本發(fā)明屬于基因工程，具體涉及 dad27基因在調控參薯抗炭疽病中的應用。

背景技術：

1、參薯為薯蕷科、薯蕷屬的纏繞草質藤本。炭疽病是參薯生產中的主要病害，易侵染參薯葉片，嚴重時造成全株死亡，常造成參薯產量的大面積減產甚至絕收、經濟損失嚴重。其中，參薯的拉丁名為 dioscorea?alata。

2、目前，炭疽病的防治措施主要以化學防治為主，易造成環(huán)境污染，長期使用導致病原菌具有抗藥性，化學試劑的殘留嚴重時會引起人、畜中毒。因此，炭疽病防治應加快優(yōu)質抗炭疽病新種質的培育，選育抗病品種是防止山藥炭疽病大規(guī)模發(fā)生最根本的途徑。但參薯炭疽病抗病機理不明，探明參薯抗炭疽病的分子機制對提高參薯炭疽病抗性和培育抗病新品種具有重要意義。

3、據報道，擬南芥中編碼獨腳金內酯合成關鍵酶dwarf27會負調控脫落酸合成前體9-順式紫黃質，從而負調控脫落酸合成。近年研究表明，脫落酸能調控氣孔的關閉，從而提高植物的抗旱能力。目前，需要開發(fā)負調控脫落酸的獨腳金內酯合成關鍵酶基因參與其他方面的新應用。

技術實現(xiàn)思路

1、為開發(fā)一種負調控脫落酸的獨腳金內酯合成關鍵酶基因參與其他方面的新應用，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種調控參薯炭疽病抗性的參薯 dad27基因，提供了參薯 dad27基因在提高植物抗逆性中的應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案。

2、本發(fā)明提供了 dad27基因在調控參薯抗炭疽病中的應用，所述 dad27基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。所述 dad27基因為一種負調控脫落酸的獨腳金內酯合成關鍵酶基因，且該基因可以用于調控參薯炭疽病抗性。本發(fā)明提供了該基因在調控參薯抗炭疽病中的應用，開發(fā)了一種負調控脫落酸的獨腳金內酯合成關鍵酶基因參與其他方面的新應用。

3、優(yōu)選地，所述 dad27基因表達的蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

4、其中，所述參薯 dad27基因的獲得方法如下：利用參薯轉錄組測序序列，在參薯全基因組和轉錄組數據庫中進行核苷酸序列比對檢索，獲得的參薯 dad27基因的cdna序列。通過軟件primer?premire?5.0設計特異性引物d27_f和d27_r，以參薯cdna為模板擴增獲得 dad27基因的核苷酸序列。

5、其中，全基因組和轉錄組數據庫的網址為：https://yambase.org/。

6、參薯 dad27基因的cdna序列：dioal.11g002500.1。

7、d27_f的核苷酸序列如seq?id?no.3所示：

8、5’-atggagctcatctccttccc-3’。

9、d27_r的核苷酸序列如seq?id?no.4所示：

10、5’-tcatgcttgtaatttaggacaaattgg-3’。

11、本發(fā)明利用病毒誘導的基因沉默技術構建 dad27基因沉默參薯植株，并測定沉默參薯中脫落酸的含量及炭疽病抗性指標，證明 dad27基因在參薯抗炭疽病中的功能。其中，病毒誘導的基因沉默的英文名稱為virus-induced?gene?silencing，vigs。脫落酸的英文名稱為abscisic?acid，aba。進一步的方案如下：

12、本發(fā)明通過病毒誘導的基因沉默技術使植物中的所述 dad27基因沉默，以獲得炭疽病抗性增強的沉默植株。其中，所述植物為參薯。

13、優(yōu)選地，所述病毒誘導的基因沉默技術是將沉默 dad27基因的重組載體轉入參薯中，使參薯中的所述 dad27基因沉默，進而提高參薯的炭疽病抗性。

14、優(yōu)選地，所述沉默 dad27基因的重組載體是利用vigs病毒載體構建得到的 dad27基因的沉默載體。

15、優(yōu)選地，所述沉默 dad27基因的重組載體包括vigs病毒載體和插入所述vigs病毒載體的所述 dad27基因。

16、優(yōu)選地，所述vigs病毒載體包括煙草脆裂病毒ptrv1載體或煙草脆裂病毒ptrv2載體。

17、優(yōu)選地，所述沉默 dad27基因的重組載體用于構建參薯 dad27基因vigs沉默體系。其中，參薯 dad27基因vigs沉默體系又稱為基于 dad27基因的參薯葉片vigs體系。

18、優(yōu)選地，所述參薯 dad27基因vigs沉默體系包括含有輔助載體的農桿菌菌液和含有所述沉默 dad27基因的重組載體的農桿菌菌液。

19、所述輔助載體為煙草脆裂病毒ptrv1載體。

20、優(yōu)選地，所述沉默 dad27基因的重組載體為含目的基因片段的煙草脆裂病毒ptrv2載體，所述目的基因片段來源于參薯葉片，所述目的基因片段為dad27基因特異性片段，其核苷酸序列如seq?id?no.7所示。其中，所述沉默 dad27基因的重組載體簡稱為重組載體。

