snrna、scrna)、rna合成產(chǎn)物分析、rna斷裂片段或rna內(nèi)切酶、外切酶產(chǎn)物分析等。