21、本發(fā)明基于上述輔助載體構建一種基于 dad27基因的參薯葉片vigs體系，具體的步驟如下：

22、（1）重組載體的構建

23、本發(fā)明所述表達 dad27基因的重組載體通過引物trv_d27_f和trv_d27_r擴增獲得如seq?id?no.7所示的核苷酸序列后插入煙草脆裂病毒ptrv2載體的 xba?i和 bamh?i酶切位點間得到的載體；即seq?id?no.7的第1位5’端緊鄰 xba?i酶切位點，seq?id?no.7的最后1位3’端緊鄰 bamh?i酶切位點，得到重組載體ptrv2-dad27。重組載體ptrv2-dad27又簡稱為重組載體。

24、其中，trv_d27_f的核苷酸序列如seq?id?no.5所示：

25、5’-aaggttaccgaattctctagaggattgggactatgagagctttgt-3’。

26、trv_d27_r的核苷酸序列如seq?id?no.6所示：

27、5’-cgtgagctcggtaccggatccccactgttctccaaatacctgca-3’。

28、seq?id?no.7的核苷酸序列中5’端含有xbai酶切位點，3’端含有bamhi酶切位點，其核苷酸序列如下所示：

29、tctagaggattgggactatgagagctttgttgatgtctcaaagagagttatgatgggtaggaacaggacccagcaacaggttgttgttagggaggtccttctttctatgcttccccctggtgctcctgctcagtttaggaaattgtttccaccaacaaaatgggcagctgaattcaatgctgcattgacagtgcctttcttccattggcttgttggtccctctgaggttgtggaagttgaggtgaatggtgtaaagcaaaagagtggagtgcatataaaaaaatgcaggtatttggagaacagtggggatcc。

30、（2） dad27基因vigs沉默植株的構建

31、將步驟（1）中的重組載體ptrv2-dad27、煙草脆裂病毒ptrv2載體以及煙草脆裂病毒ptrv1載體分別轉化到農桿菌gv3101感受態(tài)細胞，pcr鑒定陽性，分別獲得含重組載體、煙草脆裂病毒ptrv2載體、煙草脆裂病毒ptrv1載體的菌液。

32、（3）將步驟（2）中的含重組載體、煙草脆裂病毒ptrv2載體、煙草脆裂病毒ptrv1載體的菌液在含kan?50mg/l，dif?25mg/l的lb液體培養(yǎng)基中，28℃搖床200rpm，振蕩培養(yǎng)od600至1.0，室溫離心后棄上清，收集菌體，用等體積ms侵染液重懸菌體，吸打混勻后分別將重組載體ptrv2-dad27和煙草脆裂病毒ptrv2載體與煙草脆裂病毒ptrv1載體等體積混合，黑暗靜置4h；將所述ms侵染液分別注射到參薯葉片背面，實現(xiàn)對目標基因 dad27基因的沉默及對照植株的構建，其中重組載體ptrv2-dad27與煙草脆裂病毒ptrv1載體混合ms侵染液注射植株為目標基因 dad27沉默植株，煙草脆裂病毒ptrv2載體與煙草脆裂病毒ptrv1載體混合侵染液注射植株為對照植株。通過實時定量pcr方法，采用引物trv_d27_f和trv_d27_r檢測各vigs植株中 dad27基因的表達量。

33、其中，ms侵染液的配方組成為：ms培養(yǎng)基＋10mm/l?mes+200μm/l?as+10mm/lmgcl2，ph=5.6。其中，mes的中文名稱為2-嗎啉乙磺酸；as的中文名稱為乙酰丁香酮。

34、優(yōu)選地，所述植物為參薯。

35、本發(fā)明提供了 dad27基因沉默參薯材料在調控參薯抗炭疽病中的應用。在正常生長條件下，降低目的植物中 dad27基因的表達量，能夠增加參薯葉片中的脫落酸含量，使葉片氣孔關閉，明顯增強參薯植物的炭疽病抗性。本發(fā)明對于探討脫落酸負調控基因 dad27基因與炭疽病抗性的分子機理的研究具有指導意義。

36、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

37、本發(fā)明提供了 dad27基因在調控參薯抗炭疽病中的應用。本發(fā)明提供了一種負調控aba合成基因 dad27基因的獲得，以及其相關材料在炭疽病抗性中的功能驗證，本發(fā)明在提高植物抗炭疽病方面具有潛在的應用前景。本發(fā)明提供了該基因在調控參薯抗炭疽病中的應用，開發(fā)了一種負調控脫落酸的獨腳金內酯合成關鍵酶基因參與其他方面的新應用。